含有一氧化碳和氢气的气态底物的发酵操作方法[0002]使用某些细菌例如来自于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)的细菌，在含有适合的营养物和微量矿物质的培养基中，从包含一氧化碳和氢气的气态底物的微生物发酵生产化学物质例如有机酸如乙酸和醇如乙醇的方法，已得到证实。例如，Gaddy等的美国专利号5,173, 429 公开了杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii ) ATCC N0.49587, 一种从合成气体生产乙醇和乙酸盐的厌氧微生物。Gaddy等的美国专利号5，807，722公开了使用厌氧细菌例如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC N0.55380将废气转化成有用产物例如有机酸和醇的方法和装置。 Gaddy等的美国专利号6，136，577公开了使用厌氧细菌例如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC N0.55988和55989将废气转化成有用产物例如有机酸和醇(特别是乙醇)的方法和装置。[0003]美国专利申请号20070275447公开了一种梭状芽胞杆菌属菌种(食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans), ATCC BAA-624, “P7”)，其能够从废气合成可用作生物燃料的产物。美国专利号7，704，723公开了一种梭状芽胞杆菌属菌种(拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)，ATCC BAA-622，“P11”)，其能够从废气合成可用作生物燃料的产物。[0004]W02007/117157 公开了产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(登记号DSM10061，DSMZ，德国)在通过含一氧化碳的底物的厌氧发酵来生产乙醇中的应用。W02009/064200公开了通过含一氧化碳的底物的厌氧发酵来生产乙醇的另一种细菌(产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum),登记号 DSM19630, DSMZ,德国)。[0005]正如在本【技术领域】中所描述的，化学物质例如醇的生产速率取决于发酵培养基中微生物细胞的密度(“细胞密度”)。为了获得并维持化学物质的高生产速率，需要在生物反应器中具有足够高的细胞密度。[0006]Gaddy的美国专利号6，136,577公开了一种在发酵过程中生产乙醇的方法，其中使用细胞再循环来提高细胞密度。[0007]Gaddy等的美国专利号7，285，402公开了一种用于生产醇的厌氧微生物发酵方法，其中提出了在启动期间使用储用培养物来提高细胞密度的方法，其中存在过量的H2。[0008]使用来自于储用培养物的分批接种物进行启动确保了不含污染物的健康的接种物，但是作为接种程序不总是成功的，这是因为使用的细胞密度相当低，特别是如果在接种后就立即将方法参数例如气体速率和搅拌速率快速提高的话。
[0009]目前，在本【技术领域】中，对在气态底物的微生物发酵中提高细胞密度的改进方法存在着需求。本公开提供了以更快的速率为气态底物的微生物发酵方法提高细胞密度的方法。


[0010]作为一种实施方式，本公开提供了一种从气态底物生产一种或多种醇的方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物在生物反应器中的水性培养基中发酵；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中搅拌包括大于或等于目标搅拌速率；其中所述目标搅拌速率包括IOrpm至IOOOrpm的搅拌器速度；其中包括增加气态底物的流量，其中所述CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率；其中包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率；其中所述生物反应器包含一个或多个反应器；其中所述生物反应器包含细胞再循环；其中将营养培养基流添加到生物反应器中。
[0011]在一种实施方式中，所述水性培养基包含下列一种或多种:生物纯的厌氧产乙酸微生物，天然存在的厌氧产乙酸微生物，非天然存在的厌氧产乙酸微生物，通过遗传修饰产生的非天然存在的厌氧产乙酸微生物，天然存在的厌氧产乙酸微生物的突变体，非天然存在的厌氧产乙酸微生物的突变体。
[0012]作为一种实施方式，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到生物反应器中的水性培养基中；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率之间的差值包括大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值；其中包括增加气态底物的流量，其中CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率；其中包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率。
[0013]作为一种实施方式，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2) 的气态底物添加到包含搅拌的生物反应器中的水性培养基中；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以预先选定的速度步阶提高搅拌；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值；其中包括提高搅拌，其中CO转化率超过在0%至25%范围内的第二 CO转化率；其中包括提高搅拌，其中H2转化率超过在0%至25%范围内的第二 H2转化率。
[0014]作为一种实施方式，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中所述搅拌器的速度包括大于或等于在IOrpm至IOOOrpm范围内的目标速度。
[0015]本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中搅拌包括大于或等于目标搅拌速率；其中所述目标搅拌速率包括IOrpm至IOOOrpm的搅拌器速度。
[0016]本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中所述搅拌器的速度包括大于或等于在IOrpm至IOOOrpm范围内的目标速度。
[0017]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中所述CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率。
[0018]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率。
[0019]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率之间的差值包括大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
[0020]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率之间的差值包括大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
[0021]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率。
[0022]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率。
[0023]此外，本公开提供 了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以预先选定的速度步阶提高搅拌；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值；包括提高搅拌，其中CO转化率超过在0%至25%范围内的第二 CO转化率；包括提高搅拌，其中H2转化率超过在0%至25%范围内的第二 H2转化率。
[0024]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以在Orpm至200rpm范围内的预先选定的速度步阶提高所述搅拌器的速度；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
[0025]作为一种实施方式，本公开的方法包括提高所述搅拌器的速度，其中CO转化率超过在0%至25%范围内的第二 CO转化率。
[0026]作为一种实施方式，本公开的方法包括提高所述搅拌器的速度，其中H2转化率超过在0%至25%范围内的第二 H2转化率。
[0027]作为一种实施方式，本公开的所述微生物包含一种或多种微生物，所述微生物包括:生物纯微生物，天然存在的微生物，非天然存在的微生物，通过遗传修饰产生的非天然存在的微生物，天然存在的微生物的突变体，非天然存在的微生物的突变体，重组微生物，工程改造的微生物，人工合成的微生物；其中所述微生物包含选自下列的微生物:凯伍产乙酸菌(Acetogenium kivui)，伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)，潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum),Caldanaerobacter subterraneous， Caldanaerobacter subterraneous pacificus， 生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus Hydrogenoformans),醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum) (DSM23693),产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ的 DSM19630)，产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ 的 DSM10061)，热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)，粘液真杆菌(Eubacterium Iimosum),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC49587)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2 (ATCC55380)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-Ol (ATCC55988)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC55889), Clostridium ultunense，拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPll (ATCCBAA-1772), Clostridium coskatii，食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7 (ATCC PTA-7827)，硫还原泥土 杆菌(Geobacter sulfurreducens), Morrellathermacetica，产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)，Clostridiumdrakei，重组微生物(DSM24138)及其混合物；其中所述微生物包含一种或多种杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株，或一种或多种拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株，或一种或多种食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株，或一种或多种产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株；其中所述微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个所选基因插入到选自任何杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株或任何拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株的宿主生物体中而产生；其中所述微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个来自于任何杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株或任何`拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)菌株的基因插入到任何宿主生物体中而产生。
[0028]作为一种实施方式，本公开提供了包含一个或多个反应器的所述生物反应器；其中所述生物反应器包含细胞再循环；其中将营养培养基流添加到生物反应器中。



[0029]图1是示意图，其示出了气态底物的微生物发酵方法的实施方式。
[0030]定义
[0031]除非另有定义，否则在本公开的整个说明书中使用的下列术语如下所定义，并且可以包括下面所确定的定义的单数或复数形式:
[0032]修饰任何量的术语“约”是指在维持微生物培养的真实世界条件中例如在实验室、中试厂或生产设施中所遇到的所述量的变差。例如，当被“约”修饰时，混合物或参量中釆用的成分或测量结果的量包括在生产厂或实验室中的实验条件下测量时的变差和通常所采用的关注程度。例如，当被“约”修饰时，产物组分的量包括在工厂或实验室的多次实验中不同批次之间的变差以及分析方法所固有的变差。不论是否被“约”修饰，量包括所述量的等效值。本文中所陈述的并被“约”修饰的任何数量也可以作为未被“约”修饰的量用于本公开中。
[0033]术语“产乙酸菌”或“产乙酸”是指产生乙酸盐作为厌氧呼吸产物的细菌。这一过程与乙酸盐发酵不同，尽管两者都在不存在氧气的条件下发生并且都产生乙酸盐。这些生物也被称为产乙酸细菌，因为所有已知的产乙酸菌都是细菌。产乙酸菌存在于多种生境中，一般为厌氧(缺乏氧气)的生境。产乙酸菌能够利用多种化合物作为能源和碳源；研究最透彻的产乙酸代谢包括使用二氧化碳作为碳源并使用氢气作为能源。
[0034]术语“生物反应器”、“反应器”或“发酵生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管线排列构成的发酵装置，其包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适合于气-液接触的其他装置。对于本公开的方法来说，发酵生物反应器可以包括生长反应器，生长反应器将发酵液进料到第二发酵生物反应器，在第二发酵生物反应器中产生大部分的产物乙醇。
[0035]术语“转化率”是指被转化成产物的输入量的分数；这用下述方程表示:(输入
量-输出量)/ (输入量)。
[0036]术语“发酵”是指CO发酵成醇和乙酸盐。已知许多细菌能够实现将CO发酵成包括丁醇和乙醇的醇以及乙酸，并且适合于在本公开的方法中使用。适合在本公开中使用的这样的细菌的实例包括梭状芽孢杆菌属的细菌，例如杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)菌株，包括在 W02000/68407、EP117309、美国专利号 5，173, 429,5, 593,886和 6，368，819.W01998/00558 和 W02002/08438 中所描述的菌株；产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)菌株(德国 DSMZ 的 DSM10061 和 DSM19630)，包括在 W02007/117157和W02009/151342中所描述的菌株；以及拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei) (P11,ATCC BAA-622 )，包括分别 在美国专利号7，704, 723和“来自于生物质产生的合成气体的生物燃料和生物产物”(Biofuels and Bioproducts from Biomass-GeneratedSynthesis Gas, Hasan Atiyeh,在 Oklahoma EPSCoR Annual State Conference 上的报告，2010年4月29日)中所描述的；以及在美国专利申请号20070275447中所描述的食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans) (ATCC BAA-624)0 其他适合的细菌包括穆尔氏菌属(Moorella)的细菌，包括Moorella sp HUC22-1 ;以及一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)的细菌。这些出版物中每一个的公开内容在此全部引为参考。此外，本领域技术人员可以选择其他细菌用于本公开的方法中。还应该认识到，在本公开的方法中可以使用两种或更多种细菌的混合培养物。适合用于本公开的一种微生物是产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。发酵可以在任何适合的生物反应器中进行,例如连续搅拌釜式反应器(CTSR)、鼓泡塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)。此外，在本公开的某些优选实施方式中，生物反应器可以包含培养微生物的第一生长反应器，以及来自于生长反应器的发酵液被进料到其中并在其中产生大部分的发酵产物(乙醇和乙酸盐)的第二发酵反应器。
[0037]术语“发酵液”是指发酵培养基的组合物，其包含结束时发酵液中的任何物质，包括:原始底物，发酵产物，微生物和产生的组分，化学添加剂，营养物，气体。发酵液中存在所有三种主要相:固相、液相和气相，并且它们可能相互作用。
[0038]术语“流量系数”是指提议的气态进料的量除以当前的气态进料的量。
[0039]术语“微生物”包括细菌、真菌、酵母、古菌和和原生生物；微生植物(被称为绿藻)；以及动物例如浮游生物、真涡虫和变形虫。有些人认为还包括病毒，但其他人认为它们没有生命。微生物生活在生物圈中有液体水的所有部分中，包括土壤、温泉、海底、大气层高处和地壳内岩石深部。微生物对于生态系统中营养物质的再循环来说是关键的，因为它们起到分解者的作用。微生物也被人类用于生物技术中，既被用在传统食品和饮料的制备中，也被用在基于遗传工程的现代技术中。设想了在本公开中使用可能含有或可能不含各种微生物菌株的混合菌株微生物。此外，据设想，定向进化能够选择性筛选可以在本公开中使用的微生物。还设想了重组DNA技术能够使用现有微生物的所选菌株来产生微生物。此外，化学诱变技术(使用各种化学物质来突变细菌DNA)能够使用现有微生物的所选菌株来产生微生物。还设想了在本公开中使用能够将CO和水或H2和CO2转化成乙醇和乙酸产物的细菌。可用的细菌的一些实例包括凯伍产乙酸菌(Acetogeniumkivui),伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii ),潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae),食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum), Caldanaerobacter subterraneous,Caldanaerobacter subterraneous pacif icus,生氢一氧化碳嗜热菌(CarboxydothermusHydrogenoformans),醋酸梭菌(Clostridium aceticum),丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum),产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSM23693),产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ 的 DSM19630),产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(德国 DSMZ 的 DSM10061),热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum),粘液真杆菌(Eubacterium Iimosum),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC(ATCC49587),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ERI2 (ATCC55380),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-Ol (ATCC55988),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)0-52 (ATCC55889), Clostridium ultunense,拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)Pll (ATCCBAA-622),Alkalibaculum bacchi CP1KATCCBAA-1772),Clostridium coskatii,食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7(ATCC PTA-7827),硫还原泥土杆菌(Geobactersulfurreducens), Morrella thermacetica,产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus), Clostridium drakei,重组微生物(DSM24138)及其混合物。
[0040]术语“营养培养基”包含微生物生长培养基，其可以含有允许所选微生物生长的一种或多种维生素和矿物质。适合于本发明使用的多种营养培养基的组分是已知的，并被报告在以前的出版物例如国际专利申请号W02008/00558、美国专利号7，285，402、美国专利号5，807，722、美国专利号5，593，886和美国专利号5，821，111中。
[0041]术语“合成气”或“合成气体”是指为含有可变量的一氧化碳和氢气的气体混合物所命名的合成气体。生产方法的实例包括用于生产氢气的天然气或烃的蒸汽重整、煤的气化、以及在某些类型的废物变能源的气化设施中。该名称来自于它们作为中间体在产生合成天然气(SNG)和生产氨或甲醇中的用途。合成气还在通过费-托(Fischer-Tropsch)合成法或以前的Mobil甲醇制汽油方法来生产用作燃料或润滑剂的合成石油的过程中用作中间体。合成气主要由氢气、一氧化碳和通常还有一些二氧化碳构成。
[0042]本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中搅拌包括大于或等于目标搅拌速率；其中所述目标搅拌速率包括IOrpm至IOOOrpm的搅拌器速度。
[0043]本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中所述搅拌器的速度包括大于或等于在IOrpm至IOOOrpm范围内的目标速度。
[0044]作为一种实施方式，搅拌的手段或进行搅拌的手段可以通过机械搅拌器、机械搅拌机、液体再循环、液体循环泵送、液体注入、气体注入等来实现。
[0045]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中所述CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率。
[0046]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率。
[0047]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率之间的差值包括大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
`[0048]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率；测量H2转化率；以在1.0至
2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率之间的差值包括大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
[0049]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中CO转化率超过在25%至95%范围内的第一 CO转化率。
[0050]作为一种实施方式，本公开的方法包括增加气态底物的流量，其中H2转化率超过在25%至95%范围内的第一 H2转化率。
[0051]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以预先选定的速度步阶提高搅拌；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值；包括提高搅拌，其中CO转化率超过在0%至25%范围内的第二 CO转化率；包括提高搅拌，其中H2转化率超过在0%至25%范围内的第二 H2转化率。
[0052]此外，本公开提供了一种气态底物发酵方法，所述方法包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以在Orpm至200rpm范围内的预先选定的速度步阶提高所述搅拌器的速度；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值。
[0053]作为一种实施方式，本公开的方法包括提高所述搅拌器的速度，其中CO转化率超过在0%至25%范围内的第二 CO转化率。
[0054]作为一种实施方式，本公开的方法包括提高所述搅拌器的速度，其中H2转化率超过在0%至25%范围内的第二 H2转化率。
[0055]作为一种实施方式，本公开的所述微生物包含一种或多种生物纯的厌氧产乙酸细菌；其中所述微生物包含一种或多种天然存在的厌氧产乙酸细菌；其中所述微生物包含一种或多种非天然存在的厌氧产乙酸细菌；其中所述微生物包含一种或多种使用厌氧产乙酸细菌作为宿主生物体通过遗传修饰产生的非天然存在的厌氧产乙酸细菌；其中所述微生物包含一种或多种通过将厌氧产乙酸细菌的基因插入到宿主生物体中产生的非天然存在的厌氧产乙酸细菌；其中所述微生物选自一些有用细菌的实例，包括:凯伍产乙酸菌(Acetogenium kivui),伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii),潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methy lotrophi cum),Caldanaerobacter subterraneous， Caldanaerobacter subterraneous pacificus， 生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus Hydrogenoformans),醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum) (DSM23693),产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ的 DSM19630)，产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ 的 DSM10061)，热醋梭菌(Clostridium thermoace ticum)，粘液真杆菌(Eubacterium Iimosum),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC49587)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2 (ATCC55380)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-Ol (ATCC55988)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC55889), Clostridium ultunense，拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPll (ATCCBAA-1772), Clostridium coskatii，食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7 (ATCC PTA-7827),硫还原泥土 杆菌(Geobacter sulfurreducens), Morrellathermacetica，产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus), Clostridiumdrakei，重组微生物(DSM24138)及其混合物；其中所述微生物包含一种或多种杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株，或一种或多种拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株，或一种或多种食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株，或一种或多种产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株；其中所述微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个所选基因插入到选自任何杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株或任何拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株的宿主生物体中而产生；其中所述微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个来自于任何杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株或任何拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)菌株的基因插入到任何宿主生物体中而产生。
[0056]作为一种实施方式，本公开提供了包含一个或多个反应器的所述生物反应器；其中所述生物反应器包含细胞再循环；其中将营养培养基流添加到生物反应器中。
[0057]图1显示了通过用细菌发酵从包含一氧化碳(CO)的气态底物例如合成气生产化学物质例如醇产物混合物的方法，其中所述方法包含生物反应器(100)，所述生物反应器含有包含所述细菌细胞和发酵培养基的发酵液。包含含有CO的气态底物的气态料流(101)可以与发酵培养基料流(102) —起被进料到生物反应器中。可以从所述生物反应器移除包含所述细菌细胞和所述化学物质产物的发酵液料流(110)。包含含有气态底物的所述气态料流的未使用部分的发酵罐排放气料流(120)，从生物反应器排出。在一种实施方式中，发酵液料流(110 )流向细胞再循环装置(200 )，在其中将细胞浓缩并返回(220 )到生物反应器。来自于所述细胞再循环装置的渗透液料流(210)被导向回收所述化学物质的过程(在图上未不出)。在一种实施方式中，将发酵液料流(I 10)导向回收所述醇产物混合物的过程(在图上未示出)。
[0058]在一种实施方式中，生物反应器(100)装备有提供搅拌的搅拌器(105)，以便促进包含气态底物的气态料流与液体发酵培养基的接触并增强气态底物与液体发酵培养基的质量传递。在整个发酵过程中获得良好的质量传递速率是合乎需要的，因此，在生物反应器中获得足够搅拌是合乎需要的。
[0059]存在有用于收集被导入到生物反应器中的包含气态底物的气态料流(101)和离开生物反应器的排放气(120)的样品的配置(在图1中未示出)。存在有用于收集生物反应器的发酵液样品的配置(在图1中未示出)。每隔一定时间收集所述气体和液体的样品，并分析各种气体组分的消耗或生产、各种产物的产量和发酵液的光密度。
[0060]使用下述方程，这些测量值可用于计算一氧化碳(CO)比摄入(SCT)和生物反应器中的发酵液中的细胞密度 :
[0061]CO 摄入，mmol/min= (mmol/min CO 输入)一(mmol/min CO 输出)(I)
[0062]细胞密度，g/L=(光密度).(稀释倍数).(细胞质量常数)(2)
[0063]细胞质量，g=(细胞密度).(生物反应器的体积)(3)
[0064]CO 比摄入，mmol/min/g= (CO 摄入)/ (细胞质量)(4)
[0065]细胞密度是每单位体积发酵液的细胞质量。生物反应器的体积是当搅拌关闭时生物反应器中的液体体积。细胞质量常数是光密度为I时每升发酵液的细菌干细胞的质量(g)。方程(2)中的光密度是将发酵液用适合的溶剂例如盐水稀释后获得的样品的实测光
山/又ο
[0066]在本公开的方法中使用的微生物可以包含一种或多种生物纯的厌氧产乙酸细菌。
[0067]在本公开的方法中使用的微生物可以包含一种或多种天然存在的厌氧产乙酸细菌；可以包含一种或多种非天然存在的厌氧产乙酸细菌；可以包含一种或多种使用厌氧产乙酸细菌作为宿主生物体通过遗传修饰产生的非天然存在的厌氧产乙酸细菌；可以包含一种或多种通过将厌氧产乙酸细菌的基因插入到宿主生物体中而产生的非天然存在的厌氧产乙酸细菌。
[0068]在本公开的方法中使用的微生物可以包含一种或多种选自下列的细菌:凯伍产乙酸菌(Acetogenium kivui),伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii),潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methy lotrophi cum),Caldanaerobacter subterraneous， Caldanaerobacter subterraneous pacificus， 生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus Hydrogenoformans),醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum) (DSM23693),产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ的 DSM19630)，产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国 DSMZ 的 DSM10061)，热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)，粘液真杆菌(Eubacterium Iimosum),杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC49587)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2 (ATCC55380)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-Ol (ATCC55988)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC55889), Clostridium ultunense，拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPll (ATCCBAA-1772), Clostridium coskatii，食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7 (ATCC PTA-7827),硫还原泥土 杆菌(Geobacter sulfurreducens), Morrellathermacetica，产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus), Clostridium drakei，重组微生物(DSM24138)及其混合物。
[0069]在一种实施方式中，在本公开的方法中使用的微生物包含一种或多种杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株，或一种或多种拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株，或一种或多种食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株，或一种或多种产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株。
[0070]在一种实施方式中，在本公开的方法中使用的微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个所选基因插入到选自任何杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株或任何拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)菌株的宿主生物体中而产生。
[0071]在一种实施方式中，在本公开的方法中使用的微生物包含一种或多种遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物通过将一个或多个来自于任何杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)菌株或任何拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)菌株或任何食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)菌株或任何产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)菌株的基因插入到任何宿主生物体中而产生。
[0072]本公开的方法的一种实施方式包括:将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以在Orpm至200印111范围内的预先选定的速度步阶提高所述搅拌器的速度；其中CO转化率与H2转化率的差值小于在0%至25%范围内的指定转化率差值。在一种实施方式中，CO转化率超过在0%至25%范围内的第一 CO转化率。在一种实施方式中，H2转化率超过在0%至25%范围内的第一 H2转化率。测量CO转化率和H2转化率以及提高所述搅拌器的速度的行动可以重复。在一种实施方式中，CO转化率高于H2转化率。在一种实施方式中，CO转化率低于H2转化率。在一种实施方式中，如果当前的搅拌速度低，以较小幅度提高搅拌速度，并且如果当前的搅拌速度高，以较大幅度提高搅拌速度。在一种实施方式中，如果当前的CO和H2转化率低，以较小幅度提高搅拌速度，并且如果当前的CO和H2转化率高，以较大幅度提高搅拌速度。例如，在一种实施方式中，在200rpm至400rpm的搅拌速度范围内，如果CO和H2转化率分别在20%至30%和10%至15%范围内，并且在数值上彼此在15%以内，将搅拌速度提高约50rpm。在400rpm至600rpm的搅拌速度范围内，如果CO和H2转化率分别在30%至50%和15%至35%范围内，并且在数值上彼此在15%以内，将搅拌速度提高lOOrpm。
[0073]本公开方法的一种实施方式包括将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以在当前值的1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率的差值小于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。在一种实施方式中，CO转化率超过在0%至25%范围内的第一 CO转化率。在一种实施方式中，H2转化率超过在0%至25%范围内的第一 H2转化率。
[0074]在一种实施方式中，在搅拌器速度的两次连续提高之间，增加气态底物的流速。在一种实施方式中，在搅拌器速度的每两次连续提高之间，增加气态底物的流速。在一种实施方式中，在搅拌器速度的交替的两次提高之间，增加气态底物的流速。
[0075]本公开方法的一种实施方式包括将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2转化率，并且以在当前值的1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中CO转化率与H2转化率的差值大于或等于在0%至25%范围内的指定转化率差值。在一种实施方式中，CO转化率超过在25%至95%范围内的第二 CO转化率。在一种实施方式中，H2转化率超过在25%至95%范围内的第二 H2转化率。
[0076]本公开方法的一种实施方式包括将包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的气态底物添加到包含搅拌器的生物反应器中的水性培养基中；所述水性培养基包含一种或多种微生物；所述方法包括测量CO转化率和H2 转化率，并且以在当前值的1.0至2.0范围内的预先选定的流量系数增加气态底物的流量；其中搅拌器速度大于或等于在IOrpm至IOOOrpm范围内的目标速度。在一种实施方式中，CO转化率超过在25%至95%范围内的第二 CO转化率。在一种实施方式中，H2转化率超过在25%至95%范围内的第二 H2转化率。测量CO转化率和4转化率以及以预先选定的流量系数增加气态底物的流量的行动可以重复。在不同的重复中，预先选定的流量系数的值可以不同。在一种实施方式中，使用低的流量系数值，其中H2转化率低；使用高的流量系数值，其中H2转化率高。例如，在一种实施方式中，可以使用在1.00至1.05范围内的流量系数，其中H2转化率高于45% ;可以使用在1.05至1.10范围内的流量系数，其中H2转化率高于50%;可以使用在1.10至1.15范围内的流量系数，其中H2转化率高于65% ;可以使用在1.15至1.20范围内的流量系数，其中H2转化率高于75%。
[0077]通常,在实验室规模的生物反应器例如New Brunswick Bioflow I生物反应器中，在300-900转/分钟(rpm)范围内的搅拌器速度提供足以获得所需质量传递速率的搅拌。在一种实施方式中，使用在500-700rpm范围内的搅拌器速度。在一种实施方式中，使用在550-650rpm范围内的搅拌器速度。在一种实施方式中，使用约600rpm的搅拌器速度。[0078]在一种实施方式中，对于较大规模的生物反应器例如尺寸为约100至500升的生物反应器来说，使用在约50rpm至约500rpm范围内的搅拌器速度进行搅拌。在一种实施方式中，对于尺寸为约100，000至约1000，000升的商业化规模的生物反应器来说，使用在约Irpm至约50rpm范围内的搅拌器速度进行搅拌。在各种实施方式中，较大的生物反应器与较小的生物反应器相比需要较低的rpm。
[0079]作为一种实施方式，本公开在生物反应器中提供在25至50°C范围内的温度控制。
[0080]在本公开方法的一种实施方式中，所述生物反应器包含一个反应器。在本公开方法的一种实施方式中，所述生物反应器包含两个或更多个反应器。
[0081]在本公开方法的一种实施方式中，所述生物反应器包含细胞再循环单元。
[0082]在本公开方法的一种实施方式中，包含含有CO的气态底物的所述气态料流还包含氢气。在一种实施方式中，包含含有CO的气态底物的所述气态料流包含合成气。在一种实施方式中，包含含 有CO的气态底物的所述气态料流包含钢铁厂排放气。在一种实施方式中，包含含有CO的气态底物的所述气态料流包含通过包含生物质的碳质材料的气化而获得的合成气。
[0083]在一种实施方式中，一个或多个生长或种子发酵罐提供了细菌细胞接种物的初始供应。在一种实施方式中，一个或多个生长或种子发酵罐与本公开的方法相结合，向生物反应器连续供应细菌细胞。在本公开的一种实施方式中，该过程包括细胞再循环。
[0084]营养培养基包含微生物生长培养基，其可以含有允许所选微生物生长的一种或多种维生素和矿物质。表I提供了本公开所设想的营养培养基的实施方式。适合于本公开的其他营养培养基在本【技术领域】中是公知的。此外，本发明可以利用本【技术领域】中未公开的但源自于表I中所描述的各种组分的营养培养基。本公开提供了改进的营养培养基组合物。
[0085]表1.培养基组分及其浓度
[0086]