专利名称：突变型还原酶的制作方法本发明涉及修饰的还原酶(其是具有使底物还原的能力的酶)、编码其的多核苷酸及其应用，所述还原酶可以用于还原反应，尤其是用于α-酮酸的还原反应。还原酶具有使底物还原的能力，并且近年来，其已经用于生产例如用作药物或农药的活性成分的化合物、或其中间体、并且特别是光学活性化合物或其中间体的有机合成反应。作为这样的还原酶，例如，包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列且具有使底物还原的能力的酶(野生型还原酶)是已知的(例如，参见ΕΡ1762625Α1)。 这样的还原酶，在工业上用于生产光学活性化合物或其中间体等，其需要具有下述特性在使用该酶的还原反应中反应产物的光学纯度高，该酶对底物的绝对构型具有高识别能力，并且该酶在诸如温度、pH、溶剂和压力的各种反应条件下具有高稳定性。特别地，如果还原酶具有针对温度的高稳定性(即，热稳定性)，则升高反应温度将是可能的。因此，高的热稳定性可以不仅引起反应速率升高而且减少反应过程中还原酶的失活(例如，参见Applied Microbiology Biotechnology,80,805-812(2008))。
在这样的情形中，强烈需要研发具有良好的热稳定性的还原酶以便缩短反应时间并且提闻反应效率。本发明提供还原酶，所述还原酶包含在特定的野生型还原酶的氨基酸序列中特定的氨基酸用不同的特定氨基酸置换的氨基酸序列并且具有良好的热稳定性(即，修饰的还原酶)。具体地，本发明提供下述I)至41)。I)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，或位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力；2)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶I)；3)根据上述2)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；4)根据上述2)或3)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；5)根据上述2)至4)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；6)根据上述2)至5)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；7)根据上述2)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组I :〈氨基酸突变组I> (1-1)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；(1-2)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(1-3)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(1-4)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-5)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(1-6)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(1-7)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-8)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(1-9)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-10)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-11)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(1-12)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-13)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(1-14)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和 (1-15)下述五个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(e)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；8)包含编码上述2)至7)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸I)；9)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶2)；10)根据上述9)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；11)根据上述9)或10)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；12)根据上述9)至11)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；13)根据上述11)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组2 :<氨基酸突变组2>(2-1)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2-2)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2-3)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(2-4)下述三个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2-5)下述三个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(2-6)下述三个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(2-7)下述四个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变； 14)包含编码上述11)至13)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸2)；15)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，但是既不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，也不包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶3)；16)根据上述15)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；17)根据上述15)或16)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；18)根据上述15)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组3 :<氨基酸突变组3>(3-1)下述两个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(3-2)下述两个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和
(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(3-3)下述三个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，
(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；19)包含编码上述15)至18)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸3)；20)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述任何氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶4)；21)根据上述20)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏
氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；22)根据上述20)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变是下述两个氨基酸突变(a)位置42的组氨酸变为亮氨酸的氨基酸突变，和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；23)包含编码上述20)至22)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸4)；24)酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸任何突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；并且所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶5)；25)包含编码上述24)所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸5)；26)包含上述8)，14)，19)，23)，或25)所述的多核苷酸的载体(以下在一些情形中还称为本发明的载体)；27)根据上述26)所述的载体，所述载体还包含下述多核苷酸，所述多核苷酸包含编码下述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，所述蛋白具有将氧化的β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力；28)包含上述8)，14)，19)，23)或25)所述的多核苷酸或上述26)或27)所述的载体的转化体(以下在一些情形中还称为本发明的转化体)；29)生产(R) -2-羟基_4_苯基丁酸酯的方法，所述方法包括允许上述28)所述的转化体或其处理的产物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的生产方法)；30)修饰包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括下述步骤在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中，将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，将位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，或将位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤；31)修饰包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法I);32)修饰包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，但不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法2)；33)修饰包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，但是既不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，也不包括将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法3)；34)修饰包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法4)；35)修饰包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的·缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法5)；36)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤；将所述编码SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤；将所述编码SEQ ID NO 1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79_81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤；将所述编码SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤；或将所述编码SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73_75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤；37)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法I);38)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，但不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法2)；39)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，但是既不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，也不包括将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法3)；40)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置 换为编码亮氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，和将核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法4);以及41)修饰包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法5)。根据本发明，可以提供具有良好的热稳定性的还原酶，该还原酶用于生产用作药物或农药的活性成分的化合物、其中间体等、并且特别是光学活性化合物或其中间体及其他的有机合成反应。在上述反应中使用本发明的酶，减少反应时间并且提高反应效率将变得可能。实施本发明的方式本说明书中所述的发明不限于本文所述的具体的方法、流程和试剂，认为其是可以更改的。另外，本说明书中所用的术语仅用于描述具体的实施方案，并且它们不意欲限制本发明的范围。本说明书中所用的所有的技术术语和化学数据具有与本发明所属的领域技术人员通常所理解的意思相同的意思，除非另外指明。与本说明书所述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可以用来实施或检验本发明。下文将描述优选的方法、装置和材料。以下，将更详细地描述本发明。在本申请中，例如，术语“G56C”意指包含除了具有SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56 (“56”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的甘氨酸(“G”是表示甘氨酸的单个字母)置换为半胱氨酸(“C”是表示半胱氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQID N01的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。例如，术语“V115I”用来意指包含除了具有SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置115( “115”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的缬氨酸(“V”是表示缬氨酸的单个字母)置换为异亮氨酸(“I”是表示异亮氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。例如，术语“W27R”用来意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置27 ( “27”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的色氨酸(“W”是表示色氨酸的单个字母)置换为精氨酸(“R”是表示精氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO 1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。例如，术语“H42L”用来意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42 ( “42”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的组氨酸(“H”是表示组氨酸的单个字母)置换为亮氨酸(“L”是表示亮氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO 1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。例如，术语“T25S”用来意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置25 ( “25”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的苏氨酸(“T”是表示苏氨酸的单个字母)置换为丝氨酸(“S”是表示丝氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO 1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。 本发明的酶的“使底物还原的能力”(以下还称为还原酶活性)可以通过将所述酶与作为底物的α -酮酸(其中具体的实例是乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯)和NADPH在存在水的条件下混合，然后在30°C温育该混合物，然后利用反应溶液在340nm的吸光度作为指标来定量所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量而测量。在本发明中，术语“良好的热稳定性”用来意指，例如，在50°C进行温育处理I小时后特定的还原酶残余的还原酶活性比率高于以上述相同方式处理的野生型还原酶残余的还原酶活性比率。本发明的酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，所述一个或多个氨基酸突变包括下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，或位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。本发明的酶I包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。本发明的酶2包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。本发明的酶3包含除了在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，和位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。本发明的酶4包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。本发明的酶5包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO: I的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。 应该注意到，包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶(即，野生型还原酶)是已知的来源于商购的Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株(其可从国家技术和评估学会(一个独立的行政机构)获得)。为了得到包含编码本发明的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸)，例如，可以使用下述方法首先，得到包含编码野生型还原酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为野生型多核苷酸)。例如，按照在由Cold Spring HarborLaboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis ；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的常规基因工程方法，可以从Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株得到这样的野生型多核苷酸。具体地，按照“Shin-Saibo Kogaku Jikken Protocols(New Cell Engineering ExperimentalProtocols (新细胞工程实验方法))”(由东京大学(University of Tokyo)医学院肿瘤学系、Shujunsha Co. ,Ltd. 1993 年编写)所述的方法，由 Yamadazyma farinosa IFO 0193 菌株制备cDNA文库。使用所制备的cDNA文库作为模板，并且还使用适当的引物，进行PCR，以扩增包含编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含编码关于SEQID N01的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸缺失、置换或添加的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸，包含关于SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有一个或多个核苷酸缺失、置换或添加的核苷酸序列的多核苷酸等，由此制备本发明的多核苷酸。此处,如果使用来源于Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株的cDNA文库作为模板并且还使用包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，则扩增包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸。通过回收所扩增的多核苷酸，可以制备包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)。随后，按照定点诱变，向包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)中引入特定的定点突变，从而制备本发明的多核苷酸。上述定点突变包括将编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的定点突变；将编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的定点突变；将编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的定点突变；将编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的定点突变；和将编码SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的定点突变。本文所用的“定点诱变”的实例包括01fert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128,1990), Smith 等人· (Genetic Engineering(基因工程)31Setlow, J.和Hollaender, A Plenum :New York), Vlasuk 等人· (Experimental Manipulation of Gene Expression (基因表达的实验操作)，Inouye, M. Academic Press, New York), Hos. N. Hunt等人· (Gene 77, 51,1989)等的方法；和商购试剂盒如Mutan-Express Km(由 Takara ShuzoCo.，Ltd.制造)、TaKaRa La PCR 体外诱变试剂盒(由 Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)和QuickChange II定点诱变试剂盒(由Stratagene Corporation制造)的应用。具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :15的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94°C温育5分钟,然后,进行在94°C温育I分钟、然后50°C 2分钟、然后75°C 3分钟的进行20个循环。最后，进行在75°C温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸I。本发明的酶I的氨基酸序列在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-5个氨基酸突变，优选2-5个氨基酸突变，更优选3-5个氨基酸突变，特别优选4或5个氨基酸突变，或5个氨基酸突变。本发明的酶I的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，1-4个其他氨基酸突变，优选2-4个其他氨基酸突变，更优选3或4个其他氨基酸突变，或4个其他氨基酸突变。
上述“其他氨基酸突变”的实例包括⑴在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(3)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(4)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变、三个氨基酸突变、四个氨基酸突变和五个氨基酸突变。上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶I的具体实例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸是半胱氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“两个氨基酸突变”的实例包括(I)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突·变；(2)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(4)下述两个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶I的具体实例包括(I)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置115的氨基酸为异亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ IDNO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和⑷包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“三个氨基酸突变”的实例包括(I)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(4)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(5)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(6)下述三个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“三个氨基酸突变”的酶I的具体实例包括(I)包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(4)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(5)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(6)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“四个氨基酸突变”的实例包括⑴下述四个氨基酸 突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，
(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(4)下述四个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“四个氨基酸突变”的酶I的具体实例包括(I)包含SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；⑵包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(4)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“五个氨基酸突变”的实例是下述五个氨基酸突变(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(C)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(e)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“五个氨基酸突变”的酶I的具体实例是⑴包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96,125-128,1990)的方法制备,首先,按照例如由 Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis ；Molecular Cloning2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :17的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反 应的条件，例如，进行在94°C温育5分钟,然后,进行在94°C温育I分钟、然后50°C 2分钟、然后75°C 3分钟的进行20个循环。最后，进行在75°C温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸2。本发明的酶2的氨基酸序列在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-4个氨基酸突变，优选2-4个氨基酸突变，更优选3或4个氨基酸突变，或4个氨基酸突变。本发明的酶2的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，1-3个其他氨基酸突变，优选2或3个其他氨基酸突变，或3个其他氨基酸突变，或4个其他氨基酸突变。然而，本发明的酶2不包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱
氨酸置换的氨基酸突变。上述“其他氨基酸突变”的实例包括(I)在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(3)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变、三个氨基酸突变和四个氨基酸突变。上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶2的具体实例是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸是异亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。
上述“两个氨基酸突变”的实例包括(I)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(3)下述两个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶2的具体实例包括(I)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(3)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“三个氨基酸突变”的实例包括(I)下述三个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和
(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述三个氨基酸突变(a)位置115 的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(3)下述三个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“三个氨基酸突变”的酶2的具体实例包括⑴包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；⑵包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和⑶包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“四个氨基酸突变”的实例是这样的四个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(C)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“四个氨基酸突变”的酶2的具体实例是包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ IDNO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94°C温育5分钟，然后，进行在94°C温育I分钟、然后50°C 2分钟、然后750C 3分钟的进行20个循环。最后，进行在75°C温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的基因3。本发明的酶3的氨基酸序列在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-3个氨基酸突变，优选2或3个氨基酸突变，或3个氨基酸突变。本发明的酶3的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，I或2个其他氨基酸突变，或2个其·他氨基酸突变。然而，本发明的酶3不包含下述氨基酸突变SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变。上述“其他氨基酸突变”的实例包括(I)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变和三个氨基酸突变。上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶3的具体实例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置27的氨基酸是精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“两个氨基酸突变”的实例包括(I)下述两个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(2)下述两个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶3的具体实例包括⑴包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(2)包含SEQ ID N01的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“三个氨基酸突变”的实例是下述三个氨基酸突变(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“三个氨基酸突变”的酶3的具体实例是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :13的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94°C温育5分钟，然后，进行在94°C温育I分钟、然后50°C 2分钟、然后750C 3分钟的进行20个循环。最后，进行在75°C温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸4。本发明的酶4的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸突变，例如，I或2个氨基酸突变，并且优选2个氨基酸突变。本发明的酶4的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID N0:1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，另一个氨基酸突变。然而，本发明的酶4不包含下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。上述“其他氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置25的苏氨酸
被丝氨酸置换的氨基酸突变。上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变和两个氨基酸突变。上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶4的具体实例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置42的氨基酸是亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。上述“两个氨基酸突变”的实例是下述两个氨基酸突变(a)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶4的具体实例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO :1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ IDNO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94°C温育5分钟，然后，进行在94°C温育I分钟、然后50°C 2分钟、然后 750C 3分钟的进行20个循环。最后，进行在75°C温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸5。本发明的酶5的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸突变，例如，I个氨基酸突变。本发明的酶5的氨基酸序列可以不仅包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变。然而，本发明的酶5不包含下述氨基酸突变位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。上述“一个或多个氨基酸突变”的实例是一个氨基酸突变。上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶5的具体实例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置25的氨基酸是丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。为了得到本发明的酶，制备能够在宿主细胞如微生物中表达本发明的多核苷酸的载体。然后，将这样制备的载体引入到要转化其的宿主细胞中，以制备转化体。随后，所制备的转化体可以通过常规的细胞培养方法进行培养。因此，本发明的酶可以大量生产并且可以获得。本发明的载体包含本发明的多核苷酸。为了制备本发明的载体，按照常规的基因工程方法，本发明的多核苷酸可以结合在可用于要引入本发明的多核苷酸的宿主细胞的载体中，例如，结合在包含在宿主细胞中可复制的遗传信息的载体中，可以自主复制，可以从该宿主细胞分离或纯化，并且具有可检测的标记(以下在一些情形中还称为基本载体)，由此构建本发明的载体。本文所用的“基本载体”的实例在使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主细胞的情形中包括载体PUC119 (由Takara Shuzo Co. ,Ltd.制造)和卩遼菌粒pBluescriptII (由Stratagene Corporation制造)。另外,在使用芽殖酵母作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括载体 pGBT9, pGAD424 和 pACT2 (由 Clontech Laboratories, Inc.制造)。此外，在使用哺乳动物细胞作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括载体，如pRc/RSV和pRc/CMV(由Invitrogen制造)；包括自主复制起点的病毒来源的载体，如牛乳头瘤病毒载体pBPV (由Amersham Pharmacia Biotech Inc.制造)和EB病毒载体pCEP4(由Invitrogen制造)；以及病毒，如痘苗病毒。此外，在使用昆虫细胞作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括昆虫病毒，如杆状病毒。如果使用包含自主复制起点的载体(具体地，酵母载体PACT2，牛乳头瘤病毒载体pBPV，EB病毒载体pCEP4等)构建本发明的载体，则当将其引入到宿主细胞中时，所构建的载体在宿主细胞中保持为附加体。 本发明的载体可以进一步包含含有编码具有将氧化的腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力的蛋自的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。使用这样的载体，还可能制备转化体，所述转化体进一步包含含有编码具有将氧化的腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。将能够允许本发明的多核苷酸在宿主细胞如微生物中表达的载体引入到要转化其的宿主细胞中，以制备转化体。随后，所制备的转化体可以通过常规的细胞培养方法进行培养，以致本发明的酶可以大量生产并且可以获得。能够允许本发明的多核苷酸在诸如微生物的宿主细胞中表达的载体可以这样制备通过将在诸如微生物的宿主细胞中有功能的启动子以有功能的方式结合到本发明的多核苷酸的上游位点，然后将这样得到的产物结合到上述基本载体中。表述“以有功能的方式结合……”用在此处意指将启动子与本发明的多核苷酸结合，以使本发明的多核苷酸可以在该启动子的控制下在引入本发明的多核苷酸的宿主细胞(诸如微生物)中表达。在宿主细胞中有功能的启动子的实例是在引入该启动子的宿主细胞中表现出启动子活性的DNAο当宿主细胞是大肠杆菌时,这样的启动子的实例包括大肠杆菌乳糖操纵子启动子(IacP)，色氨酸操纵子启动子(trpP)，精氨酸操纵子启动子(argP)，半乳糖操纵子启动子(galp)，tac启动子，T7启动子，T3启动子，λ噬菌体启动子(λ-PL，入-pR)。另外，当宿主细胞是动物细胞或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)时,启动子的实例包括劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，猿猴病毒(SV40)早期或晚期启动子，和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子。并且，当宿主细胞是芽殖酵母时，启动子的实例是ADHl启动子(其中所述ADHl启动子可以通过常规的基因工程方法由包含ADHl启动子或终止子的酵母表达载体pAAH5 [可获自Washington ResearchFoundation ；Ammerer 等人，Method in Enzymology (酶学方法)，IOlpart (p. 192-201)]制备)。此外，当使用原始包含在宿主细胞中有功能的启动子的基本载体时，本发明的多核苷酸可以插入到上述启动子的下游位点，以使上述启动子可以以有功能的方式结合本发明的多核苷酸。例如，当启动子为pRc/RSV，pRc/CMV等时，克隆位点建立在动物细胞中有功能的启动子的下游。将通过将本发明的多核苷酸插入到前述克隆位点中得到的载体引入到动物细胞中，以允许本发明的多核苷酸在所述动物细胞中表达。在这些载体中，先前已经结合了 SV40自主复制起点(ori)。因此，如果将这样的载体引入到已经转化了 ori-缺陷的SV40基因组的培养的细胞中，如COS细胞中，则在所述细胞中载体的拷贝数显著增加，并且结果，结合在所述载体中 的本发明的多核苷酸可以大量表达。并且，前述酵母载体PACT2具有ADHl启动子。因此，如果将本发明的多核苷酸插入到所述载体或其衍生物的ADHl启动子的下游位点，则还可以构建这样的载体，所述载体允许本发明的多核苷酸在芽殖酵母如CG1945 (由 Clontech Laboratories, Inc.制造)中大量表达。在使用微生物作为宿主细胞的情形中，微生物的实例包括真核生物和原核生物。优选的实例是大肠杆菌。可以通过按照常规基因工程方法将上述载体引入到宿主细胞中而转化该宿主细胞。作为将本发明的载体引入到宿主细胞中的方法，取决于所述宿主细胞的类型，可以应用一般的引入方法。当使用大肠杆菌作为