专利名称：含丹参酮的药物组合物及其制备方法与用途的制作方法中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为齿形科植物地干燥根及根茎，丹参作为一种传统中药，其应用至少有1500年的历史，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功，能显著增加冠脉流量。由于它所显示出来的这些疗效，使它成为许多常用于心脑血管疾病中成药的一个重要成分。目前一般认为，丹参中具有活血化淤活性的有效部位有两类脂溶性丹参酮类和水溶性丹参酚酸类。脂溶性丹参酮类主要包括丹参酮I(tanshinone-I)、丹参酮II(tanshinone-II)、隐丹参酮(cryptotanshinone)等，其中丹参酮-II包括tanshinone-IIA、tanshinone-IIB、1-hydroxytanshinone-IIA(1-羟基丹参酮-IIA)、ethytanshinoate(丹参酸甲酯)、3a-hydroxytanshin one-IIA(3a-羟基丹参酮-IIA)、tanshinol-A等，丹参酮-I包括tanshinol-A、tanshinone I、dihydrotanshinone I；丹参的主要水溶性丹参酚酸类包括丹酚酸A-C、迷迭香酸及其甲脂、丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸等成分。丹参酮的生物活性有抑菌、抗炎、清除脂类自由基、影响肺纤维化病理过程、雌激素样作用、对血小板聚集的影响、保护心血管、抗肿瘤多方面的生物活性。丹参酮的制剂在临床上应用的有丹参酮胶囊和丹参酮-IIA磺酸钠盐注射液。丹参酮类几乎不溶于水，制剂的体外溶出差。经测定某批复方丹参片在人工胃液中隐丹参酮最大溶出度为25％，丹参酮IIA溶出未测到；某批丹参酮胶囊在人工胃液中隐丹参酮最大溶出度为1.26％，丹参酮IIA溶出未测到。药代动力学实验也证明丹参酮类口服吸收差。因此丹参酮类属于口服给药溶出差、生物利用度低的成分。丹参酮-IIA磺酸钠虽能溶于水，但由于其“强极性”，不易透过有具有脂双层结构的蛋白生物膜，因此不能通过血脑屏障，使其在中枢神经系统中的含量很低。另外罗厚蔚等研究表明丹参酮-IIA在制备成水溶性衍生物丹参酮-IIA磺酸盐后，其抑菌活性明显降低罗厚蔚，高纪伟，郑家润，等.丹参酮类及有关化合物抑菌作用的构效关系.中国药科大学学报，1988，19(4)258～262。
本发明要解决的技术问题是中药丹参中的脂溶性有效部位丹参酮乳剂药物组合物的处方及其制备方法与用途，其中乳剂包括口服乳剂与静脉乳剂。为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案一种丹参酮的药物组合物，含治疗有效量的隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I和二氢丹参酮I(以下简称精制丹参酮)，所述药物组合物可以含有药学上所说口服或静脉给药乳剂制剂的辅料。丹参酮中含治疗有效量的精制丹参酮，是指丹参酮中按重量/重量计精制丹参酮含量不低于50％，优选丹参酮中按重量/重量计精制丹参酮含量为50％-99％。
本发明药物组合物较优选的组成是含有按重量/重量计含量为50％～95％的精制丹参酮、药学上可作为载体的油、乳化剂和水；其配比为精制丹参酮0.05～0.2g、中链油4g、长链油1～16g、乳化剂0.5～5.0g、油酸钠0.02-0.1g，加水至100ml；
更优选的组合物配比是精制丹参酮0.05～0.15g、中链油4g、长链油1～10g、乳化剂1.0～2.0g，油酸钠0.02-0.08g，加水至100ml；每100ml乳剂含等渗调节剂按重量/重量计为2.0％～3.0％。
最优选的组合物配比是精制丹参酮0.05～0.10g、中链油4g、长链油1～6g、乳化剂1.0～1.6g，油酸钠0.04-0.07g，加水至100ml；每100ml乳剂含等渗调节剂按重量/重量计2.0～3.0％。
其中长链油为植物油或动物油或二者混合物。植物油选自大豆油、玉米油、花生油、橄榄油、蓖麻油、棕榈油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油等。动物油选自通常来源于动物脂肪，包括鱼油、油酸钠、鯨蜡油等。中链油(middle-chain triglycerides(MCT))即中链甘油三酸酯，即辛癸酸甘油脂，是半合成的天然功能性油脂，碳链长度C8-10，来源于椰子油。乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、丝氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸、脑磷脂或者它们的混合物，等渗调节剂选自甘油。
本发明对丹参酮在油相的溶解进行了筛选丹参酮在大豆油等长链油中溶解度很小，达不到临床治疗有效量；丹参酮在中链油中有较好的溶解度，由于中链油(MCT)不含人体必需的α-亚麻酸和亚油酸钠，而必须有长链油(LCT)来补充，这就使中链油(MCT)单独使用不好，同时我们的研究发现丹参酮在大豆油等长链油和中链油的混合油溶解度优于其在中链油中的溶解度，因此本发明采用中链油和长链油的混合油作为油相载体；本发明对长链油和中链油的比例进行了筛选，确定了长链油和中链油的最佳比例，既能使丹参酮溶解度达到临床治疗有效量，又能制成质量稳定并符合临床用药安全的乳剂。本发明对乳化剂比例进行了筛选，确定了最佳比例。
所述药物组合物的制备方法为将丹参酮或含有治疗有效量精制丹参酮与油混合，加热至60～80℃，搅拌，使溶解为澄明溶液，加入油酸钠和乳化剂，搅拌，使溶解为澄明溶液，得油相；将等渗剂溶于水中形成水相，加热至60-80℃；在高速搅拌下将油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，经高压均质机乳化，得到乳剂。优选的制备方法为将含有治疗有效量精制丹参酮、大豆磷脂和/或蛋黄磷脂、中链油与长链油混合，加热至70～80℃，加入油酸钠，使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油溶于水中形成水相，加热至70-80℃；把含有丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌形成初乳，所得初乳加水定容后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化，制得乳剂。
本发明所述的丹参酮通过丹参药材乙醇浸提或CO2超临界流体萃取法提取获得，并经过柱层析纯化，其主要成分为隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I和二氢丹参酮I。
隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I和二氢丹参酮I统称为“精制丹参酮”，是丹参的有效部位，是本发明药物组合物中的药效成分。
按照新药注册管理办法，原料药中有效部位含量不低于50％。对于本发明药物组合物，原料药精制丹参酮按重量/重量比计含量不得低于50％。
所述的油是指生物可接受的物质，一般指植物油、动物油、合成油或其混合物。植物油可以是大豆油、玉米油、花生油、橄榄油、蓖麻油、棕榈油、椰子油、菜籽油、中链油、芝麻油或棉子油中的一种或几中；优选为大豆油、芝麻油等富含甘油三酯的油。还可选自五味子油、沙棘油、桃仁油、杏仁油、红花油、茶油、月见草油、小麦胚芽油、紫苏油、山苍子油、鸦胆子油或莪术油中的一种或几种；或者选自亚油酸钠、共轭亚油酸钠、油酸钠乙酯、氢化蓖麻油、氢化花生油、氢化棉子油、亚油酸钠乙酯、共轭亚油酸钠乙酯、自乳化单硬脂酸酯、辛/癸酸甘油酯或甘油三乙酯中的一种或几种。动物油选自通常来源于动物脂肪，包括鱼油、油酸钠、鯨蜡油等。
本发明所述的乳化剂可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的一种或几种。其中阴离子表面活性剂选自高级脂肪酸的盐类、硫酸化油和高级脂肪醇硫酸酯类中的一种或几种，如油酸钠钠、油酸钠钾、十二(十四、十六、十八)烷基硫酸钠等。阳离子表面活性剂选自磺酸化物，如辛烷基硫酸(磺酸)钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠中一种或几种；两性表面活性剂选自豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、丝氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸、脑磷脂或氢化磷脂中的一种或几种；非离子表面活性剂选自蔗糖脂肪酸酯类(如蔗糖酯)、司盘类、吐温类、聚氧乙烯脂肪酸酯类(如卖泽Myrij)、聚氧乙烯脂肪醇醚类(如卞泽Brij)、Cetomacrogol类、Cremophore EL类或泊洛沙姆类(如poloxamer)中的一种或几种。本发明所述的乳化剂优选大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂等中的一种或几种，更优选为大豆磷脂和/或蛋黄磷脂。
本发明丹参酮乳剂的等渗调节剂为常规辅料、常规用量，只要达到等渗目的即可，如所述等渗调节剂为甘油。
由于丹参酮难以溶解于水中，至今尚无注射剂方面的使用。本发明提供的丹参酮乳剂经室温放置12个月，30℃放置6个月稳定性考察结果显示，激光粒度分析仪测定其平均粒径变化在规定范围，且粒度均匀，符合国家药品注册管理办法要求；高效液相(HPLC)法测定精制丹参酮含量保持稳定。其他各项指标均符合注射剂要求，表明所得制剂质量稳定。
本发明提供的丹参酮乳剂可以改变丹参酮在人体内的分布，提高药物的生物利用度，丹参酮制成乳剂后易被网状内皮系统摄取，在体内具有显著的靶向性，在心脏部位和中枢神经系统富集从而达到治疗浓度，提高该药物在治疗心血管疾病及中枢神经系统疾病的作用，比相同剂量下水针剂的心脏靶向性和中枢神经系统靶向性提高300％以上。并且可保持丹参酮原有的活性。该注射剂稳定、可耐受高压灭菌，使用的辅料具有生物相容性，并显示较少的副作用。
本发明还提供了所述含丹参酮的组合物在制备治疗或预防感染性疾病、缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病、肿瘤、肝纤维化、糖尿病并发症、肺纤维化、慢性肾炎、慢性肾功能不全、阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明所述的丹参酮可以采用市售品(具有相应提取设备或生产型超临界设备的厂家均可以生产，如西安天丰生物科技有限公司其产品精制丹参酮10-80％各种含量产品)。实施例中茶油、中链油、精制大豆油、精制芝麻油、鱼油、玉米油、花生油均采用铁岭北亚药用油有限公司生产的市售品。豆磷脂、蛋黄磷脂、脑磷脂、氢花磷脂、油酸钠、甘油均采用上海东尚实业有限公司生产的市售品。
制备例1制备精制丹参酮
取当丹参药材，粉碎，95％乙醇浸提，回收乙醇得浸膏，硅胶柱层析纯化，石油醚-乙醚梯度洗脱，收集富含精制丹参酮部位，得到精制丹参酮。高效液相(HPLC)法测定，含精制丹参酮56％(w/w)。
制备例2制备精制丹参酮
丹参药材粉碎过筛，置于5L超临界萃取设备，CO2超临界流体萃取物(萃取釜35MPa，60℃，时间40min，95％乙醇为夹带剂，循环量为675ml·h-1，即用量为药材总量的30％，压力5MPa，温度45℃，丹参萃取液过滤，滤液静置，取沉淀，硅胶柱层析纯化，石油醚-乙醚梯度洗脱，收集富含精制丹参酮部位，得到精制丹参酮。高效液相(HPLC)法测定，含精制丹参酮89％(w/w)。
实施例1精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮50mg、豆磷脂0.5g、加入到茶油1.0g和中链油4.0g的混合油中，加入油酸钠0.02g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于20ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径166nm。
实施例2精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮200mg、蛋黄磷脂5.0g、加入到精制芝麻油16g和中链油4g的混合油中，加入油酸钠0.1g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.25g溶于60ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径168nm。
实施例3精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮150mg、蛋黄磷脂2.0g、加入到中链油4g中，精制大豆油10g，加入油酸钠0.08g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径165nm。
实施例4精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮50mg、蛋黄磷脂1.0g、加入到鱼油1.0g和中链油4.0g的混合油中，加入油酸钠0.02g，加热至70～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加热至70-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径174nm。
实施例5精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮100mg、蛋黄磷脂1.6g、加入到鱼油6.0g和中链油4.0g的混合油中，加入油酸钠0.07g，加热至70～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加热至70-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径174nm。
实施例6精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮50mg、氢化磷脂1.0g、加入到中链油4.0g和玉米油1.0g的混合油中，加入油酸钠0.04g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于50ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径164nm。
实施例7精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮80mg、脑磷脂1.4g、加入到中链油4.0g和花生油4.0g的混合油中，加入油酸钠0.06g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径155nm。
实施例8精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮120mg、蛋黄磷脂1.2g、加入到中链油6g和大豆油2g的混合油中，加入油酸钠0.05g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径158nm。
实施例9精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮150mg、蛋黄磷脂1.2g、加入到中链油6.0g和玉米油4.0g的混合油中，加入油酸钠0.07g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径158nm。
实施例10精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮200mg、蛋黄磷脂1.6g、加入到中链油10g和大豆油5g的混合油中，加入油酸钠0.05g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡橙黄色乳液，平均粒径158nm。
比较例1精制丹参酮油相的制备
将精制丹参酮20mg加入到10g玉米油中，加热至60～80℃，搅拌，精制丹参酮不溶于玉米油，无法制得油相。
比较例2精制丹参酮油相的制备
将精制丹参酮20mg加入到20g大豆油中，加热至60～80℃，搅拌，精制丹参酮不溶于大豆油，无法制得油相。
比较例3精制丹参酮油相的制备
将精制丹参酮200mg加入到4.0g中链油中，加热至60～80℃，搅拌，精制丹参酮不能全溶于中链油，无法制得油相。
比较例4精制丹参酮油相的制备
将精制丹参酮200mg加入到4.0g中链油和6.0g大豆油中，加热至60～80℃，搅拌，精制丹参酮溶解为澄明溶液，可制得油相。
比较例5精制丹参酮乳剂的制备
将精制丹参酮150mg、蛋黄磷脂1.6g、加入到中链油10g中，加入油酸钠0.025g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于100ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有精制丹参酮的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟，制得乳剂。所得乳剂为均匀的淡红色乳液，平均粒径168nm。
以下试验例1采用的丹参酮乳剂按实施例1、2、5制备。其余试验例的丹参酮乳剂按实施例10制备。试验例中所述的丹参酮IIA磺酸盐注射液购自上海第一生化药业有限公司生产的市售品。各种细菌购自中国药品生物制品检定所；各种实验动物皆购自昆明医学院实验动物中心。
试验举例丹参酮乳剂在体内分布特点(药物在大鼠体内的组织分布研究)
Sprague Dawley(简称SD)大鼠48只，雌雄各半，随机分为8组，每组6只，按20mg/kg体重尾静脉注射药物，对照药为丹参酮IIA磺酸盐注射液，其余四组为丹参酮乳剂(按照实施例5制备)，给药后分别于15min、30min、60min、120min放血处死(每时间点6只动物，雌雄各半)，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃肠、脑，用生理盐水冲洗表面血污，吸干水分，-25℃保存供测试；测试前用组织匀浆器制成400mg/ml的生理盐水匀浆使用。测试血浆和各组织中丹参酮IIA含量，采用高效液相色谱法定量分析以峰面积计算，结果见表1。
表1丹参酮乳注射给药后药物在体内各组织分布浓度数据表(丹参酮IIAμg/g组织)
结果表明
1、乳剂能够显著提高药物在心脏的靶向性；
2、结果表明该药制成乳剂后可以透过血脑屏障，在脑中的分布量明显比注射液提高。
试验例1丹参酮乳剂体外抑菌作用试验
1方法
采用平板打孔法分别检测丹参酮乳剂组(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)、丹参酮IIA磺酸盐注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、人型结核杆菌抑菌效果。
2结果
结果显示丹参酮乳剂各剂量组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、人型结核杆菌均具有显著的抑菌效果。与丹参酮IIA磺酸盐注射液对比有显著性差异。
表2丹参酮乳剂抑菌作用
注与丹参酮IIA磺酸盐注射液比较 *P＜0.05，**P＜0.01。
以下试验例中动物给药方法皆为静脉注射给药。采用的丹参酮乳剂皆按实施例10制备。
试验例2丹参酮乳剂对大鼠局部脑缺血损伤的影响
1.分组与实验方法
Wistar大鼠随机分为(1)假手术组(等容量溶剂)，(2)模型对照组(等容量溶剂)，(3)丹参酮II-A磺酸钠注射液组(6mg/kg)，(4)丹参酮乳剂低剂量组(3mg/kg)；(5)丹参酮乳剂中剂量组(6mg/kg)；(6)丹参酮乳剂高剂量组(12mg/kg)。每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
2.结果
如表3所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的丹参酮乳剂，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。与丹参酮II-A磺酸钠注射液组相比有显著性差异。
表3丹参酮乳剂对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)
注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与丹参酮II-A磺酸钠注射液组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
试验例3丹参酮乳剂对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响
1.分组及实验方法
分组同前。禁食12小时后，按实验例2所述方法造成左侧大脑中动脉缺血；术后10min各组动物静脉注射相应药物。缺血2小时后，抽出尼龙线，造成大鼠脑缺血/再灌注损伤；再灌22小时后，按按试验例2所述方法进行行为评分、脑片染色。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
2.结果
如表4所示，缺血2小时再灌22小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的丹参酮乳剂，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。与丹参酮II-A磺酸钠注射液组相比有显著性差异。
表4丹参酮乳剂对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响(n＝10，X±s)
注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与丹参酮II-A磺酸钠注射液组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
试验例4丹参酮乳剂对大鼠心肌缺血的影响
1.分组及实验方法
分组同前。禁食12小时后，ip乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，测肢体导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及二条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。术后各组动物静脉滴注(用输液泵注射)相应药物(给药体积3ml，30min滴完)。记录术后0，2，6h心电图，随后取出心脏，以冷生理盐水洗净后，-20℃冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜配制的0.5％N-BT磷酸缓冲液(pH 7.4)中。37℃水浴振摇10～15min。用滤纸吸干切片表面的染色液，分离染色部分和未染色部分，称重，记算梗死面积。心肌梗死百分比(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。
3.结果如表5所示，不同剂量的丹参酮乳剂均明显减少结扎冠状动脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积，并可降低由心肌缺血造成的肢体导联心电图J点的升高。丹参酮乳剂对心肌具有保护作用，能降低缺血引起的心肌损伤。中、高剂量组与丹参酮II-A磺酸钠注射液组相比有显著性差异。
表5丹参酮乳剂对大鼠心肌缺血损伤的影响(n＝10，X±s)
注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与丹参酮II-A磺酸钠注射液组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
试验例5.丹参酮乳剂对体外培养肿瘤细胞增殖的抑制作用
1.材料及试验方法
药物临用前以完全培养液配成相应浓度。RPMI1640培养基GIBCO公司生产。新生牛血清(超级)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生产批号000528。胰蛋白酶，Sigma公司生产。MTT，Sigma公司。注射用链霉素，山东瑞阳制药有限公司，1g(100万单位)/支，批号200105123。注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司，80万单位/支，批号L020312。其它常用化学试剂为国产分析纯。
细胞株人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌细胞株H08910、人前列腺癌胞PC-3M、人肺腺癌细胞株A549、人结肠癌细胞株HCT-8、人食管癌细胞株CaEs-17、人脑胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株SGC-7901、人早幼粒白血病细胞株HL60，均购自中国医学科学院药物研究所药理室。
仪器CO2培养箱，超净工作台，酶标仪，倒置显微镜，细胞培养瓶(Costar，USA)，96孔细胞培养板(Costar，USA)。
软件Microsoft Excel 7.0统计分析软件；Microcal Origin 6.0数据处理软件。
实验方法RPMI1640培养基一袋加水一升，补加2g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22um除菌滤膜过滤除菌。90ml培养基加灭活新生牛血清10ml即为完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液溶解后过滤除菌。
所有细胞均培养于含5ml完全培养液细胞培养瓶中，37℃、5％CO2、饱合湿度下。贴壁细胞以0.25％胰蛋白酶消化后传代，悬浮细胞1000rpm离心10min后弃原培养液加新鲜培养液传代。
贴壁培养细胞胰蛋白酶消化后，悬浮细胞离心后，加完全培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数活细胞数目，用完全培养液调整细胞数目至1×105个细胞/ml。将细胞加入到96孔培养板，每孔100μl。加完细胞的培养板于CO2培养箱中培养12小时后倒掉原培养液，于96孔板中加入各组药物的完全培养液，药物浓度最高为20μg/ml，按0.5倍倍比稀释，共设3个浓度梯度，另设不含药组为对照组，每个处理设四个平行孔。振荡混匀后放入培养箱中继续培养48h。培养结束后，取出培养板，倒掉原培养液，加入100μl含0.5mg/ml MTT的RPMI1640培养液，继续在培养箱中放置4h，取出培养板，小心吸去培养板孔中上清，加入150μl DMSO，振荡使蓝紫色甲臜结晶充分溶解。于Bio-TEK Synergy HT酶标仪上测定每孔光吸收，测定波长570nm，参考波长630nm。根据各孔光吸收值计算药物对细胞增殖的抑制率。
根据药物浓度对数和对应的抑制率，利用Micro Origin软件作线性回归，根据直线方程求出药物对细胞的半抑制浓度(IC50)。
2.结果见表6。
表6 丹参酮乳剂对体外培养的肿瘤细胞增殖的抑制作用(IC50，μg/ml)
结果表明，丹参酮乳剂各剂量组均可明显抑制多种人源肿瘤细胞株的体外增殖，其半抑制浓度IC50均小10μg/ml。且优于丹参酮II-A磺酸钠注射液组。
试验例6.丹参酮乳剂抑制小鼠体内移植瘤生长的抑制作用
1.材料与方法
动物及瘤株昆明种小白鼠，体重18-22g，雄性。C57BL/6纯系小鼠，体重18-22g，雄性。小鼠S180肉瘤、H22肝癌、Lewis肺癌、U14宫颈癌均由中国医学科学院药物研究所药理室引进。
实验方法S180、H22和U14肿瘤均于昆明种小鼠腹腔内传代，一般传代后7天长出腹水。无菌注射器取出腹水后用注射用生理盐水稀释3倍后，接种于昆明种小鼠腋下皮下，0.2ml/只。Lewis肺癌于C57BL/6小鼠腋下传代，接瘤后10天左右，取生长状态良好瘤组织，加入5倍量生理盐水后研磨成匀浆，过100目筛得瘤细胞悬液，接种于C57BL/6小鼠腋下，0.2ml/只。接瘤后第二天给药。连续给药10天，末次给药后24小时，脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织称重，计算抑瘤率。
2.结果丹参酮乳剂各剂量组皆可以明显抑制小鼠体内移植瘤的生长。且优于丹参酮A磺酸钠注射液组。详见表7。
表7 丹参酮乳剂对小鼠体内移植瘤生长的抑制作用
注各组瘤重与模型组比较**P＜0.01。与丹参酮II-A磺酸钠注射液组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
试验例7丹参酮乳剂对肝纤维化的影响
1.实验动物及分组，雄性SD大鼠，体重170-230g，将实验动物随机分为5组正常对照组、模型组、丹参酮乳剂不同剂量组，每组10只。
2.实验方法
大鼠肝纤维化模型复制及各组处置方法参考吴孟超等复制大鼠肝纤维化模型的方法吴孟超，杨广顺.大鼠肝硬变模型复制的研究.中华实验外科杂志，1984，1(4)145-147，每4d每100g体重皮下注射60％四氯化碳油溶液0.3ml，以5％乙醇水溶液作为溶剂。正常对照组大鼠每4d皮下注射油溶液0.3ml/100g体重，1周后，隔日灌服自来水0.3ml/100g体重，每日腹腔注射灭菌水0.1ml/100g体重(每周6次)，以自来水作为饮料；肝纤维化组大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自来水0.3ml/100g体重，每日腹腔注射灭菌水0.1ml/100g体重(每周6次)；丹参酮乳剂组大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自来水0.3ml/100g体重，每日腹腔注射丹参酮乳剂2mg/100g体重(每周6次)。第4、8周末，各组随机抽取6只动物，用25％乌拉坦溶液按150mg/100g体重腹腔注射麻醉，解剖，门静脉采血，留取肝组织，部分用10％中性福尔马林溶液固定，24-48h内制石蜡块。
观察指标及测定方法肝组织病理学检查采用HE染色，纤维增生程度分为0-4级栗坤，赵玉珍，朱秋霜等.川芎嗪对老龄小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影响.黑龙江医药科学，1998；214-5。用放射免疫方法测定血清透明质酸含量，透明质酸放射免疫分析测定盒购自上海海研医学生物技术中心，所用仪器为SN-695A型智能放免γ测量仪。肝组织中羟脯氨酸测定采用氧化法，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
3.实验结果
病理学检查正常对照组大鼠肝脏结构正常；模型组大鼠肝脏4周末及8周末均出现明显的纤维化；丹参酮乳剂各剂量组中纤维化程度均较模型组轻。
大鼠血清中透明质酸含量4周末与8周末，除大剂量组8周时间点外，丹参酮乳剂其他时间点大鼠血清透明质酸含量均较模型组低，差异显著(表8)。
表8 丹参酮乳剂对肝纤维化大鼠血透明质酸含量(μg/L)的影响
注△，与正常对照组比较，P＜0.05；▲与模型组比较，P＜0.05；▲▲P＞0.05。
大鼠肝组织中胶原蛋白含量4周末，丹参酮乳剂各剂量组大鼠肝组织中胶原蛋白含量低于肝纤维化组，差异显著；8周末时，较模型组亦低，但大剂量组差异不显著(见表9)。
表9 丹参酮乳剂对肝纤维化大鼠肝组织胶原蛋白含量(mg/g肝粉)的影响
注△，与正常对照组比较，P＜0.05；▲，与模型组比较，P＜0.05；▲▲，与模型组比较，P＞0.05。
试验例8丹参酮乳剂对醛糖还原酶(AR)活性的影响
1.试验方法
分组同前。造模方法采用四氧嘧啶(100mg/kg)诱发糖尿病。实验第16周时将大鼠断头处死，取肾脏剔除附着物，捣碎取匀浆，供测定AR活性用。
AR活性测定方法即记录NADPH在340nm处吸收光值下降10U来表示酶活性。本研究使用的反应体系67mmol/L、pH6.2的Na+-K+-磷酸缓冲液、10mmol/L的DL-甘油醛、5mmol/L的2-巯基乙醇、0.1mmol/L的NADPH和酶适量；实验杯包括全部试剂，对照杯以双蒸水代替底物DL-甘油醛。
测定组织匀浆酶活性，同时测定蛋白含量，一单位酶活性规定为1min产生1μmolNADP+的酶量，各组织酶活性用比活性进行比较，比活性＝酶单位/mg蛋白。
2.结果
糖尿病鼠模型组其AR活性显著高于正常组(P＜0.01)，使用丹参酮乳剂后AR活性明显下降，与模型组相比，P值均＜0.01；虽然各治疗组AR活性仍高于正常组，但与正常组相比较无显著性差异(P＞0.05)。见表10。
表10 实验各组AR活性变化比较
注与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；##P＜0.01。
试验例9丹参酮乳剂对肺纤维化大鼠模型的影响
1.造模方法
分组同前。用无菌配置的1.5％戊巴比妥纳对大鼠进行腹腔麻醉(2.5ml/kg体重)，以无菌操作行颈部正中切口，采用钝行分离法暴露气管，经气管穿刺向肺部缓慢注入无菌生理盐水配置的浓度为4mg/ml的博莱霉素A5(BLMA5)溶液0.2～0.3ml(BLMA5剂量为5mg/kg体重)，立即直立旋转动物，使药液在肺内分布均匀。正常对照组注入等量无菌生理盐水。
2.观察指标采集腹主静脉血样，用EDTANa2抗凝，分离血浆，-20℃冻存，待检。测定血浆TNF-α、NO、MDA的含量及SOD的活性，均严格按相应的试剂盒说明书操作。
3.结果
丹参酮乳剂各剂量皆可降低实验性肺纤维化大鼠血浆TNF-α、NO、MDA含量，提高SOD活性，对博莱霉素致大鼠的肺损伤具有一定保护作用。见表11。
表11 实验各组TNF-α、NO、MDA的含量及SOD的活性变化比较
注与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；##P＜0.01。
试验例10丹参酮乳剂对大鼠慢性肾炎模型的影响
1.造模方法
分组同上。采用抗Thy-1抗体制备大鼠系膜增生性肾炎模型(兔抗鼠Thy-1抗血清(ATS)的制备参照文献陈广平，郭慕依，张月娥，等.大鼠Thy-1抗血清制备及系膜增生性肾炎模型的建立.临床与实验病理学杂志，1996，3241，参照上述文献方法，将正常组外各组大鼠由尾静脉注射ATS1ml/100g，每周1次，连续4周。
2.给药方法
在首次注射ATS后的第2天开始给药。
3.观察指标第4周末行眼球摘除采血后，即刻剖腹取肾脏。
3.1一般情况
大鼠的精神状态、体重、体毛、饲料量、饮水量、二便及活动情况等。
3.2免疫荧光学检查
取小块肾皮质组织作冰冻切片，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠IgG(Sigma公司，效价1:64)作直接荧光染色，AO one-twenty荧光显微镜观察。荧光强度分级标准参照文献邹万忠.肾脏病理与临床.长沙湖南科学技术出版社，1993.9-10，26-27。
3.3光学显微镜观察
取部分肾组织用10％中性甲醛固定，阶梯乙醇脱水，石腊包埋，切片，作苏木素伊红染色(HE)和过碘酸雪夫氏反应染色(PAS)，光学显微镜下进行观察、拍照。对每例标本任选10个肾小球，计数每个肾小球的细胞数，测量每个肾小球的长径，并记录系膜增生程度，其分级标准参照文献邹万忠.肾脏病理与临床.长沙湖南科学技术出版社，1993.9-10，26-27。
3.4电子显微镜观察
每组取3只大鼠肾脏1mm2大小3块作电镜观察，常规用2％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，阶梯乙醇脱水，环氧树脂EPON812包埋，超薄切片，并行铀和铅双重染色后，置JEM-1200EX透射电镜下观察，拍照记录。
4.实验结果
4.1一般情况
在实验过程中模型组有1例大鼠死亡，造模之各组大鼠均出现不同程度的精神不振、摄食减少、生长迟缓、身体消瘦、蜷缩、体毛无光泽、大便稀烂等现象，以模型组最为显著.
4.2光镜检查
结果显示正常对照组有1例见肾小球毛细血管轻度充血，余无异常。模型组肾小球内系膜细胞均有增生，系膜基质增宽，并可见少量中性粒细胞浸润。基底膜未见明显增厚。大部分肾小球增大，肾球囊闭塞。近曲小管上皮细胞呈中度或重度细胞内水肿，部分肾小管腔内见蛋白。各治疗组系膜增生现象有减轻，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转，肾小管内蛋白消失。详见表12-14。
表12 各组大鼠免疫荧光检查结果比较(n＝10)
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表13 各组肾小球内细胞数、肾小球大小的比较(x±s)
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表14 各组大鼠系膜增生程度比较(n＝10)
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
4.3电镜检查
结果显示正常组细胞结构完整。模型组系膜区显著增宽，系膜细胞和系膜基质增生，有云雾状电子致密物在系膜区沉积部分足突融合，毛细血管基底膜基本正常。各治疗组病理改变轻于模型组，以丹参酮乳剂高剂量组病变最轻，中、低剂量组次之。
5.结论
丹参酮乳剂对大鼠慢性肾炎模型的肾脏病理损害有治疗作用。
试验例11丹参酮乳剂对大鼠慢性肾功能不全模型的影响
1.造模方法
除正常对照组外，其余各组大鼠采用Plant法，行5/6肾大部分切除术制作慢性肾衰大鼠模型用1％戊巴比妥钠溶液按30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，将其固定于鼠台上，腰背部剃毛，酒精消毒后，于脊柱左侧作切口，打开腹腔，暴露左肾，剥离肾包膜，以无菌缝线结扎左侧肾蒂，切除左肾上下极和外侧缘，局部以明胶海绵止血，以甲硝唑注射液冲洗腹腔以防止感染，然后逐层缝合肌肉和皮肤。1周后结扎右肾动脉后切除右肾。切除之肾组织称重，间接估算左残肾重量，要求肾组织平均切除率为80％左右。
2.分组及给药
雄性SD大鼠，体重170-230g，将实验动物随机分为5组假手术组(给予手术，但并未切除肾脏)、模型组、保护组(两次术后第2天即开始给予丹参酮乳剂6mg/kg)、丹参酮乳剂不同剂量组(两次术后1周开始给予丹参酮乳剂3、6、12mg/kg)，每组10只。疗程8周。每2周称体重1次，以调整大鼠给药量。
3.观测指标
3.1一般情况主要观察精神状态、活动度、毛发光泽度、饮食、体重等。
3.2肾功能检测用药8周后称重，股静脉取血8ml收集于试管中静置1h，分离血清，用自动生化仪测定血肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)水平。处死动物，快速摘取残余肾脏(正常对照组大鼠取双肾全重的1/6进行比较)，去除筋膜等肾外组织，盐水冲洗后滤纸吸干水分，电子天平称重，计算肾重/体重比。
4.结果
4.1一般情况正常对照组动物表现机警，反应快，皮毛致密，整齐而有光泽，饮食正常；造模后各组动物精神萎靡，活动迟缓，皮毛蓬松，枯槁无光泽，食欲不振。其中模型对照组最为明显，丹参酮乳剂各剂量组及保护组优于模型对照组。
4.2肾功能检测造模后，模型组大鼠血清肌酐、尿素氮明显高于正常对照组(P＜001)，治疗后，丹参酮乳剂各剂量组及保护组血清Cr、BUN明显下降。尽管与正常组比较仍有差异(P＜001)，但已经显著低于模型对照组，尤以丹参酮乳剂大剂量组及保护组对BUN的改善较为明显(P＜005)，丹参酮乳剂大剂量组Cr的降低亦非常明显(P＜001)。
造模后各组残余肾代偿性肥大明显，与正常组比较差异有非常显著性(P＜001)，而大鼠体重则有所下降，尤以模型组体重下降明显(与正常组比较P＜005)，丹参酮乳剂各剂量组和保护组则与正常对照组比较没有明显差别；此外，造模后各组大鼠肾重/肾体重比明显增高，与正常对照组比较差异有非常显著性(P＜001)，而保护组则有所降低(与模型组比较，P＜005)，提示丹参酮乳剂能够改善慢性肾衰大鼠体重下降，并具有预防性阻止肾代偿性肥大的作用。
详见表15。
表15 丹参酮乳剂对慢性肾衰大鼠肾功能的影响(x±s)
注与模型组比，**P＜001；与正常对照组，#P＜005，##P＜001。
5.结论
丹参酮乳剂3、6、12mg/kg具有延缓慢性肾功能不全进展的作用。
试验例12丹参酮乳剂对AD模型大鼠学习记忆力的影响
1.Aβ1-40诱导大鼠AD样病变模型的制备及分组
应用凝聚态β淀粉样肽1～40片段(Aβ1-40)注入大鼠海马内建立AD样病变的动物模型。具体如下
SD雄性大鼠共50只，清洁2级，体重250～300g。SD大鼠经麻醉后于立体定位仪下以Aβ1-40行双侧海马内注射，每侧各1μl(预先将Aβ1-40溶于无菌生理盐水10μg/μl，用前37℃下孵育1周)。注射部位为前囟后3.5mm，脑正中线旁开2.0mm，其深度为2.7mm。
大鼠随机分为5组(1)Aβ1-40处理模型组；(2)丹参酮乳剂低剂量治疗组(3mg/kg)；(3)丹参酮乳剂中剂量治疗组(6mg/kg)；(4)丹参酮乳剂高剂量治疗组(12mg/kg)；(5)假手术对照组即海马内注射等量生理盐水。
给药方法各组动物于造模前一周开始静脉注射给药，每天1次，连续3周。迷宫训练期间，于训练前0.5h给药。
2.观察指标与方法
空间学习记忆力测试采用Morris水迷宫法。平台设于迷宫东北象限正中，水平面高出平台1.5cm，水温保持在19℃～20℃，大鼠连续训练5d，每天2次，设定最长游动时间为70s，以秒表记时，记录大鼠找到平台所需时间(潜伏期，EL)。
3.结果
对AD大鼠空间学习记忆力的影响随训练天数增加，各组大鼠平均EL逐渐缩短。与假手术组比较，模型组大鼠EL明显延长，第4天开始差异显著(P＜0.05)，说明造模成功。与模型组比，丹参酮乳剂3mg/kg组大鼠于第4天开始EL明显缩短，6mg/kg组则于第3天开始EL明显缩短，12mg/kg组则于第2天即开始EL明显缩短，皆差异显著；12mg/kg组第5天则有极显著性差异。表明丹参酮乳剂各剂量组均能显著改善Aβ1-40相诱导的大鼠空间学习记忆障碍，且呈剂量依赖性。详见表16。
表16 丹参酮乳剂对实验性AD模型大鼠空间辨别学习记忆能力的影响
注与AD模型组比较，*P＜0.05**P＜0.01。


一种含丹参酮的药用组合物及制备方法，该组合物包括丹参酮、油、乳化剂和水。该组合物可制成口服乳剂与静脉乳剂。可用于治疗或预防感染、缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、缺血性心脏病、肿瘤、肝纤维化、糖尿病并发症、肺纤维化、慢性肾炎、慢性肾功能不全、阿尔茨海默病。