专利名称：用于保护眼球的内部结构抵抗紫外线或用于用跨上皮交联技术治疗圆锥角膜的眼用溶液的制作方法书籍[18]提供了用于施用和吸收眼用溶液的问题和技术的综述。角膜与核黄素(维生素B2)交联(C3)，简称为核黄素-C3 (ribof iavin-C3)，是一种创新技术，用于治疗受圆锥角膜(keratoconus)和角膜扩张(corneal ectasia)影响的病人，主要施用核黄素和紫外线照射(ultra-violet irradiation, UV-A)用于加强角膜组织[1][2]。交联治疗是相对简单的核黄素滴注在眼睛中，角膜用合适剂量的紫外线照射5 分钟；然后该程序接连重复6次用于总共暴露于紫外线30分钟。用于建立交联治疗合适性应该考虑的最重要的临床参数是角膜厚度，必须不小于 400微米。该圆锥角膜的保守治疗的目的是延迟或希望消除角膜移植的需要，并通过提高他们的生活质量而改善患者的视觉功能[6] [7]。交联技术已经使用用于治疗圆锥角膜，其病理学特点是因为其组成的胶原蛋白层的粘连减小而导致角膜实质(corneal parenchyma)异常松弛，从而角膜逐渐弱化。通过使用紫外线和核黄素，在相邻的角膜胶原蛋白分子之间的新的连接形成，治疗的角膜变厚和变硬[3]。角膜在实质的厚度中有许多层胶原蛋白纤维；横向连接，所谓的“交联”将胶原蛋白的多层之间连接，以决定性方式促进角膜硬度。角膜交联治疗的目的是通过这些横向连接的更大数目的产生增加角膜组织的刚性程度。核黄素在无上皮角膜上的约200 μ m的渗透的局部滴旋以及紫外线照射核黄素决定核黄素分子的化学平衡的丧失和随之而来的自由基的产生。核黄素分子变得不稳定，通过连接两个胶原纤维将它们自身稳定。在胶原纤维之间形成一系列生化“桥梁”(即交联) 以产生角膜的普遍加强[3]。实际上，在已经去除角膜的最外层(即角膜上皮)后进行治疗。进行圆锥角膜和角膜扩张的交联治疗(C3-R)的这种方式认为预先去除角膜上皮用于有助于0. 核黄素-葡聚糖的标准溶液(例如由商标RICR0LIN 下的S00FT ITALIA S. r. 1.销售的溶液)在底层的基质中的渗透，治疗已经在这些条件下标准化。根据该技术的支持者，上皮层的去除将是必需的，用于确保核黄素溶液在角膜基质内最好可能的吸收，以及因此的治疗的最大效果。不幸的是，角膜上皮的去除在治疗后第二天以及立即连续几天可能导致眼痒或烧伤，以及瞬时模糊；这些症状是众所周知的，并在C3-R后连续几天W-7]中持续直至角膜上皮尚未得到恢复并经受通常的治疗，采用非类固醇消炎(non-steroidal anti-inflammatory,NSAID)滴眼液、基于泪液替代品和止痛剂的滴眼液以及在角膜上使用治疗性隐形眼镜。几位作者支持通过采用标准方法而不预先去除角膜上皮进行C3-R治疗可能是可能的，且如由观察到的临床资料所证明的，这样的治疗将是有效的和安全的。根据这项技术，应该进行治疗而无需预先去除角膜上皮(dis印ithelization)。目的是避免病人经受由于第一种方法固有的上皮去除导致的疾病，进行门诊治疗，特别是避免在考虑上皮去除随后暴露角膜底层的治疗中固有的手术后感染的任何风险。进行这种治疗方式的支持者建议在眼睛上以更长的时间间隔使用核黄素以在用紫外线照射前允许核黄素在基质中更好的吸收[8]。总的说来，在圆锥角膜及角膜扩张的交联治疗中就上皮去除或不去除而言，在文献中报道了相反的意见。已经研究和实施在去除角膜上皮以有助于核黄素在基质中的渗透后进行C3-R治疗。据作者所知，文献中还没有研究可以获得用于确定通过去除或不去除角膜上皮是否以及多少核黄素在角膜基质中渗透[9]。不预先去除上皮进行交联已经被众多作者所批评，他们支持采用这种方式核黄素将不会通过上皮，仍然没有证明不去除上皮是否以及多少0. 核黄素葡聚糖标准溶液在角膜基质中有效渗透，以及以跨上皮方式进行紫外线治疗是否导致与在去除角膜上皮后进行紫外线治疗同等有效。在试图提供有效物质用于用交联技术治疗圆锥角膜而无需去除角膜上皮中， Sp δ rl博士建议[17]使用苯扎氯铵用于增加上皮的渗透性，Pinelli博士建议使用与核黄素混合的表面活性剂(tensioactives)。意大利专利申请MI2007A002162[16]披露了一种用于用跨上皮交联技术治疗圆锥角膜的新型溶液，含有核黄素和苯扎氯铵。由申请人在人角膜上进行的实验，其结果在下文进行说明，得出结论采用标准溶液或Pinelli博士 [16]建议的组合物进行的第二种技术将不能克服由于去除角膜上皮导致的问题，因为它会被毁坏，将底层暴露于随之而来的感染风险和修复机制的改变。具有一种用于进行角膜交联的含有核黄素的组合物，能够在相对短的时间内通过角膜上皮并且不损伤角膜上皮，那是恼人的手术后的症状的原因，将是期望的。
申请人:进行了深入研究，旨在确定预先去除和不去除角膜上皮，多少核黄素单独或与其它产品(“渗透增强剂”，“permeation enhancers")混合渗透通过人角膜，以及随后用紫外线治疗的有效性和安全性。已经确定了一些有用的物质，选自由必需和条件必需(如精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)氨基酸、辅酶Q、维生素E、L-脯氨酸、甘氨酸、 赖氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-精氨酸以及用于刺激金属蛋白酶MMP9产生的化合物组成的组，在下文更精确地确定，在眼用溶液中可以有效地用作载体(“渗透增强剂”)，适用于施用核黄素，特别是核黄素-葡聚糖标准溶液，通过角膜上皮。由此得到的眼用溶液，可以以例如眼药水或凝胶或水溶液或乳液或使用在治疗性隐形眼镜上的形式进行销售，可用于用跨上皮交联技术治疗圆锥角膜，从而保留角膜上皮。滴眼液可以最终包含辅料，如醋酸，或上述物质可以在与核黄素混合前用醋酸或用另一种辅料处理。本发明进一步提出选自由必需和条件必需氨基酸、辅酶Q、维生素E、L_脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-精氨酸以及用于刺激金属蛋白酶MMP9产生的化合物组成的组中的至少一种化合物的应用，在下文更精确地确定，，用于制备一种含有核黄素的眼用溶液，用于保护眼球的内部结构抵抗紫外线或用于用跨上皮交联技术以及一种相关的含有核黄素的眼用溶液治疗圆锥角膜，以及在组合物中作为载体(“渗透增强剂”)适于施用核黄素通过角膜上皮。本发明还提出了一种制备这样一种眼用溶液的方法，主要包括将至少一种上述确定的载体加入核黄素溶液。作为载体的建议的物质的每一个可以单独或与其它建议的载体联合加入含有核黄素的浓度选自在随后描述的示例性的具体实施例中指出的范围的溶液中。本发明在所附的权利要求中进行限定。图1显示了用于评估以跨上皮方式应用后0. 核黄素溶液通过角膜的视觉、荧光法、比色法评价量表。图加是在其上第四试验组合物已经以跨上皮方式使用15分钟后的角膜的一部分的荧光镜检照片。图2b是在其上第四试验组合物已经以跨上皮方式使用30分钟后的角膜的一部分的荧光镜检照片。图2c是使用第四新型溶液采用跨上皮交联治疗的角膜的一部分的荧光镜检图像，其中因为治疗后第四组合物的通过和组织的相对刚性，可注意到强荧光。图3a显示使用标准溶液采用跨上皮交联治疗的角膜的偏转角度。图北显示使用第四新型测试溶液采用跨上皮交联治疗的角膜的偏转角度。图4是显示圆锥角膜影响的角膜的一部分中薄层的扫描显微镜图像。图5是显示图4所示的角膜的放大视角的扫描显微镜图像。图6是显示使用第四新型测试组合物进行跨上皮交联后圆锥角膜影响的角膜的一部分中薄层的扫描显微镜图像。图7是显示正常角膜中上皮的微绒毛和表层的形态的扫描显微镜图像。图8是显示以跨上皮方式使用0. 核黄素-葡聚糖的标准溶液后使用标准剂量的紫外线治疗的角膜的扫描显微镜图像。图9是显示以跨上皮方式使用第四新型测试组合物后使用标准剂量的紫外线治疗的角膜的扫描显微镜图像。图10是显示以跨上皮方式使用生理溶液后使用标准剂量的紫外线治疗的角膜的扫描显微镜图像。
因为无法用于移植而从眼库丢弃的考虑用于测试的角膜一直保存到适当的溶液中，并在测试前，通过光学显微镜和内皮细胞检查的手段对它们再次进行评估。根据在[10-15]中建议的，已经使用只有具有良好的透明度的角膜，具有500至 600微米之间的厚度，具有良好的内皮镶嵌。角膜已经这样放置以关闭0. 4毫升含有透明质酸钠加黄原胶的预制溶液的圆柱形腔。具有与圆柱箱相同直径的防水密封金属环使用在角膜表面。然后含有荧光物质(核黄素)的要测试的组合物使用在角膜上。通过在不同的瞬间测量箱内溶液的荧光，确定新型溶液在角膜中以多少量渗透以及新型溶液为此需要花费多长时间是可能的。指出的物质作为用于以跨上皮方式施用核黄素的组合物中载体的有效性，以及通过混合核黄素和至少一个指出的物质的组合物的有效性通过下面的测试例子进行描述，只为说明而非限制性的目的。为了简便起见，只报道用下列组合物治疗角膜获得的测试结果1)0. 核黄素-葡聚糖的标准溶液；2)0. 核黄素-葡聚糖和根据[16]的0. 01 %苯扎氯铵的标准溶液；3)0. 核黄素-葡聚糖+500毫克％毫升浓度的维生素E TPGS (D-α -生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸(D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol lOOOsuccinate))的第一新型测试组合物；4)0. 核黄素-葡聚糖+100毫克％毫升维生素Q的第二新型测试组合物；5)0. 1%核黄素-葡聚糖+0. 1毫克％ L-脯氨酸+0. 1毫克％甘氨酸+0. 05毫克％ 赖氨酸盐酸盐+0. 08毫克％ L-亮氨酸的第三新型测试组合物；6)0. 核黄素-葡聚糖+500毫克％毫升维生素E (D-α-生育酚聚乙二醇1000 琥珀酸)+100毫克％毫升维生素Q+0. 1毫克％ L-脯氨酸+0. 1毫克％甘氨酸+0. 05毫克％ 赖氨酸盐酸盐+0. 08毫克％ L-亮氨酸的第四新型测试组合物；六个提到的组合物的每一个以及施用在如上描述那样选择和放置的角膜的表面上，角膜基质的浸泡在15分钟后和30分钟后与在置于治疗的角膜下的容器中的0. 4ml透明质酸钠+黄原胶的溶液中的荧光物质的存在一起评估。核黄素在角膜基质中的渗透的评估已经通过切片角膜并用荧光显微镜进行随后评估来进行。0. 4ml透明质酸钠+黄原胶的溶液中的核黄素的存在，证明通过角膜，已经通过使用描述在图1中的视觉和荧光镜检量表进行定性评估和使用比色法量表进行定量评估。 每一种颜色样本附近的两个数字分别代表导致所显示的颜色的核黄素的标准溶液的部分的数目以及黄原胶和透明质酸钠溶液的部分的数目。对照量表已经通过制备0. 核黄素-葡聚糖和黄原胶+透明质酸钠以下列比例(单位/ml)的稀释液进行确定50/0，40/10， 30/20,20/30,10/40，0/50。已经准备对应单位/ml的确定值的视觉量表和比色法量表，已经为每种稀释比例分配从10下降到0的分数。比色法量表考虑等于20%无核黄素的黄色的百分比的最小值，对应选择作为稀释剂的物质的比色谱。视觉量表的评估已经在标准光照条件下通过将测试获得的样品与预定样品直接比较和数码摄影技术进行。荧光法评估已经通过在暗室中使用配备数字照相机的荧光扫描显微镜来进行。关于视觉和荧光法量表的评估的分数已经通过第三检测方，通过计算用两种方法获得的值的平均值进行。比色法评估已经通过在实验结束时将在圆柱形腔(因此位于角膜下)中存在的材料插入至透明袋中并通过在高清晰度下扫描预定的稀释液和使用软件程序WiotOShOpTM7.0 及单色过滤器评估黄色百分比的计算机分析来进行。采用这种技术，比较在具有以标准 0. 核黄素溶液的单位/ml表示的精确确定的浓度值的实验样品中检测的黄色百分比， 是可能的。图加是使用第四新型试验溶液15分钟后采用跨上皮交联治疗的角膜的一部分的荧光镜检图像，图2b是使用第四新型试验溶液30分钟后采用跨上皮交联治疗的角膜的一部分的荧光镜检图像，图2c是使用第四新型溶液采用跨上皮交联治疗的角膜的一部分的荧光镜检图像。在这最后的图片中，注意到交联治疗后核黄素已经渗透在整个角膜中且组织更硬，是可能的。进行的测试表明a)以跨上皮方式使用0. 核黄素-葡聚糖标准溶液15分钟后，角膜基质部分浸泡，在容器中的物质中荧光溶液是无法检测的，比色法范围与0. 4毫升透明质酸钠+黄原胶溶液是可重合的(图1中所示为分数0，黄色百分比不大于20% )。b)以跨上皮方式使用0. 核黄素-葡聚糖标准溶液30分钟后，角膜基质显示完全浸泡在荧光溶液中，在容器中0. 4毫升透明质酸钠+黄原胶的溶液中的荧光可以进行检测，得到图1的分数2-3，采用上述计算机进行的技术测定的黄色百分比处于75% -80%的范围。c)以跨上皮方式使用0.1%核黄素-葡聚糖+500毫克％毫升浓度的维生素E TPGS (D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸)的第一新型测试溶液15分钟后，角膜基质完全浸泡，荧光溶液存在容器中(图1的分数2-3，72% -76%的黄色百分比)。d)使用第一新型测试溶液30分钟后，所有角膜层完全浸泡，在容器中具有高浓度的核黄素，显示角膜组织至与上皮表面接触的产品本身的良好的渗透性(图1的分数3-4， 79% -84%的黄色百分比)。e)在[16]中建议的组合物和第二、第三新型测试溶液，分别含有0. 01%苯扎氯铵；100毫克％毫升维生素Q ;0. 1毫克％ L-脯氨酸，0. 1毫克％甘氨酸，0. 05毫克％赖氨酸盐酸盐和0. 08毫克％ L-亮氨酸，与单独使用标准溶液(0. 核黄素-葡聚糖)获得的相应的结果相比，在相同条件下显示核黄素无论是在数量上还是渗透速度上均具有更好地渗透(15分钟后图1的分数3-4，30分钟后分数4-6，15分钟后黄色百分比70-79%，30分钟后黄色百分比78-86% )。f)第四新型测试组合物比所有其它测试组合物给出甚至更好的结果。以荧光镜检方式检测的着色剂的不同浓度以及在上皮表面上使用产品15分钟和30分钟后容器内荧光物质的基于计算机进行的分析显著增强(15分钟后图1的分数5-6，黄色百分比88-91% ； 30分钟后分数6-7，黄色百分比大于90%)；在跨上皮使用第四新型测试溶液后获得的在角膜下放置的溶液中荧光物质的更高的浓度在15分钟后特别明显，特别如果与使用标准溶液得到的结构相比，其在相同时间间隔后在容器内放置的溶液中甚至是不可检测的。这可以解释为假设混合在一起时渗透增强剂之间存在协同效应，用于有助于核黄素通过角膜上皮。
所示的结果显示至少下列物质-维生素E
fis·
m Jv O.声H,,Hs ?
I. SiRl = CH3 或H ;R2 = CH3 或H ;R3 = CH3;只是举例，可引用维生素 E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸)；-辅酶Q
O； 丨
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。产U、 ,八、八,■ -:、产、、^I丨处于氧化形式， 等、产y-、
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I丨丨Il处于半醌类形式，
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i ]Γ丨丨处于还原形式，
Otl无论辅酶Q的异戊二烯单元的数目是多少；只是举例,可引用辅酶QlO ；-L-脯氨酸
H SO .-甘氨酸
O
. H .-赖氨酸
10


一种眼用溶液，含有核黄素和选自由必需和条件必需氨基酸、辅酶Q、L-脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-精氨酸以及用于刺激金属蛋白酶MMP9产生的化合物组成的组中的至少一种化合物，用于保护眼球的内部结构抵抗紫外线或用于用跨上皮交联技术治疗圆锥角膜。