专利名称：饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用的制作方法大肠菌群及其所产生的肠毒素能引起动物和人的食物中毒，最常见的症状是动物和人的腹泻。饲料中大肠菌群的存在，不仅直接危害到畜禽健康，严重时会引起畜禽中毒死亡，造成严重经济损失；致病性大肠杆菌主要有肠毒性大肠杆菌(产肠毒素性大肠杆菌) (Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，肠出血性大肠杆菌(ELEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)。其中ETEC是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要的致病菌之一。ETEC本身具备两个致病因素一是宿主特异性菌毛(黏附素，黏附因子， 定植因子)，通过菌体粘着于小肠的上皮细胞上，以抵抗肠道蠕动和肠内容物的冲刷作用， 从而使细菌在定居部位大量繁殖；二是肠毒素，即耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)， ST具有抗原性，LT仅有弱抗原性。肠毒性大肠杆菌致病性与其具有粘附性菌毛和产肠毒素密切相关。致仔猪腹泻肠毒素性大肠杆菌粘附性菌毛主要有K88，K99，F41和987P，目前检测肠毒性大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜法、D甘露糖抵抗雪凝试验、细胞粘附试验、基因探针技术和免疫血清学反应等，商品化的快速检测方法主要包括特异性检验的培养基、 检测试纸片等，一般是利用大肠杆菌特异性酶检测鉴定大肠杆菌，如可利用Gud酶底物有效检测大肠杆菌。法国科玛嘉CHROM agar Ecoli是目前应用最广泛的大肠杆菌显色培养基，广东环凯公司也开发出了商业化的大肠杆菌显色培养基，这种利用显色培养基检测大肠杆菌的方法虽然成本较低，但得到检测结果需Mh-48h，时间较长，且单一方法检测准确性不高，需多种方法复合使用，以提高检测的准确性，缩短检测时间。为了有效地控制饲料的产品质量，进一步加强饲料产品及饲料原料的质量监督管理，有必要制定饲料产品中大肠菌群的检测方法及相关饲料产品中大肠菌群允许量。目前， 国际标准化组织采用两种大肠菌群检测方法标准来检测食品和饲料中的大肠菌群，一是最大或然数法(Most probable number, MPN)方法(ISO 7251 ； 1993 (E))，另一为选择性培养基菌落计数法。其中应用最广泛的是MPN技术，如英国、美国等均采用此法，但此方法具有检测时间长，易出现假阳性，敏感度低等问题，国内尚未制定饲料中大肠菌群检测方法。近年来发展起来的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerasechainreaction,RT-PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前细菌快速检测的主要方法。但是，目前，国内还未见报道根据肠毒性大肠杆菌K88菌毛特异基因的STOR Green I荧光定量PCR方法。
要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(产肠毒素性大肠杆菌) (Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)K88 的快速测定引物。该方法避免了传统PCR 定量鉴定中交叉污染的问题。本发明的方法不仅具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，且没有假阳性和相互交叉反应的发生，为肠毒性大肠杆菌检测试剂盒的开发奠定基础。本发明的另一个目的是提供该引物在定性测定和定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88中的应用。技术方案本发明的目的是通过下述技术方案实现的本发明提供一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)K88的快速测定引物，其特征在于上游引物为DCf5’ -ACAGGTGAAGGTGGAATGG-3’，也如 SEQ IDNo. 1 所示，下游引物 DCr5，-TTCCTCTTTCCTCTGCGG-3，，也如 SEQ ID No. 2 所示。本发明的引物可用于定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88。其中，定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88的测定过程如下A.模板DNA的制备(1)取待测样品菌液5ml或饲料样品500-1000mg，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末；将粉末放入到2ml离心管中，然后加入IM Tris. Cl缓冲液750ul，充分混勻；(2)将离心管置于65°C水浴中1-2小时，水浴过程中温和混勻几次；取出离心管，每管加入等体积的酚-氯仿溶液600-700ul，混勻后离心，IOOOOrpm, 10分钟；( 上清液移入新的离心管中， 加入等体积的氯仿，混勻后，10000rpm，6分钟；将上清液移入另一离心管中，加入0. 6倍体积的异丙醇，轻轻混勻，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA，并用70%乙醇冲洗2次；(4) 勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul Ix TE中；加入RNA酶溶液，37°C保温1小时； (5)加入等体积的苯酚-氯仿溶液，轻轻混勻后，IOOOOrpm离心6分钟；(6)取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混勻后，IOOOOrpm离心6分钟；(7)将上清液转移至DNA吸附柱中，力口入1/10体积3M醋酸钠，混勻后，加入2倍体积预冷的无水乙醇；(8)轻轻混勻静置5min， IOOOOrpm离心30min ； (9)将DNA吸附柱置于新的收集管中，加入70%乙醇，IOOOOrpm离心 30min，重复此操作一次；(10)将DNA吸附柱置于新的收集管中，悬空加入IOOul的Ix TE 溶液，室温放置10-15min ;(11)将DNA吸附柱置于灭菌的1.5ml离心管中，IOOOOrpm离心 2min,收集所得溶液，即得到待测样品DNA模板；在4°C下保存；B. PCR 扩增反应体系25. OyL :12. 5μ L 2XPCR_mix、#lyL 10mmol/L所述的上、下游引物、 1 μ L 50ng/ μ LDNA模板、二次蒸馏水补足至25. 0 μ L ；PCR 反应条件94°C预变性 5min，94°C 30s,60°C 45s, 72°C 40s，进行；35 个循环， 72°C最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4°C下保存；C.结果及判断取5 μ LPCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测；以目的扩增片段的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在327bp处出现预期特征条带，确定该饲料样品中含有肠毒性大肠杆菌K88，相反地则不含有肠毒性大肠杆菌K88。本发明的引物也可用于定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88。其中，定量测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88的测定过程如下Α.标准及待测样品模板DNA的制备制备方法与定性测定饲料样品中肠毒性大肠杆菌Κ88的测定过程中的模板DNA的制备方法相同。B.荧光定量PCR反应体系25. 0 μ L，包括2 X SuperReal PreMix 母液 12. 5 μ L、各 20 μ mol/ L 0.5yL 所述的上、下游引物，DNA 模板 2.0yL、50XR0X Reference Dye 0· 5 μ L、补 RNase-free ddH20 M 25 μ L ；荧光定量PCR反应参数95°C预变性IOmin ；94°C变性5s，60°C退火15s，40个循环；4°C保存；每个样品重复3次；C.外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备利用分光光度计将过夜培养的肠毒性大肠杆菌K88发酵液稀释至10D，制备模板DNA，浓度为从IO7个菌的DNA/ μ L稀释至1个菌的DNA/ μ L，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数为纵坐标，得到肠毒性大肠杆菌Κ88的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；D.结果及判断以待测样品DNA和标准品的DNA为模板，用权1所述的引物，以相同的体系同时进行肠毒性大肠杆菌Κ88的菌毛特异基因的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行饲料样品中肠毒性大肠杆菌Κ88的快速定量检测。有益效果本发明以肠毒性大肠杆菌Κ88菌毛特异基因为靶基因，应用普通PCR技术和STOR GreenI荧光定量PCR技术建立快速准确地检测肠毒性大肠杆菌Κ88的方法，避免了传统 PCR定量鉴定中交叉污染的问题。本发明利用产肠毒素性大肠杆菌Κ88的DNA的梯度稀释物作为外标准品可以更准确的检测待测样品中的活菌数，可准确地定性、定量检测饲料样品中的产肠毒素性大肠杆菌Κ88，检测效率高、检测周期短。本发明所提供的引物具有特异性强，扩增效率高的特点，可用于快速定性鉴定产肠毒素性大肠杆菌Κ88，可简化产肠毒素性大肠杆菌Κ88的检测程序、提高检测效率。本发明的方法不仅具有特异性强、重复性好、 准确、快速等优点，还具有操作简便，可同时检测多个样品的优点，为肠毒性大肠杆菌检测试剂盒的开发奠定基础。图1 经本发明的肠毒性大肠杆菌Κ88的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2 以DNA为模板的实时荧光定量检测肠毒性大肠杆菌Κ88的标准曲线。图3 以DNA为模板的实时荧光定量检测模拟临床样品的扩增曲线。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

反应体系25. OyL，包括2XSuperReal I^reMix 母液 12. 5 μ L、上下游引物 DCf 和 DCr 各 0.5yL(20ymol/L)，DNA 模板 2. 0 μ L、50XROX Reference Dye 0· 5 μ L、补 RNase-free ddH20 M 25 μ L ；荧光定量PCR反应参数95°C预变性IOmin ；94°C变性5s，60°C退火15s，40个循环；4°C保存；每个样品重复3次；B.外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备利用分光光度计将过夜培养的产肠毒素性大肠杆菌K88发酵液稀释至10D，按照上述提取DNA步骤获得DNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释至IO7-I个产肠毒素性大肠杆菌K88 DNA/ μ L的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数为纵坐标得到的产肠毒素性大肠杆菌Κ88的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；C.结果及判断由图2可见，Ct值和不同梯度稀释的模板浓度的对数值呈较好的线性关系，以不同浓度的模板的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程Ct =-4. 1461gX+35. 619 (标准曲线的线性方程)(Y代表Ct值，X代表模板初始DNA浓度)，模板初始DNA的浓度与Ct值之间线性相关系数为0. 998，斜率为-4. 146，所建立的标准曲线符合Real-Time PCR定量的要求。实施例3 准确性、稳定性和重复性实验用相同浓度的样品作为模板，分别采用国家标准GB/T 4789. 38-2008中的方法和实施例2中的方法对样品进行检测，对两种方法进行比较。为了评估试验的重复性和稳定性，同批重复两次进行荧光定量反应。每组试验样品做5个梯度的反应管，模板浓度分 2Χ107、2Χ106、2Χ105、2Χ104、2Χ1(Λ^υ/μ 。结果表明，所有稀释度的变异系数较小(CV < 5% )，说明批间差异较小，本实验建立的荧光定量PCR反应体系批内重复性、稳定性较好 (表 1)。将表1中所示的Ct值代入实施例2中的标准曲线，所得结果与采用国家标准GB/ Τ4789. 38-2008中的方法基本一致，说明本专利所建立的方法准确可行，与国家标准GB/ Τ4789. 38-2008中的方法相比，该方法只需证即可全部完成，操作简便，而国家标准GB/ Τ4789. 38-2008中的方法检测样品需耗时4_5d。表

本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种饲料样品中肠毒性大肠杆菌K88的快速测定引物及其应用。本发明针对产肠毒素性大肠杆菌K88的菌毛特异基因设计一对引物，利用DNA的梯度稀释物作为外标准品，建立针对产肠毒素性大肠杆菌K88的SYBRGreen I实时定量PCR检测方法，该方法可以快速、特异地对饲料样品中的产肠毒素性大肠杆菌K88进行定量，在饲料样品中最低能检测到2×102CFU/g，操作全程仅需5h，与常规检测方法相比，本发明具有检测程序简单、检测效率高、准确性好，检测周期短等优点，为开发快速准确的肠毒性大肠杆菌检测试剂盒奠定基础。