专利名称：黄藤素抗急性肺损伤的应用的制作方法 SARS，即严重急性呼吸综合症，该病传染性强、病死率高。患者早期的病理特征与急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症主要病理特征肺泡微萎陷、透明膜形成、肺泡内毛细血管DIC、肺水肿等相一致(Holmes KU.SARS-associated coronavirus.N Engl JMed.2003；151948-1951.)。而学者们认为，从急性肺损伤到急性呼吸窘迫综合症，整个发病过程是一个从轻到重的连锁的炎症反应过程，内毒素的主要成分LPS是这个连锁反应中最主要的诱发因子，它通过嗜中性白细胞PMN在肺内聚集和增加肺毛细血管通透性两种途径致急性肺损伤。而后者，即毛细血管通透性增加是滞留于肺毛细血管中的PMN被促炎症因子或组织释放的介质活化，产生大量O2、蛋白水解酶、促炎症因子等进一步损伤肺组织尤其是肺血管内皮细胞导致的(Chignard M，Balloy V.Neutrophil recruitment and increased permeabilityduring acute lung injury induced by lipopolysaccharide.Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol.2000；279L1083-1090.)。对SARS肺的组织细胞病理学研究发现以PMN、单核巨噬细胞等炎性细胞的浸润，弥漫性肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤为特点的失控性炎症反应(Downey GP，Dong Q，Krμger J，et al.Regulation of neutrophil activationin acute lung injury.J Chest.1999；11646s-54s.)。黄藤素(fibraurelinum)又称大黄藤，为防己科植物，是从黄藤的藤茎和根中提取的一种生物碱，主要成分为掌叶防己碱、尚含小檗碱药等。有清热解毒功能，对多种G+和G菌属有抑制作用，能增强细胞的吞噬功能，提高机体的非特异性免疫功能。临床上用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、肠炎、痢疾、泌尿道感染，外科和妇科细菌感染性炎症等疾病(江苏新医学院。中药大辞典上册。上海上海科学技术出版社。2001.)。现代医学研究证明黄藤素具有抗感染、消炎、抑制多种细菌的作用，能降低毛细血管的通透性，抗凝血、抗血栓形成，能排除肠道及体内多种有害物质的作用(朱作金，柯美珍，李逢春等。黄藤素对大鼠免疫功能的影响。广西医科大学学报1995；12518-519.)。中药是中华民族的传统医药宝库。针对SARS病人，发挥发挥中药的特长，特别是云南中药的地域优势，利用有大量临床应用基础的黄藤素进行抗小鼠急性肺损伤药理学作用研究，以缓解病情、控制症状和降低死亡率为目标，尚无比较深入地研究和探索。
本发明的目的是研究黄藤素对抗急性肺损伤的药理学作用，为临床治疗SARS、急性肺损伤提供实验依据和有效的治疗药物。本发明目的是以黄藤素用于抗急性肺损伤来实现。所述黄藤素为口服片剂、或喷剂、或注射针剂之一类型的中成药。本发明实验结果揭示黄藤素能显著降低急性肺损伤小鼠死亡率，缩短急性肺损伤病程；能够降低肺组织的W/D、EB含量和BALF中蛋白含量以及肺组织MPO含量、O2含量和BALF中PMN数量，表明黄藤素具有降低肺毛细血管通透性、减轻肺水肿、肺炎症反应和急性肺损伤病理形态学病变的作用，能作为防治SARS，降低死亡率，缩短病程的有效药物。
关于黄藤素药理学作用机制，我们推测可能是通过抑制PMN的数量，减少PMN产生释放的弹性蛋白酶、炎性细胞因子以及活性氧，从而降低肺毛细血管通透性和肺的炎症反应。

(1)黄藤素对急性肺损伤小鼠的作用和量效关系将体重18-22g健康昆明小鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、LPS组和黄藤素组(n＝10)。其中，LPS组用20％乌拉坦溶液按实验小鼠10mg/10g体重腹腔注射麻药后，无菌条件下，颈前正中切开0.5cm切口，用无菌微量进样器刺入气管，缓慢滴注0.125％LPS溶液(10μl/10g体重)复制小鼠急性肺损伤模型。清醒后自由活动、饮食。在黄藤素组中，用低、中、高不同剂量的药物给小鼠灌胃或0.1ml/10g小鼠体重尾静脉注射，2次/天、共5次、末次给药后1h，气管内缓慢滴入0.125％LPS溶液。统计学分析，采用x2检验4组小鼠死亡率，以P＜0.05判定有显著性差异。
实验结果表明，与LPS组不同时间的死亡率相比，低剂量(2.25mg/10g d1)黄藤素片能明显降低死亡率(P＜0.01)。见表1。
表1.黄藤素对急性肺损伤小鼠死亡率的影响(n＝50)

与正常对照和生理盐水组比，▲P＜0.01；与LPS组相比，*P＜0.01，★P＜0.01。
(2)黄藤素对急性肺损伤小鼠的药理学机制2.1肺组织伊文思蓝(evans blue dye，EB)含量测定伊文思蓝是由一分子重氮联甲苯胺与两分子1-氨基-8-萘酚-2，4-二磺酸相连接合成的生物染料，是分子量960.8的四钠重氮基有机盐。EB与血清白蛋白有高度亲和力，静脉注入血管后数秒钟即与白蛋白稳定结合，渗入组织间质。由于渗出的EB含量可以反映毛细血管的通透性，故被广泛用于血管壁通透性的研究。
各实验组小鼠分别于4h、8h、12h和24h尾静脉注射EB(0.50mg/10g体重)1h后拉颈脱臼处死，取肺组织100mg，剪碎匀浆后置于试管中，加入2ml甲酰胺溶液提取肺组织EB，置于45℃水浴箱24h。浸出液离心，用分光光度计波长620nm，测定A值，由绘制的A值-EB含量标准曲线求出肺组织EB含量。
统计学分析数据用均数±标准差表示，组间药物疗效的比较采用重复测量的方差分析，结果以P＜0.05判定有显著性差异。实验结果表明与LPS组相比，黄藤素能明显降低不同时间急性肺损伤小鼠肺组织EB含量(P＜0.01)，见表2。
表2黄藤素对急性肺损伤小鼠肺组织EB含量的影响(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.01；与LPS组相比，*P＜0.01，★P＜0.01。
2.2肺组织湿/干比值(lung wet/dry weight ratio，W/D)各实验组小鼠处死后开胸取双肺，滤纸吸干肺表面水分和血迹后称重，置85℃烘箱内，干燥24h至恒重，再次称重，计算肺组织湿重与干重比值，比值的大小表示肺水肿形成情况。
统计学分析同2.1。实验结果表明与正常对照组和生理盐水组相比，LPS组不同时间的急性肺损伤小鼠肺组织W/D明显增加(P＜0.01)；与LPS组相比，黄藤素能明显降低不同时间急性肺损伤小鼠肺组织W/D(P＜0.05)，见表3。
表3.黄藤素对急性肺损伤小鼠肺组织W/D的影响(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.01；与LPS组相比，*P＜0.05，P＜0.05。
2.3肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测MPO是嗜中性白细胞的嗜天青颗粒释放的过氧化物酶类，为一种血红素蛋白。MPO的量约占每个PMN干重的5％，该酶具有使H2O2还原的能力，催化H2O2与氯起化学反应，产生次氯酸，具有很强的抗微生物活性。研究表明，MPO水平与PMN数量之间存在显著的正相关，过量生成可造成肺组织损伤，利用这一特点分析MPO酶的活力从而定量测定PMN数目。按MPO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明进行测试。
测试原理产物。通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定A产物的生成量，从而推算出MPO的活力和PMN的数目。
实验结果表明与正常对照组和生理盐水组相比，LPS组不同时间的急性肺损伤小鼠肺组织MPO含量明显增加(P＜0.01)；与LPS组相比，黄藤素能明显降低不同时间急性肺损伤小鼠肺组织MPO含量(P＜0.05)，见表4。
表4.黄藤素对急性肺损伤小鼠肺组织MPO含量的变化(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.01与LPS组相比，*P＜0.05，□P＜0.05。
2.4支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白含量和PMN数量测定将各实验组小鼠拉颈脱臼处死，分离气管，插入留置针头，用生理盐水进行灌洗，反复3次，回收量大于70％，置于离心管内离心15min。
(1)采用Lowry法测定BALF中蛋白含量。
首先，称取牛血清白蛋白标准品用双蒸水配制标准蛋白质贮备液，在分光光度计650nm波长处测定吸光度A值。按以下测定操作步骤绘制蛋白含量标准曲线，见下表

其次，根据以上标准曲线检测BALF中蛋白含量。准确吸取BALF上清夜1ml置于试管中，其它操作与以上标准曲线步骤相同。从标准曲线上查出样品蛋白含量。
实验结果表明与LPS组比，黄藤素能明显降低不同时间急性肺损伤小鼠BALF中蛋白含量(P＜0.05)，见表5。
表5.黄藤素对急性肺损伤小鼠BALF中蛋白含量的影响(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.01；与LPS组相比，*P＜0.05，□P＜0.05。
(2)BALF中PMN数量检测BALF离心后的沉淀悬浮于2％冰醋酸1ml中，破坏红细胞后离心，涂片、瑞士染色，干燥后油镜下对PMN进行记数，每张涂片记数100个细胞、计算出PMN所占百分率。
实验结果表明与LPS组比，黄藤素BALF中PMN数量明显减少(P＜0.05)。
表6.黄藤素对急性肺损伤小鼠BALF中PMN数量的影响(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.05；与LPS组相比，*P＜0.05，□P＜0.05。
2.5肺组织中超氧阴离子(superoxide anion radical，O2)检测原理模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统产生O2，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，用分光光度计测吸光度A值，以维生素C做标准，计算被检测样品产生O2的量。操作按超氧阴离子检测试剂盒步骤进行。
实验结果表明与正常对照组和生理盐水组相比，LPS组不同时间的急性肺损伤小鼠肺组织产生释放O2含量明显增加(P＜0.01)；与LPS组相比，黄藤素能明显降低不同时间急性肺损伤小鼠肺组织O2含量(P＜0.05)，见表6。
表6黄藤素对急性肺损伤小鼠肺组织产生释放O2.-的影响(x±s)

与正常对照组和生理盐水组比，▲P＜0.01；与LPS组相比，*P＜0.05，□P＜0.05。
(3)黄藤素对肺组织药理影响的形态学观察拉颈脱臼处死各实验组小鼠，开胸取肺，用10％中性甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片，HE染色后光镜下观察肺组织形态结构变化。
表7黄藤素对急性肺损伤小鼠肺组织形态学变化的影响



黄藤素抗急性肺损伤的应用，属于含有机有效成分的医药品。严重急性呼吸综合症患者早期病理特征与急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症主要病理特征等相一致。本发明的目的是以黄藤素用于抗急性肺损伤来实现，该黄藤素可以是口服片剂、或喷剂、或注射针剂之一类型的中成药。本发明实验结果揭示黄藤素能显著降低急性肺损伤小鼠死亡率，缩短急性肺损伤病程；能够降低肺组织的W/D、EB含量和BALF中蛋白含量以及肺组织MPO含量、O