专利名称：用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法用于控制欧洲玉米螟的包含CRYIAb和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法人类种植玉米以用于食物和能量的供应。昆虫吃并损害植物从而破坏这些人类的努力。目前已经通过植物表达编码来自苏云金芽孢杆菌的CrylFa蛋白的晶体(Cry)内毒素基因而实现了这些害虫 的植物内转基因控制。CrylFa是目前Dow AgroSciences的Herculex 品牌下的转基因玉米种子(Herculex, Herculex-Extra,和 Herculex-RW)中的毒素蛋白，其对FAW和ECB昆虫害虫有抗性。该蛋白通过结合至位于昆虫中肠内的特定受体并在肠细胞上形成孔而起作用。这些孔的形成阻止昆虫调节渗透压平衡并导致其死亡。然而，存在一些情况，即昆虫可能能够通过其肠道中结合CrylFa的受体的遗传改变而发展对CrylFa活性的抗性。产生具有降低的结合CrylFa能力的受体的昆虫会对CrylFa的活性有抗性，从而在表达该蛋白的植物中存活。当植物在生长状态期间持续表达单一的Cry毒素时，有这种情况，即昆虫可以通过昆虫肠道内的结合CrylFa毒素的受体的遗传改变而发展对该蛋白的活性的抗性。由受体的这些改变而引起的毒素结合的降低会导致CrylFa毒性的降低，并可能导致最终作物中表达的蛋白的效力降低。发明概述本发明部分地涉及叠加CrylAb蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)(corn or maize)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。发明详述本发明部分地涉及叠加CrylAb蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于祀标欧洲玉米螟(ECB, Ostrinia nubilalis)。本发明也部分涉及三倍叠加或三种(或更多)蛋白毒素的“金字塔”，由CrylAb和Cry2Aa毒素作为基础对。(“分离的活性位点”，意思是给定的蛋白的任何一个不引起相互之间的交叉抗性。)增加靶向ECB的第三种蛋白能提供具有针对ECB的行为的第三个位点的蛋白。在一些优选的实施方式里，第三个蛋白可以选自DIG-3(参见US 2010-00269223),Cryll，CrylBe，Cry2Aa，和 CrylFa。参见例如 USSN 61/284，278，提交于 2009 年 12 月 16Ho 也参见 US2008-0311096。从而，在一些优选的金字塔实施方式里，选择的毒素具有针对ECB的作用的分离的位点。此外，优选的金字塔组合为本发明的蛋白对加第三个IRM蛋白。本发明的对或三倍叠加(对ECB活性)也可以与另外的蛋白组合——例如靶向秋粘虫(FAW)。这样的蛋白包括例如Vip3, CrylC, CrylD,和/或CrylE。CrylBe和/或CrylFa也可以用于靶向FAW和ECB。GENBANK可以用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。参见附录A。本发明也涉及三种杀虫蛋白(在一些优选实施方式里是Cry蛋白)，其对单一的靶标害虫有活性，但是不导致相互之间的交叉抗性。生产这三种(至少)毒素的植物(和种植该植物的面积)也包含在本发明的范围之内。也可以加入其它的毒素/基因，但是这些特别的三倍叠加根据本发明可以便利地和令人讶地提供针对ECB的活性的三个位点。本发明的对或三倍叠加(和/或其它蛋白的组合)能有助于减少或消除对避难所面积的需求(即，少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或甚至0%的避难所)。从而种植了超过10英亩的田地也包含在本发明之内。提供的多核苷酸优选在遗传构建体中并在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子。为了阻碍昆虫发展针对Cry蛋白的抗性的能力，我们鉴别了不竞争性结合至ECB肠受体蛋白的Cry毒素。发现CrylAb不取代结合至位于ECB幼虫的昆虫肠道中的受体的Cry2Aa。 我们发现Cry2Aa和CrylAb对ECB幼虫是毒性的，然而它们不完全与同样的受体位点结合；这显示它们的毒性不会在ECB中提供交叉抗性。从而具有对CrylAb的发展的抗性的昆虫仍然会对Cry2Aa蛋白的毒性敏感，例如，其中Cry2Aa结合不同的受体位点。我们获得了生物化学数据支持该观点。从而转基因植物中表达的这些蛋白的组合提供了有用的和有价值的机制以减少田地中昆虫抗性的发展的可能性，并从而导致对避难所的需求减少。本文下面描述的数据显示Cry2Aa蛋白在昆虫肠中与相比于CrylAb分离的目标位点结合，从而会成为优秀的叠加成员。如果抗性通过结合至Cry毒素的昆虫肠受体的亲和力的变化而发生，该变化必须同时发生在至少两个不同的受体上以使得昆虫在表达多种蛋白的植物上存活。发生这种情况的可能性是非常小的，从而增加了转基因产物的持久性以防止昆虫能够发展对蛋白的耐受性。我们放射性碘标记了 CrylAb蛋白并用放射性受体结合分析技术来测量其与位于昆虫肠膜中的推定受体蛋白的结合作用。肠膜通过Wolfersberger的方法制备为刷状缘膜载体(BBMV)。毒素的碘化作用通过来自PierceChemicals的碘珠或碘处理的试管来进行。放射性标记毒素的特定活性为约1-4 μ Ci/μ g蛋白。基本上通过Liang(1995)的流程进行了结合研究。本文展现的数据显示相比于CrylAb，毒素结合昆虫肠中的分离的靶标位点，从而会成为优秀的叠加成员。本发明可以用于多种植物。实例包括玉米，大豆和棉花。根据本发明有用的基因和毒素包括但不仅是公开的全长序列而且包括这些序列的片段，变体，突变，和融合蛋白，其保留本文特别示例的毒素的特征性杀虫活性。如本文所用，术语基因的“变体”或“变异”指这样的核苷酸序列，其编码相同的毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素。如本文所用，术语“等价毒素”是指具有与所要求的毒素相同或基本上相同的针对目标害虫的生物活性的毒素。如本文所用，边界展现约95% (例如，CrylAb的和Cry2Aa的)，78% (例如，CrylA 的和 Cry2A 的)，和 45%(CryI 的和 Cry2 的)序列同一性，参考 “Revision of theNomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”，N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson，E. Schnepf，J. Van Rie, D. Lereclus，J. Baum, andD. H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。这些切断(cut offs)也可以仅提供于核心蛋白。示例的毒素的保留杀虫活性的片段或等价物也在本发明的范围之内。同样，由于遗传密码子的冗余性，多种不同DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。本领域技术人员能建立这些编码同样的，或基本上同样的毒素的可选的DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围之内。如本文所用，涉及“基本上相同”的序列是指具有氨基酸取代、删除、添加或插入而不从本质上影响杀虫活性的序列。编码保留杀虫活性蛋白的基因的片段也包括在该定义之内。根据本发明的鉴别编码毒素的基因和基因部分的进一步的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可探测的核苷酸序列。这些序列可以通过依靠合适的放射性标记或可以通过固有的荧光来实现可探测性，描述于国际申请号W093/16094。本领域公知，如果探针分子和核酸样品通过形成两个分子间强烈的碱基配对键而杂交，则可以推定该探针和样品具有基本的序列同源性。优选地，杂交是在严紧条件下通过本领域公知的技术来进行，描述于例如 Keller, G. H.，Μ. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y.，pp. 169-170。盐浓度和温度组合的一些实例如下(为了增加严紧度)2X SSPE或SSC在室温下；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探针的检测提供了用已知方式确定杂交是否发生的方法。这样的探针分析提供了鉴别本发明的毒素编码基因的快速方法。根据本发明的用作探针的核苷酸片段可以使用DNA合成器和标准过程来合成。这些核苷酸序列也可以用做PCR弓丨物以扩增本发明的基因。本文特别示例了本发明的某些毒素。由于这些毒素仅仅是本发明的毒素的示例，很显然本发明包含变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)，所述等价毒素具有与示例毒素相同或类似的杀虫活性。等价毒素具有与示例毒素的氨基酸同源性。这种氨基酸同源性典型地大于75%，大于90%，并可以大于91，92，93，94，95，96，97，98，或99%。氨基酸序列的同源性在毒素的关键区域是最高的，所述关键区域对生物学活性起作用或者涉及三维构象的确定，其最终也为生物活性服务。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的并且是被期望的，如果这些取代在对活性不关键的区域或者是不影响分子的三维构象的保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以位于下列类别中非极性；不带电极性，碱性，和酸性。保守性取代，即其中一类的氨基酸替换为同样类型的另一个氨基酸，也在本发明的范围内，只要该取代不本质上改变该化合物的生物活性。下面是属于每个类的氨基酸的实例的列表。在一些情况下，非保守取代也可以进行。一个重要事实是这些取代必须不显著损害蛋白的生物活性。本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。