专利名称：一种硝酸还原酶活性测定新方法硝酸还原酶是植物体内硝态氮代谢的第一个关键酶，且硝酸还原酶是一种诱导 酶，即在硝态氮(no3_)存在条件下能够诱导产生酶活性。植物从土壤中吸收的硝态氮首先 需要经过硝酸还原酶的催化而形成亚硝态氮，亚硝态氮再经过亚硝酸还原酶作用下转化为 NH4+,然后NH4+在谷胺酰胺合成酶作用下形成氨基酸，进而完成蛋白质的合成。在植物生长 发育过程中，如果硝态氮代谢的第一个关键酶硝酸还原酶活性受到外界环境的影响则植物 体内氨基酸和蛋白质的合成就会受到阻碍，从而造成对植物生长发育的严重不利影响。因 此，对植物体内硝酸还原酶活性的测定，能正确反应出植物对氮素营养的吸收与代谢能力， 是正确评价外界环境对植物氮代谢影响的一种有效方法。目前已有的关于硝酸还原酶活性 的测定方法可以归纳为两种一、活体法这种方法是在反应液中加入硝态氮(N03_)，通过测定硝态氮(N03_)被植物体内硝 酸还原酶还原成亚硝态氮的量来反应酶活性的高低。但由于硝酸还原酶是一种诱导酶，其 活性会受到反应液中加入硝态氮(no3_)的诱导而提高，因此这种“活体法”测定硝酸还原酶 的活性不能真实反应植物体内硝酸还原酶活性，只是作为一种相对比较而加以应用。二、离体法这是一种目前正在应用的测定植物体内硝酸还原酶活性真实值的方法。“离体法” 测定植物体内硝酸还原酶活性真实值方法具体步骤是1、反应液配制(1)利用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制0. lmol/L pH7. 5的磷酸缓冲液；(2)配制 0. lmol/L KNO3 磷酸缓冲液；(3)配制NADH2溶液称取2. Omg NADH2溶于Iml 0. lmol/L的磷酸缓冲液中；(4)配制提取缓冲液25mmol/L的磷酸缓冲液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na2混合液。2、测定方法流程取实验材料洗净剪碎，放在研钵中置低温冰箱冷冻30min。取出 在冰浴中加少量石英砂和提取缓冲液。研磨为勻浆，低温离心5min(4000r/min)。上清液即 为粗酶提取液。上述操作尽量在冰浴中进行；3、比色取粗酶提取液，加入KNO3磷酸缓冲液和NADH2溶液。在30°C下保温30min。 保温后立即加ImL对-氨基苯磺酸溶液终止反应，加ImL α -萘胺溶液，显色20min，在台式 离心机上离心lOmin，取上清液在分光光度计上测波长540nm处的光密度值。离体法具有的缺点是(1)需要配制的反应液多(共4种)，所需化学药品多，价格 贵；(2)测定方法流程复杂、人为造成误差增大。首先需要低温冰冻研钵研磨和低温离心，费工、费时。从研钵中转移至离心管离心时会造成研磨液的损失造成误差；(3)比色时仍需 要进一步低温离心，使测定时间加长，造成人为误差加大；(4)方法复杂，难以实现快速、多 组测定植物体内硝酸还原酶的真实活性。本项发明所涉及的这种植物体内硝酸还原酶活性的测定方法是在多年试验基础 上获得的一种简便、精确并可快速、多组测定植物体内硝酸还原酶活性真实值的新方法。
植物体内硝酸还原酶活性的高低能够真实地反应植物对硝态氮吸收与代谢的能 力，是评价环境条件对植物氮代谢影响的一种有效方法。因此，建立一种能够简便、快速测 定植物体内硝酸还原酶真实活性的方法在植物氮代谢研究领域具有重要作用。本项发明解决其技术问题所采用的技术方案是在保持已有的“离体法”测定硝酸 还原酶活性比色时加入的显色剂对-氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液不变前提下，进行如 下操作1、提取液配制用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和(V/V)的1-丙醇配制成IOOmM, pH7. 5的提取液。2、测定方法流程取植物样品0. 3克左右剪碎装入反应试管，加入提取液6毫升， 抽真空1-2分钟，从反应试管中取出ImL反应液放入洁净试管中。将装有样品的反应试管 吹氮气30秒后用锡纸封住试管口，将该试管放入30-35°C水浴中保温1小时后，取反应液 ImL放入洁净试管。然后向反应试管中加入ImL提取液，再放入30_35°C水浴中保温1小时 后，取反应液ImL放入洁净试管。再向反应试管中加入ImL提取液，放入30_35°C水浴中保 温1小时，取反应液ImL放入洁净试管。向上述获得的4支装有ImL反应液的试管中分别 加入去离子水4mL准备用于显色反应。3、比色分别向上述4只试管中加入ImL 1 % (W/V)的对-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，显色反应30分钟。用提取液ImL加入4mL去离子水后分别 加入ImL 1% (W/V)的对-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液做空白，在 分光光度计上测定波长540nm处的光密度值，取同一时间的最佳光密度值计算硝酸还原酶 活性。单位为=μΜ NCVg-1FW IT1。本发明的有益效果是(1)提取液配制简单(仅1种)，所需化学药品少，成本低； (2)测定过程无需研磨、离心，且整个实验过程中无硝态氮(N03_)的引入，不会诱导硝酸还 原酶活性的提高，因而误差小，真正实现了对植物体内硝酸还原酶真实值的测定；(3)方法 简便，可以实现快速、多组测定植物体内硝酸还原酶的真实活性。一种硝酸还原酶活性测定新方法，方法改进为用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和1％的1-丙醇配制100mM，pH7.5的提取液。样品0.3克左右剪碎装入反应试管，加入提取液6mL，抽真空后，取1mL反应液放入试管中；反应试管吹氮气30秒后用锡纸密封，将该试管放入30-35℃水浴中保温1小时，取反应液1mL放入试管；再向反应试管中加入1mL提取液，重复水浴保温反应3次后，分别向装有1mL反应液的试管中加入去离子水4mL，再分别加入1mL1％的对-氨基苯磺酸和1mL0.2％的α-萘胺，显色30分钟，测定540nm处的光密度值。用亚硝酸钾做标准曲线，计算酶活性。单位为μMNO2-g-1FWh-1。