专利名称：香蕉组织培养的暗培养方法香蕉(Musa balbisiana Colla)是我国南方的重要热带水果之一，同时也是许多地区的重要经济收入来源，并且许多农户依靠种植香蕉脱贫致富。大多数的栽培食用香蕉都是单性三倍体AAA，具有高度的不育特性，主要靠无性繁殖，生产上通常利用吸芽进行繁殖，种苗不足时，也可采用香蕉的地下茎切块来繁殖种苗，但是该方法长期使用会累积许多病毒，如束顶病、花叶病等。造成严重的危害。另外，不良的香蕉种苗会导致生长不良，果品不佳，收获不统一等问题。香蕉组织培养技术能够在短时间内快速繁殖出大量规格统一的优质的无病虫害的健康种苗，并且，新品种的培育和引进也需要利用脱病毒和组培快繁 技术加快名优品种的发展。香蕉组培技术是我国农业科研工作者在20世纪80年代后期研发推广，该技术的应用对我国香蕉产业的迅速发展起到了重大的推进作用，也使得种苗工厂化生产得以实现，在短时间内将优良品种大面积推广，达到大规模商品化香蕉生产。但是该产业经过20多年的应用，我们发现该技术存在不足，在生产应用中主要问题是 I.生产培养单周期时间长，香蕉组培生产中一般单周期培养(即接种到新培养基到培养)时间为30天以上。2.生产耗电量大，由于培养过程中，需补充光照，补光为时间IOh/天,光照强度1500 20001x。3.补光产生的能耗高，由于补充光照通常采用40W的日光灯，在工作时会产生大量的热量，为了降低培养室的培养温度，就必须空调降温，由此每年夏季就会产生一笔不小的电费，给企业增加了营运成本，非常不利于工厂化生产。4.由于生产周期长，导致生产场地周转慢，占用大量培养架，从而导致厂房面积增加。5.采用人工光照培养，为了满足每个培养瓶生长所需的光照，则培养层架通常只能摆放继代材料108瓶，占用空间大，采用本发明的暗培养方法，每层培养架可摆放200^220瓶，有效利用了空间。人工光照培养等量的组培苗占地多，也是厂房面积增加的一个重要原因。以上缺点是传统组培生产中普遍存在的问题，在中国南方的热带及亚热带地区，香蕉组培苗已经成为大宗种苗品种，每年都有超过上亿株的市场需求，但是由于生产成本在逐年的递增(人工费用，电费，场地租金等)极大的阻了种苗工厂化产业的发展，因此开发一种新的组培技术以克服原有培养方式的缺点，确保香蕉种苗产业的进一步发展已经势在必行。而本发明香蕉组织培养过程中采用暗培养方法则可以有效弥补光培养方式中的许多不足，为香蕉种苗产业的稳步发展提供技术支持。香蕉组织培养中的暗培养方法具有的优势有以下4点I.生产周期缩短，香蕉组织培养如采用光培养的方式，由于光线有一定的抑制作用，从本次接种到下次接种一般单周期培养时间为20至25天，改用了暗培养的方式，则培养时间可以缩短至15 18天。2.离体组织及试管苗适宜在一种 特定的温度下生长和发育。如一段适宜的温度为(25±2) °C。当室温不符合这种温度时，则应启动空调器，根据要求调节温度，直到符合要求。传统的光培养式组织培养一般使光照强度达到1500 20001x，要达到该光照强度的话，每层培养架则需分别装两支日光灯，供光照用。由此会产生一笔巨大的照明电力费用。如一个15 Hl2的培养室越可容下15个长130cm宽35cm的五层培养架。按每层两支40W日光灯计算，则每个培养室补光的日耗电量为 ff=40 X 2 X 5 X 15 X 10=60kw/h 那么年耗电量为365X60=21900kw/h 一家年产3500 4000万株组培苗的植物组培工厂因为补光所产生的电力费用则可高达547500度/年。由于本发明改用了暗培养技术，每年在光照方面可节省的费用是相当可观的，对于企业在市场的竞争中提供了极大的优势。3.进入夏季后，利用光培养技术补光照明灯管散发出来的热量较大，使得培养室温度远远超越了香蕉作物组织能够忍耐的极限温度33°C以上要达到理想的培养温度28 30°C，必然需要利用空调机降温。以15 20 m2—台空调机(功率750w/h)计算，年降温电量约为600度(按6个月/年计)，年生产4000万株的生产规模降温电量为15000度。改进培养模式暗培养后，则其降温费用可大幅度下降，减少生产成本。4.随着场地费用成本的逐年提高，原来继代单周期为25天的生产模式表现出了周转缓慢，占用大量培养室，单位面积的产出的下降，增加了运营的成本。暗培养的方式将单周期时间缩短成15天后，该问题就可大幅减缓。5.培养架的单位培养密度的增加，提高了单位面积的产出量。
本发明的目的为了解决现有技术中存在的不足，而提供一种香蕉组织培养的暗培养方法， 在组织培养诱导脱分化和生根分化过程中采用暗培养方法，避免了传统人工光照培养，既缩短了培养周期，也降低了生产能耗，保证组培苗质量的同时为组培苗繁殖培育降低了生产成本。本发明的技术方案如下 香蕉组织培养中的暗培养方法，它包括如下步骤
(1)外植体的选取及处理；
(2)诱导脱分化组织暗培养；
(3)生根分化暗培养；
(4)生根驯化和移栽；
所述外植体的选取是选取早春与秋季(特别是干旱季节)长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；外植体的处理方法将吸芽清洗干净，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径O为5 10cm，将干茎置超净工作台上，用75 80%酒精浸泡3(T35s消毒，再用0. I 0. 2%HgCl溶液浸泡l(Tl5min灭菌后，用无菌水冲洗3 4次，备用。吸芽为植物根际或地上茎叶腋间自然发生的短缩、肥厚呈莲座状的短枝。吸芽下部可自然生根，故可自母株分离而另行栽植培育成新植株。所述诱导脱分化组织暗培养是将步骤(I)消毒好的外植体香蕉干茎接种到盛装诱导培养基的培养瓶中，然后置于28 30°C下进行暗光培养25 30天，产生丛芽组织 ’然后将得到的丛芽组织切割进行继代培养，继代培养也采用诱导培养基进行暗光培养，培养温度为28 30°C，继代培养周期为15 18天，繁殖系数为3 4，继代培养得到所需数量的香蕉丛芽组织；所述诱导培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为6-苄氨基腺嘌呤I 3mg/L, NAA生长素0. 2 lmg/L, Su白砂糖2% 5%, Agar琼脂2 5g, pH为5. 8 6. O。这种从芽组织具备很好的继代及生根分化的能力。 对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。也是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。繁殖系数(propagationcoefficient)是指在一次继代培养中由一个苗(芽或芽丛)得到新苗的个数。所述生根分化暗培养将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到盛装有生根培养基的培养瓶中，在28 30°C下进行暗光培养10 15天，诱导培养出根系后，再将长出根系的香蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富；所述生根培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为NAA生长素0. 05 0. 15mg/L，Su白砂糖25 27g/L，Agar琼脂2 5g，pH为5. 8 6. O。炼苗是在保护育苗的情况下，采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程，使其定植后能够迅速适应露地的不良环境条件，缩短缓苗时间，增强对低温、大风等的抵抗能力。所述暗光培养是指将在植物组织培养室中，将培养瓶排列放置在培养层架上，培养瓶直径为05飞cm，培养瓶间距< I cm，通过入射到普通培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。所述培养层架为4 6层，每层培养架(130*35cm)可放置200 220瓶培养瓶。由于培养瓶紧密排列放置在培养架上，培养瓶之间摆放距离小，白天自然光照射到培养瓶上时，由于培养瓶之间的相互遮挡及透明培养瓶之间的漫反射作用，因此培养瓶处于暗光或是弱光状态。晚上由于自然光线非常弱小，各培养瓶也处于暗光状态。本发明的就是在这种状态下进行组织培养，不需要像传统的暗培养那样进行遮光，也无需进行额外的人工补光，，而传统的组培是需要进行人工补光的。传统的香蕉组织培养早期可不照光，但芽萌发后，每天需要光照12h左右，光照强度为2000 30001X，能耗大.；继代培养时茎尖丛芽团每40天才可分割转接I次，培养周期长。本发明所述的植物组织培养实验室是无阳光直射的。所述生根驯化和移栽是指经过步骤(3 )自然光炼苗后的香蕉苗，洗净根部培养基，移植到营养杯中，在大棚中育苗5(T60天，再移植到大田中定植即可得到香蕉种苗。本发明的培养方法也适用到粉蕉或其它品种的香蕉的组织培养中。本发明的优点
I.采用本发明的方法，在组织培养的脱分化培养阶段及分化生根的阶段进行暗培养，组织处于弱光或暗光的状态下生长，使得脱分化细胞分裂的速度加快，避免了人光补光过程中光照的抑制作用，使得培养周期缩短，提高生产效率。2.采用暗培养方式，使得出苗整齐健壮，生长速度快，变异率低，生根分化快，相对光培养技术有较大的优势。采用本发明的培养方法一年生产香蕉苗可达到4000万株。3.米用本发明的暗培养方法可以大幅度降低光培养生产中所产生的电能消耗,有 效降低生产成本，提高市场竞争力。4.采用本发明的暗培养方法，增加培养架的单位培养密度，可以节省培育场地，大大提高生产场地的利用率。5.提高了生产效率，降低劳动强度。本发明采用的暗培养方法，使得组培在脱分化培养阶段及分化生根的阶段靠自然光进行生长，因此不需要控制其光照的强度，不需要人工调节光照的强度，降低了劳动力，有利于提高生产效率。

香蕉组织培养中的暗培养方法，它包括如下步骤
(I)外植体的选取及处理
选取香蕉品种桂蕉6号早春干旱季节长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；然后将吸芽用自来水清洗干净，再用市售洗涤液清洗2 3次，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径O为5 10cm，将干茎置超净工作台上，用75%酒精浸泡30s，再用0. l%HgCl溶液浸泡10 min，摇动充分灭菌，倒掉消毒药液。再用无菌水冲洗3 4次，备用。(2)诱导脱分化组织暗培养
将步骤(I)消毒好的香蕉干茎接种到盛装有诱导培养基的培养瓶中，诱导培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA ) I 3mg/L，NAA生长素0. 2 lmg/L, Su白砂糖2% 5%, Agar琼脂2 5g,pH为5. 8 6. O。然后置于28 30°C下进行暗光培养25 30天，产生丛芽组织；然后将得到的每条丛芽组织切割成3分进行继代培养，继代培养也采用诱导培养基进行暗光培养，培养温度为28 30°C，继代培养周期为15 18天，繁殖系数为3 4，继代培养得到所需数量的香蕉丛芽组织。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为5层,每层培养架(130*35cm)可放置216个培养瓶；培养瓶直径为①6cm，培养瓶间距0cm，通过入射到普通培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(3)生根分化暗培养
将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到装有生根培养基的培养瓶中，生根培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为NAA生长素0. 05、. 15mg/L，Su白砂糖25 27g/L，Agar琼脂2 5g，pH为5. 8 6. O。在28 30°C下进行暗光培养10 15天，诱导培养出根系后，再将长出根系的香蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为5层,每层培养架(130*35cm)可放置216个培养瓶；培养瓶直径为06cm，培养瓶间距0 cm，通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(4)生根驯化和移栽
经过步骤(3)自然光炼苗后的香蕉苗，洗净根部培养基，移植到营养杯中，在大棚中育苗5(T60天，再移植到大田中定植即可得到优质的香蕉种苗。
实施例2
(I)外植体的选取及处理
选取香蕉品种桂蕉6号秋季干旱季节长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；然后将吸芽用自来水清洗干净，再用市售洗涤液清洗2 3次，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径O为8 10cm，将干茎置超净工作台上，用75%酒精浸泡35s，再用0. l%HgCl溶液浸泡15 min，摇动充分灭菌，倒掉消毒药液。再用无菌水冲洗3 4次，备用。(2)诱导脱分化组织暗培养
将步骤(I)消毒好的香蕉干茎接种到盛装有诱导培养基的培养瓶中，诱导培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA ) 3mg/L, NAA生长素0. 5mg/L, Su白砂糖5%，Agar琼脂2g，pH为5. 8 6. O。然后置于28 30°C下进行暗光培养25天，产生丛芽组织；然后将得到的每条丛芽组织切割成4份进行继代培养，继代培养也采用诱导培养基进行暗光培养，培养温度为28 30°C，继代培养周期为15天，繁殖系数为3 4，继代培养得到所需数量的香蕉丛芽组织。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为4层,每层培养架(130*35cm)可放置200个培养瓶；培养瓶直径为①5cm，培养瓶间距1cm，通过入射到普通培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(3)生根分化暗培养
将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到装有生根培养基的培养瓶中，生根培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为NAA生长素0. lmg/L，Su白砂糖25g/L，Agar琼脂2g,pH为5. 8 6. O。在28 30°C下进行暗光培养15天，诱导培养出根系后，再将长出根系的香蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为4层,每层培养架(130*35cm)可放置200个培养瓶；培养瓶直径为①5cm，培养瓶间距1cm，通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(4)生根驯化和移栽
经过步骤(3)自然光炼苗后的香蕉苗，洗净根部培养基，移植到营养杯中，在大棚中育苗5(T60天，再移植到大田中定植即可得到优质的香蕉种苗。
实施例3
(I)外植体的选取及处理
选取香蕉品种桂蕉6号早春干旱季节长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；然后将吸芽用自来水清洗干净，再用市售洗涤液清洗2 3次，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径巾为5 8cm，将干茎置超净工作台上，用75%酒精浸泡30s，再用0. l%HgCl溶液浸泡10 min，摇动充分灭菌，倒掉消毒药液。再用无菌水冲洗3 4次，备用。 (2)诱导脱分化组织暗培养
将步骤(I)消毒好的香蕉干茎接种到盛装有诱导培养基的培养瓶中，诱导培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA ) 2mg/L, NAA生长素0. 6mg/L, Su白砂糖3%，Agar琼脂5g，pH为5. 8 6. O。然后置于28 30°C下进行暗光培养28天，产生丛芽组织；然后将得到的每条丛芽组织切割成4份进行继代培养，继代培养也采用诱导培养基进行暗光培养，培养温度为28 30°C，继代培养周期为18天，繁殖系数为3 4，继代培养得到所需数量的香蕉丛芽组织。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为6层,每层培养架(130*35cm)可放置210个培养瓶；培养瓶直径为①6cm，培养瓶间距0cm，通过入射到普通培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(3)生根分化暗培养
将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到装有生根培养基的培养瓶中，生根培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为NAA生长素0. lmg/L，Su白砂糖25g/L，Agar琼脂5g，pH为5. 8 6. O。在28 30°C下进行暗光培养12天，诱导培养出根系后，再将长出根系的香蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为6层,每层培养架(130*35cm)可放置210个培养瓶；培养瓶直径为①6cm，培养瓶间距0cm，通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(4)生根驯化和移栽
经过步骤(3)自然光炼苗后的香蕉苗，洗净根部培养基，移植到营养杯中，在大棚中育苗5(T60天，再移植到大田中定植即可得到优质的香蕉种苗。实施例4
粉蕉组织培养中的暗培养方法，它包括如下步骤
(I)外植体的选取及处理
选取粉蕉品种金粉I号早春干旱季节长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；然后将吸芽用自来水清洗干净，再用市售普通洗涤液清洗2 3次，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径O为5 10cm，将干茎置超净工作台上，用75%酒精浸泡30s，再用0. l%HgCl溶液浸泡10 min,摇动充分灭菌，倒掉消毒药液。再用无菌水冲洗3 4次，备用。(2)诱导脱分化组织暗培养；
将步骤(I)消毒好的香蕉干茎接种到盛装有诱导培养基的培养瓶中，诱导培养基以MS为基础培养基，6-BA6-苄氨基腺嘌呤I 3mg/L，NAA生长素0. 2 lmg/L，Su白砂糖2% 5%, Agar琼脂2g 5g，pH为5. 8 6. 0 ;置于28 30°C下进行暗光培养25 30天，产生丛芽组织；然后进行继代培养，继代培养周期为15 18天，繁殖系数为3 4，继代培养得到实际生产所需数量的粉蕉丛芽组织。培养瓶排列放置在培养层架上，培养瓶直径为06011,培养瓶间距< I cm,通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。每层培养架(130*35cm)可放置200 220瓶
(3)生根分化暗培养
将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到盛装生根培养基的培养瓶中，生根培养基以MS为基础培养基，NAA生长素0. 05 0. 15mg/L，Su白砂糖25 27g/L，Agar琼脂2g 5g，pH为5. 8 6. 0 ;经过10 15天的暗光培养，培养温度28 30°C，诱导培养出根系后，再将香 蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富。培养瓶排列放置在培养层架上，培养瓶直径为06011,培养瓶间距< I cm,通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。每层培养架(130*35cm)可放置200 220 瓶。(4)生根驯化和移栽
经过步骤(3)自然光炼苗后的粉蕉苗，洗净根部培养基，移植到营养杯中，在大棚中育苗5(T60天，再移植到大田中定植即可得到优质的粉蕉种苗。实施例5
(I)外植体的选取及处理
选取香蕉品种桂蕉6号早春干旱季节长势旺盛的无病毒香蕉植株的吸芽；然后将吸芽用自来水清洗干净，再用市售洗涤液清洗2 3次，逐步剥去外层苞片，切除多余茎部部分，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎，控制干茎直径O为6 9cm，将干茎置超净工作台上，用80%酒精浸泡30s，再用0. 2%HgCl溶液浸泡10 min，摇动充分灭菌，倒掉消毒药液。再用无菌水冲洗3 4次，备用。(2)诱导脱分化组织暗培养
将步骤(I)消毒好的香蕉干茎接种到盛装有诱导培养基的培养瓶中，诱导培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA ) lmg/L, NAA生长素I. Omg/L, Su白砂糖2%，Agar琼脂3g，pH为5. 8 6. O。然后置于28 30°C下进行暗光培养25天，产生丛芽组织；然后将得到的每条丛芽组织切割成3份进行继代培养，继代培养也采用诱导培养基进行暗光培养，培养温度为28 30°C，继代培养周期为15天，繁殖系数为3 4，继代培养得到所需数量的香蕉丛芽组织。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为5层,每层培养架(130*35cm)可放置220个培养瓶；培养瓶直径为①6cm，培养瓶间距Ocm，通过入射到普通培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。(3)生根分化暗培养
将经继代培养得到的香蕉丛芽组织接种到装有生根培养基的培养瓶中，生根培养基以MS为基础培养基，其他各组分含量为NAA生长素0. 15mg/L，Su白砂糖27g/L，Agar琼脂3g，pH为5. 8 6. O。在28 30°C下进行暗光培养10天，诱导培养出根系后，再将长出根系的香蕉苗转移到日光大棚进行自然光照炼苗；自然光照炼苗20天后，香蕉苗的茎杆粗壮健康，叶片由嫩黄色转青绿色，根系发达，根毛丰富。在植物组织培养实验室中，培养瓶排列放置在培养层架上，培养层架为5层,每层培养架(130*35cm)可放置220个培养瓶；培养瓶直径为①6cm，培养瓶间距0c m，通过透入培养室的自然光进行培养，各培养瓶处于暗光培养状态。


本发明公开了香蕉组织培养中的暗培养方法，它包括如下步骤(1)外植体的选取及处理；(2)诱导脱分化组织暗培养；(3)生根分化暗培养；(4)生根驯化和移栽；本发明在诱导脱分化组织暗培养和生根分化暗培养过程中采用暗光或弱光培养，替代了传统香蕉组织培养中加光(1500~2500lx)进行继代增殖培养，壮苗、生根初期培养。提高了香蕉组培的增殖倍数，缩短单周期培养的时间，且采用暗培养方式可避免传统的光培养中由于日光灯补光时产生的电耗及抵消补光产生的热量，减少降温所需费用。因此采用本发明的方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展。