专利名称：一种来源于玉米的联乙烯还原酶及其编码基因与应用的制作方法叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，它的作用是捕获光能并将光能转移到反应中心，故对植物的生长及其产量有很重要的作用。根据乙烯侧链数目的不同，叶绿素可分为3，8_联乙烯叶绿素(DV Chls)和3-乙烯叶绿素(单乙烯叶绿素，MV Chls)。在正常情况下，几乎所有的植物和细菌用于光合作用的叶绿素都是MV chls,目前只发现一类海洋生物艮f]“the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus，，利用的是 DVChls (Chisholm SW, Frankel SL, Goericke R， Olson RJ, Palenik B， Waterbury JB, West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov. gen. nov.sp. :A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a andb. Arch. Microbiol 157:297-300·)。叶绿素生物合成的多样性主要在于它有单乙烯叶绿素(MV Chls)和联乙烯叶绿素(DV Chls)两条平行合成的途径，DV Chls及其中间产物通过联乙烯基还原酶(DVR， 又叫C-8乙烯基还原酶)催化转化成MV Chls及其中间产物(Rebeiz CA，Kolossov VL, Briskin D，Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis :chlorophyll biosynthetic heterogeneity, multiple biosynthetic routes， and biological spin—oVs， in H. S. Nalwa(Ed. ), Handbook of Photochemistry and Photobiology, vol.4, American ScientiWciLos Angeles :183-248.)。迄今为止，已在5种底物水平上检测到联乙烯还原酶活性，分别是联乙烯Mg-原卟啉IX(DV Mg-proto)、联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE). 联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)、联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)和联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) (Kolossov VL, Bohnert HJ, Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 :In situ screening for divinyl chlorophyl1(ide)a reductase mutants by spectroXuorometry. Analytical Biochemistry 348:192—197)。禾g，Mlt^f、參录硫细菌Chlorobium t印idum和蓝细菌Synechocystis sp. PCC6803中分别克隆了相应的联乙烯还原酶基因 DVR、bciA 禾口 slrl923(Wang PR，Gao JX，Wan CM，Zhang FT，Xu ZJ，Huang XQ,Sun XQiDeng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153,994-1003 ； Nagata N，Tanaka R，Satoh S，Tanaka A (2005)Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17，233-240 ；Chew AGM, Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975 ；Islam MR，Aikawa S，Midorikawa T，Kashino Y，Satoh K，Koike H(2008)slrl923 of Synechocystis sp. PCC6803 Is Essential for Conversion of 3，8-Divinyl (proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl (proto) chlorophyll (ide). Plant Physiology 148:1068-1081)。已有实验证明用NADPH作为还原剂，重组的绿硫细菌(Chlorobium t印idum)BciA蛋白质将 DV Pchlide a 还原成 MV Pchlide a (Chew AGM, Bryant DA (2007) Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975)；重组的拟南芥 DVR 蛋白质将 DVChlide a 还原成 MV Chlide a，但不能将DV Pchlide a、DV Chlide b、DV Chl a和DV Chl b等4种DV物质转化为相应的 MV 物质(Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007) The Major Route for Chlorophyll Synthesis Includes[3,8-divinyl]-chlorophyllide a Reduction in Arabidopsis thaiiana. Plant Cell Physiol 48:1803-1808)。我们通过酶学实验证实重组的水稻 DVR蛋白质不仅能将DV Chlide a还原成MV Chlide a，而且能还原DV Chl a为MV Chl a (Wang PR, Gao JX, Wan CM,Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ，Sun XQ,Deng XJ (2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003)。目前，联乙烯 Mg-原卟啉 IX (DV Mg-proto)和联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE)这2种联乙烯(DV型)物质转化为相应单乙烯(MV型)物质，还没有得到利用纯化DVR酶蛋白所做的体外酶学实验的证实，同时，还不清楚的是，这些联乙烯中间物质是由一个具有广泛特异性的联乙烯基还原酶催化， 还是由多个联乙烯基还原酶(每个酶都有特异底物)催化生成相应的单乙烯物质。发明内容本发明的目的是提供一种具有联乙烯还原酶活性的蛋白，该蛋白来源于玉米(Zea mays L)。本发明所提供的具有联乙烯还原酶活性的蛋白，是如下1)或2~)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；幻将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有联乙烯还原酶活性的由1)衍生的蛋白质。编码上述蛋白的基因(ZmDVR)也属于本发明的保护范围。所述基因为如下1)-3)中任一种
1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)在严格条件下与1)或2)的DNA分子杂交且编码上述具有联乙烯还原酶活性蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)的DNA分子具有90%以上的同源性且编码上述具有联乙烯还原酶活性蛋白的DNA分子。
含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pET_30a(+)的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表达载体。在本发明的实施例中，所述多克隆位点具体为BamH I和EcoR I。
所述表达盒为由能够启动ZmDVR基因表达的启动子，ZmDVR基因，以及转录终止序列组成。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有ZmDVR基因的大肠杆菌；所述大肠杆菌具体为BL21。
本发明所提供蛋白在作为联乙烯还原酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上述具有联乙烯还原酶活性的蛋白或ZmDVR基因在如下1)_5)任一中的应用也属于本发明的保护范围
1)转化联乙烯叶绿素a为单乙烯叶绿素a ；
2)转化联乙烯叶绿素酸酯a为单乙烯叶绿素酸酯a ；
3)转化联乙烯原叶绿素酸酯a为单乙烯原叶绿素酸酯a ；
4)转化联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯为单乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯；
5)转化联乙烯Mg-原卟啉IX为单乙烯Mg-原卟啉IX。
实验证明本发明提供的来源于玉米的蛋白具有联乙烯还原酶活性，能将联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a ；将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a ；将联乙烯原叶绿素酸酯a转化为单乙烯原叶绿素酸酯a ；将联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯转化为单乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯；将联乙烯Mg-原卟啉IX转化为单乙烯Mg-原卟啉IX。


图1为以联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)和联乙烯叶绿素a(DV Chl a)作为底物的酶学反应产物的HPLC检测光谱图。其中，A和B的左侧图分别是反应IOmin的产物在440nm和410nm检测到的HPLC色谱图，右侧图均是每个峰的吸收光谱。A代表底物为联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)的酶学反应产物的HPLC检测光谱图。B代表底物为联乙烯叶绿素a(DV Chl a)的酶学反应产物的HPLC检测光谱图。具体的，Al和A2分别是联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)和单乙烯叶绿素酸酯a(MVChlide a)。Bl和B2分别是联乙烯叶绿素a(DV Chl a)和单乙烯叶绿素a(MV Chl a)。A3和B3分别是DV Chlide a与 BL21/pET-30a(+)空载体反应后的色素(阴性对照)，以及DV Chla与BL21/pET_30a (+)空载体反应后的色素(阴性对照)；A4和B4分别是DV Chlide a与BL21/pET_30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素，以及DV Chla与BL21/pET-30 a (+)-ZmDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素。AO (空白对照)是用茼蒿叶片制备的丙酮粉中残留的MV-Chl a经温育后产生的MV-Chlide a ;A1和A3中的弱峰(峰2)即是从丙酮粉中残留的MV-Chl a转化而来的 MV-Chlide a。
图2为以联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)作为底物的酶学反应产物的HPLC 检测光谱图。其中，A代表反应IOmin的产物在440nm检测到的HPLC色谱图，B代表反应池的产物在440nm检测到的HPLC色谱图，C代表反应IOh的产物在440nm检测到的HPLC色谱图，D代表每个峰的吸收光谱。具体的，Al、Bi、Cl均是联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a) ；A2、B2、C2 均是单乙烯原叶绿素酸酯 a(MVPchlide a) ；A3、B3、C3 均是 DV Pchlide a 与 BL21/pET-30a(+)空载体反应后的色素(阴性对照)；A4、B4、C4均是DV Pchlide a与BL21/ pET-30a (+) -ZmDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图3为以联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE)作为底物的酶学反应产物的HPLC 检测光谱图。其中，A代表反应IOmin的产物在410nm检测到的HPLC色谱图，B代表反应池的产物在410nm检测到的HPLC色谱图，C代表反应IOh的产物在410nm检测到的HPLC色谱图，D代表每个峰的吸收光谱。具体的，Al、Bi、Cl均是联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE) ；A2、B2、C2均是DV MPE与BL21/pET-30a (+)空载体反应后的色素(阴性对照)；A3、5B3、C3均是DV MPE与BL21/pET_30a (+)-ZmDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图4为以联乙烯Mg-原卟啉IX (DV Mg-proto)作为底物的酶学反应产物的HPLC 检测光谱图。其中，左侧图代表反应IOh的产物在410nm检测到的HPLC色谱图，右侧图代表每个峰的吸收光谱。具体的，Al是联乙烯Mg-原卟啉IX (DV Mg-proto) ；A2是DV Mg-proto与BL21/pET-30a(+)空载体反应后的色素(阴性对照)；A3是DVMg-proto与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、玉米联乙烯还原酶基因的克隆及其编码蛋白的功能验证
一、玉米联乙烯还原酶基因的克隆
设计如下引物
ZmDVR-F :5，-CCGGATCCATGGCGACCATCCTCCTATC-3，(下划线处为 BamH I 酶切位占)
ZmDVR-R 5 -ATGGAATTCGCCTAGAAGATGGTCTGCTC-3’ (下划线处为 EcoR I 酶切位占)
以玉米(Zea mays L.)品种“B73”自交系叶片提取的DNA为模板，用引物ZmDVR-F 和ZmDVR-R进行PCR扩增，得到1206bp的片段，将该片段连接在pMD_18_T (TaKaRa)载体上， 构建成pMD-ZmDVR，然后转化到大肠杆菌JM109菌株中，筛选阳性克隆后测序。测序结果表明扩增得到的片段具有序列表中序列1所示的序列，将其命名为ZmDVR。序列1所示序列即为ZmDVR基因的编码序列，它编码得到序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质，将该蛋白质命名为ZmDVR。
二、玉米联乙烯还原酶基因编码蛋白的获得及其功能验证
1、重组表达载体pET_30a (+) -ZmDVR的构建
将经步骤一测序鉴定过的pMD-ZmDVR载体用BamH I和EcoR I双酶切，连接到经同样酶切过的表达载体连接到经同样酶切过的表达载体pET_30a(+) (Novagen，产品目录号 69909-3)上，构成重组表达载体pET-30a (+) -ZmDVR0
2、诱导表达
将步骤1的重组表达载体pET-30a(+)-ZmDVR转化到大肠杆菌菌株BL21(同时设置pET-30a(+)空载体转化到大肠杆菌菌株BL21的对照)，在37°C，LB/kan培养基上过夜培养，挑选单克隆于37°C，LB/kan培养液中振荡培养，提取质粒DNA (OMEGA试剂盒)， 用BamH I和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测ZmDVR基因是否插入载体pET_30a(+) 中，将检测含有ZmDVR基因的重组表达载体的克隆送上海英骏公司测序，将筛选正确插入 pET-30a(+)的ZmDVR基因的重组表达载体的克隆命名为BL21/pET-30a(+)-ZmDVR。转入 pET-30a(+)空载体的大肠杆菌菌株BL21命名为BL21/pET-30a(+)。然后参照(Nagata N, Tanaka R, Satoh S, Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17 :233-240)的方法将 BL21/pET-30a(+) -ZmDVR进行诱导表达，具体方法如下分别挑选BL21/pET_30a (+)-ZmDVR和含有空载体PET-30A(+)的BL21 (空载体对照CK)单克隆于20°C，LB/kan培养液中振荡培养一夜，分别取Iml菌液于100ml LB/kan培养液，30°C振荡培养30min后加入异丙基硫代-β -半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0. 5mM,于30°C诱导培养7h，4°C IOOOOrpm离心IOmin, 沉淀用含有6. 7 μ g · πιΓ1溶菌酶和3. 3 μ g · Iiir1DNaseI的50mM的Tris-HCl的溶液悬浮， 溶解产物放入-20°C冰箱保存。
3、酶促反应验证蛋白功能
此步骤所用底物涉及如下五种联乙烯叶绿素a(DV Chl a)、联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a)、联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)、联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE)和联乙烯 Mg-原卟啉IX (DV Mg-proto)。
这五种底物的获得途径如下联乙烯叶绿素a(DV Chl a)从水稻824ys突变体 (黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007，21 ) :355-359 ；Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153, 994-1003)叶绿素中分离，用100%丙酮从824ys突变体新鲜叶片组织中浸提叶绿素，提取液10000r/min (Eppendorf 5804R)离心15min，上清液在氮气下吹干，重溶于100%丙酮。然后用(18柱0. 6mm i. d. X 150mm long ；5 μ m, Agilent,U. S. Α)进行 HPLC 分离，洗脱条件是流动相甲醇乙腈丙酮=1 3 1，40°〇，流速1.0111171^11，上样量5“1^柱中洗脱的色素用660nm波长监测，在相应保留时间收集DV-Chl a，具体参见Wang等在Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ，Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003 中记载的方法。
联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)是用上述分离的联乙烯叶绿素a(DV Chl a) 与从茼蒿叶片制备的丙酮粉中的叶绿素酶反应所得。
其中，丙酮粉(叶绿素酶)的制备方法如下按照Ito等(Ito H，Takaichi S， Tsuji H, Tanaka A. Properties of synthesis of chlorophyll a from chlorophyll b in cucumber etioplasts. J Biol Chem, 1994,269 :22034-22038)的方法，用茼蒿 (Garland chrysanthemum)(品种为“清香茼蒿”，从农贸市场种子摊商购买)叶片制备丙酮粉，具体为取15g新鲜茼蒿叶片，加入300mL冷冻的丙酮，放入组织捣碎机中快速捣碎， 40C lOOOOr/min离心lOmin，弃上清液；然后用丙酮冲洗沉淀，直到叶绿素完全洗净为止；最后将沉淀置于减压真空离心机中吹干制得丙酮粉。
DV Chlide a 的制备方法如下按照 Holden(Holden M. The breakdown of chlorophyll by chlorophyllase. Biochem J，1961，78 :359-364)和 Ito等(Ito H,Ohtsuka Τ, Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a via 7-hydroxymethyl chlorophyll. J Biol Chem，1996，271 :1475-1479)的方法，用 200 μ g 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)(上述经HPLC分离所得到的DV-Chl a)溶解于4mL溶液(25mM Tris-HCl, pH 7.5 和40%丙酮)中，与200mg丙酮粉在观！、黑暗条件下温育池，温育后按照Ito等(Ito H，Tanaka Y，Tsuji H，Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a byisolated cucumber etioplasts. Arch Biochem Biophys, 1993,306 :148-151) ^iTj ^tit DV Chlide a。
联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)是参照(Nagata N, Tanaka R， TanakaA(2007)The major route for chlorophyll synthesis includes[3, 8-divinyl]-chlorophyllide a reduction in Arabidopsis thaiiana.Plant Cel 1 Physiol 48 :1803-1808)的方法)，从黑暗培养6天的水稻8Mys突变体幼苗中提取所得。 具体操作为将黑暗中培养6天的水稻824ys突变体幼苗剪碎后，与丙酮混合，在勻浆机中勻浆1分钟，然后加入iTris-HCUpH 7.6)至终浓度为200mM，IOOOOrpm离心20min，上清液加入等体积的正己烷以除去叶绿素和类胡萝卜素。最后用乙醚从丙酮溶液中萃取DV Pchlide a，用氮气吹干，得到所述联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)。
联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE)和联乙烯Mg-原卟啉IX (DV Mg-proto)是从美国Frontier Scientific he公司购买。
用作对照的单乙烯叶绿素a(MV Chl a)参照上述联乙烯叶绿素a(DV Chl a)的制备方法，从水稻野生型品种8MB(黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007，2K4) =355-359 ； Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ (2010) Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994—1003)中提取。
用作对照的单乙烯叶绿素酸酯a(MV Chlide a)参照上述联乙烯叶绿素酸酯 a(DVChlide a)制备方法，用单乙烯叶绿素a(MV Chl a)作底物进行酶反应制备。
用作对照的单乙烯原叶绿素酸酯a(MV Pchlide a)是参照上述联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)的制备方法，从黑暗培养6天的水稻野生型亲本824B幼苗中提取所得。
将BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白(ZmDVR)分别与上述 DV Chl a 禾口 DV Chlide a这两种底物在反应缓冲液GOmM柠檬酸，80mM K2HPO4,0. 5mM NADPH，20%丙酮，pH 7. 0)中 30°C反应 IOmin,由于 ZmDVR 蛋白对底物 DV Pchlide a,DV Mg-Proto 和 DV MPE 催化活性较慢，因此，对DV Pchlide a和DV MPE的反应时间设置10min、2h和IOh三个处理， 对DV Mg-proto的反应时间延长到10h，同时BL21/pET_30a(+)-ZmDVR表达的蛋白(ZmDVR) 与五种底物的反应，均设置空载体对照。然后用丙酮终止反应，转入乙醚中，经氮气吹干，再溶于丙酮，最后用HPLC检测(同时设置作为上述DV Chl a、DV Chlide a、DV Pchlide a 三种底物的相应对照 MV Chl a、MV Chlide a 和 MV Pchlide a)。按照 Zapata 等(Zapata Μ, Rodriguez F and Garrido JL(2000)Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton :A new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases. Mar. Ecol. Prog. Ser. 195 :29-45)的方法进行 HPLC分析，洗脱采用梯度流动相(表1)，25°C，流速l.OmL/min，上样量5yL，酶反应DV Chl a 禾口 DV Chlide a 的产物用 C8 柱 6mm i. d. X 150mm long ；3. 5 μ m, Agilent)检测，柱中洗脱的色素分别用410nm和440nm波长监测；酶反应DV Pchlide a,DV MPE和DV Mg-proto 的产物用C8柱(4. 6mm i. d. X 150mm long ；3. 5 μ m, Waters)检测，柱中洗脱的色素分别用 440nm、410nm 和 410nm 波长监测。
表IHPLC分析所采用的梯度流动相


本发明公开了一种来源于玉米的联乙烯还原酶及其编码基因与应用。本发明提供的联乙烯还原酶，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有联乙烯还原酶活性的由1)衍生的蛋白质。实验证明本发明提供的联乙烯还原酶能将联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a；将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a；将联乙烯原叶绿素酸酯a转化为单乙烯原叶绿素酸酯a；将联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯转化为单乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯；将联乙烯Mg-原卟啉Ⅸ转化为单乙烯Mg-原卟啉Ⅸ。