专利名称：损伤部位治疗用组合物的制作方法在现有的医疗中，作为针对难以治疗的疾病的通用替代技术，利用干细胞的再生医疗受到了人们的关注。利用干细胞的再生医疗在对于全部疑难病的新型临床平台中是有希望的手段。已经有以胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)以及成体干细胞为代表的各种干细胞的报告。在成体干细胞中，由骨髓、脂肪组织、皮肤、脐带、胎盘等各种组织中分离出的间充质干细胞(MSC)被特别用于皮肤再生的临床应用方面。但是，骨髓穿刺对于供体来说为一种侵袭性且有痛性的技术。进一步地，骨髓干细胞(BMSC)的数目、增殖以及分化能力随着年龄的增长而降低。可应用再生医疗或期待应用再生医疗的疾病有很多，已经进行了许多面向临床应用的研究。神经疾病、特别是脊髓损伤等难治性神经疾病为期待利用再生医疗进行治疗的疾病之一。人们已经认识到，使用 人胎儿或ES细胞来源的神经干细胞来进行的难治性神经疾病的移植治疗(例如日本特开2002-281962号公报)为具有现实性的研究课题，但其在伦理性、安全性方面大有问题，对于实用性的“干细胞源”迄今仍为摸索状态(例如Keirstead et al·，Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitorcelItransplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury,Journal ofNeuroscience(2005)vol. 25(19)pp. 4694 ；0kano et al. , Neural stem cellsandregeneration of injured spinal cord,Kidney international(2005), Vol. 68, pp.1927—1931 ；Okada et al.，Spatiotemporal recapitulation of central nervous systemdevelopment bymurine embryonic stem cell derived neural stem and progenitorcells, Stem Cells (2008) vol. 26(12)pp. 3086-3098)。作为生物体内干细胞，有骨髓或脂肪来源的干细胞(例如国际公开第02/086108号小册子)，这些干细胞有几个缺点，即(1)随着年龄的增加，可采集的干细胞数目减少；(2)随着年龄的增加而累积的基因变异使得移植干细胞难以确保安全性；(3)细胞增殖能力低；(4)干细胞采集中伴随有剧烈的生物体侵袭(例如Gronthos etal., Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo,ProcNatl Acad SciUSA(2000)vol. 97(25)pp. 13625-13630 ；Miura et al. , SHED:stem cellsfrom humanexfoliated deciduous teeth,Proceedings of the National Academy ofSciences (2003) Vol. 100, 5807-5812);等等。开发出用于解决这些问题的新型难治性神经疾病治疗用干细胞资源是重要的。人脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from exfoliated deciduous teeth ；SHED)及智齿来源的恒牙牙髓干细胞(dental pulp stem cells ；DPSC)是医疗废弃物,经鉴定其是与BMSC具有同样的自我复制能力和多分化能力的新型干细胞群。这些细胞是显示出与神经谱系相近性状的神经嵴来源的细胞群，在分化诱导为神经细胞方面显示出较高的反应性(例如，Miura et al. , SHED: stem cells fromhumanexfoliated deciduous teeth, Proceedings of the National Academy ofSciences(2003)Vol. 100, 5807-5812 ；Arthur et al·，Adult human dental pulp stemcells differentiate towardfunctionalIy active neurons under appropriateenvironmental cues, Stem Cells (2008) vol. 26 (7) pp. 1787-1795)。SHED 与 DPSC 为自身来源的组织干细胞，因而移植中的安全性高，也极少有伦理问题。但是，在现有的SHED与DPSC的研究中，除了神经细胞谱系的片段化分析、或将神经分化诱导后的SHED或DPSC移植到啮齿类中对其生存进行观察之外，并未明确提出更进一步的技术思想(例如Arthur et al. , Adult human dental pulp stemcellsdifferentiate toward functionally active neurons under appropriateenvironmental cues,Stem Cel Is (2008)vol. 26 (7)pp. 1787-1795;Huang etal., Putative dental pulp-derivedstem/stromal cells promote proliferation anddifferentiation of endogenous neural cells inthe hippocampus of mice,StemCells(2008)vol. 26(10)pp. 2654-2663)。进一步地，据报告，DPSC具有可用于神经系统疾病、心脏病等全身性疾病用的基于细胞的治疗中的可能性，并且DPSC可减轻缺血性疾病(Arthur et al.，Adult humandentalpulp stem cells differentiate toward functionalIy active neurons underappropriateenvironmental cues,Stem Cells (2008)vol. 26(7) pp. 1787-1795 ；GandiaC，Arminan A, Garcia-Verdugo JMj et al., Human dental pulp stem cells improve leftventricular function,induce angiogenesis，and reduce infarct size in rats withacute myocardial infarction, StemCells 2008 ；26:638-645. ；Iohara K，Zheng Lj WakeH，et al. , A novel st em cell source forvasculogenesis in schemia:subfraction ofside population cells from dental pulp, StemCells 2008 ；26:2408-2418.)0另外，近年来的研究显示出MSC可有助于皮肤修复。进一步针对通过各种生长因子的外用来治愈创伤进行了广泛的研究。但是，在临床上尚未确认到通过以生长因子单次给药、多次给药来进行使用的结果、或者为了期待协同效应而将2个以上因子合用的结果。进一步地，过度暴露于太阳光的老龄人群的处理对药用化妆品和皮肤科医生来说是一大重点，为了对褶皱等光老化后的皮肤的部分症状进行处理，使用各种非侵袭性的处理和局部药用化妆品(Chung JHj Youn SHj Kwon OS，Cho KHj Youn JIj Eun HC.，Regulationsof collagen synthesis by ascorbic acid,transforming growth factor—betaandinterferongamma in human dermal fibroblasts cultured in three-dimensionalcollagen gelare photoaging—and aging-1ndependent,J Dermatol Sci 1997 ；15:188-200. ；FitzPatrick RE，Rostan EF. , Reversal of photodamage with topicalgrowth factors:a pilot study,J CosmetLaser Ther 2003;5:25-34)。在短波长紫外线(UVB)中的暴露为老化的原因之一，已知该暴露会在真皮中剌激基于人皮肤成纤维细胞(HDF)的胶原酶产生、上调胶原酶基因的表达。可认为其诱导了胶原蛋白的分解以及表现为皮肤的褶皱和黄变的变性弹性组织的沉积。以前的研究显示出MSC可产生血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)、转化生长因子-β (TGF-β)等各种细胞因子。近年来，据报告，细胞因子的产生和分泌为MSC的重要功能，特别是在皮肤生物学中已经验证了 MSC的多样药理学作用(JettanacheawchankitS，Sasithanasate S，Sangvanich P，Banlunara W，Thunyakitpisal P. , Acemannanstimulatesgingival fibroblast proliferation ;expressions of keratinocytegrowth factor-1,vascularendothelial growth factor,and type I collagen ；andwound healing，J Pharmacol Sc1.2009Apr ；109(4) :525-531 ；Miura et al.，SHED:stemcells from human exfoliated deciduousteeth，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences (2003) Vol. 100，5807-5812 ;SafaviSM，Kazemi B，EsmaeiliM，Fallah A，Modarresi A，Mir M. , Effects of low-level He-Nelaser irradiationon the gene expression of IL-1betajTNF—alpha，IFN—gamma，TGF—beta，bFGF，and PDGF in rat’s gingival,Lasers Med Sc1. 2008Jul ；23 (3) :331-335 ;SaygunI,Karacay S，Serdar M，Ural AU，Sencimen M，Kurtis B，Effects of laser irradiationon therelease of basic fibroblast growth factor(bFGF)，insulin like growthfactor-1 (IGF-1)，andreceptor of IGF-1 (IGFBP3)from gingival fibroblasts, LasersMed Sc1.2008Apr ；23(2) :211-215) 0例如，据报告，MSC通过多样生长因子的产生而具有皮肤治愈效果(参照 Minoru Uedaj The Use of fibroblasts, The Biochemical Society,11-15，2007)。这些生长因子使HDF活化，增加HDF的增殖/移行，介导HDF中的胶原蛋白分泌。MSC的分泌因子显示出了保护HDF免受氧化应激的作用，从而也验证了 MSC的抗氧化效果。局部生长因子的使用会剌激面部光老化的修复，通过新的胶原蛋白合成、减少上皮肥厚以及减少人眼可见的褶皱而具有光滑的皮肤临床外观(He H，Yu JjLiu Y，et al., Effectsof FGF2 and TGFbeta Ion the differentiation of human dental pulp stem cellsinvitro, Cell Biol Int 2008 ;32:827-834 ;Robey PG.，Stem cells near the centurymark, J ClinInvest 2000 ； 105:1489-1491.)0
发明所要解决的 课题但是，使用SHED或DPSC这样的牙髓干细胞可进行怎样的医学应用这一点尚未明确，具体的对象疾病也全然未知。本发明的课题在于提供利用牙髓干细胞的新型治疗手段。解决课题的手段本发明包含以下方式。[I] 一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清。[2]如[I]中所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有上述干细胞。[3]如[I]或[2]中所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞的培养上清含有至少2种细胞因子。[4]如[I] [3]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞的培[5]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞来源的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞为牙的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有养上清含有选自由血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)、转化生长因子-β (TGF-β)组成的组中的至少2种细胞因子。[5]如[I] [4]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞为成体干细胞。[6]如[I]于间充质干细胞。[7]如[I]髓干细胞。[8]如[I]血清。[9]如[ I] [8]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述损伤部位治疗为皮肤、牙周组织或者骨的损伤的治疗；脑硬塞治疗；或中枢神经疾病治疗。[10]如[I] [9]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述损伤部位治疗为中枢神经疾病的治疗，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、神经退行性疾病、神经细胞的退行或脱落以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[11]如[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物的制造方法，其包括以下步骤⑴ ⑶(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；和(3)回收培养上清的步骤。[12]如[11]中所述的制造方法，其进一步包括以下的步骤⑷(4)对于回收后的培养上清进行处理的步骤，所述处理选自由离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐和保存组成的组中的至少I种。[13]如[11]或[12]中所述的制造方法，其进一步包括下述步骤(a)和(b)的任意一个步骤(a)针对所回收的培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和(b)针对所回收的培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。[14] 一种损伤部位治疗方法，其为用于修复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗方法，其中，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复上述靶组织的损伤部位的有效量对具有上述损伤部位治疗用组合物的靶组织的患者进行给药的步骤。[15]如[14]中所述的损伤部位治疗方法，其中，对于上述给药，上述损伤部位的修复是基于内源性干细胞的能力来进行的。[16]如[14]或[15]中所述的损伤部位治疗方法,其中,通过选自由静脉给药、动脉给药、门静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔给药和鼻腔给药组成的组中的给药方法进行上述损伤部位治疗用组合物的给药。[17] 一种脑梗塞的治疗方法，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复脑损伤部位的治疗有效量对脑梗塞患者进行给药的步骤。 [18]如[17]中所述的脑梗塞的治疗方法，其中，上述损伤部位治疗用组合物通过鼻腔给药进行给药。[19] 一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。[20]如[19]中所述的治疗方法，其中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以牙髓干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[21]如[20]中所述的治疗方法，其中，上述牙髓干细胞为采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或者为采集后后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。[22]如[19] [21]的任一项所述的治疗方法，其中，在上述中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[23] 一种方法，其是判断所制备的牙髓干细胞的培养上清作为在上述[19] 的任意I项所述的中枢疾病治疗方法中使用的中枢疾病治疗用组合物的有效成分是否有效的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)中的至少一个步骤(a)针对上述培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；以及(b)针对上述培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。发明的效果根据本发明，可以提供利用牙髓干细胞的新型治疗手段，S卩，可以提供损伤部位治疗用组合物、及其制造方法、以及使用损伤部位治疗用组合物的损伤部位治疗方法。

图1为用于说明使用无毛小鼠的实验设计的图。褶皱经UVB照射诱导。图2为表示各种细胞类型中的形态、免疫分析和增殖率的图。(A-C)中，(A)表示BMSC, (B)表示DPSC，并且(C)表示SHED (X 40)。(D-F)表示作为干细胞标记物的STR0-1的免疫荧光染色像。(D)BMSC, (E)DPSC,以及(F) SHED为STR0-1阳性(绿色)。DAPI用于使核可视化(蓝色)。(G) SHED,DPSCs,以及BMSC的增殖率使用BrdU进行评价。条线(bar)标准偏差。显著差异*P〈0. 05.图3为表示SH-CM注入后利用复制(> Vj力)分析进行褶皱评价的图。㈧处理组、(B) 100%, SH-CM处理组图4为表示SH-CM和SHED注入组的通常水平下的褶皱改善的图。图5为表示苏木素-伊红染色像的图。㈧表示SH-CM处理组、⑶表示SHED注入组。图6为对真皮的厚度进行比较的曲线图。图7为表示SH-CM在HDF增殖中的影响的图。
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8为表示SH-CM对I型胶原蛋白和MMPl的影响的Western印迹分析图。9为概念性说明使用本发明组合物的骨再生机理的图。
10为概要说明本发明实施例3中的实验方法的图。
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为说明本发明实施例为表示本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例
3中所用BIC值的计算的图。
3的结果的染色像。
3的结果的图。
3的结果的照片。
3的临床例的结果的X射线照片像。
4的实验模型的图。
4中所用的处理样式的照片。
4中所用的处理样式的照片。
4中所用的处理样式的图。
为用于说明作为本发明实施例4的结果而得到的牙骨质的再生状态的染色像。上图表示使用GF的情况下的图、下图表示使用PRP的情况下的照片。图21为表示本发明实施例4的结果的曲线图(N2-NC)。图22为表示本发明实施例4的结果的曲线图(N1-JE)。图23为用于说明本发明实施例4的临床例中的前处理的照片。图24为用于说明本发明实施例4的临床例中的处理方法的照片。图25为表示本发明实施例4中的临床例的结果的照片。图26为用于说明本发明实施例5的脑梗塞制作的图。图27为表示本发明实施例5中的第I组、第II组和第III组的鼻腔给药开始后的障碍评分变化的曲线图。图28为用于说明本发明实施例5中的第I组、第II组和第III组的鼻腔给药开始后第16天的梗塞容积的曲线图。图29为用于说明培养上清的制备法的示意图。hSHED :人乳牙牙髓干细胞、hDPSC 恒牙牙髓干细胞、hBMSC :人骨髓间充质干细胞、hFibroblast :人成纤维细胞。图30为表示神经突起生长实验的结果的照片(相位差显微镜像)。图31为神经突起生长实验的结果。其为表示确认到神经突起的细胞的比例(左)与神经突起的长度(右)的曲线图。图32为表示神经突起生长实验的结果的照片(相位差显微镜像)。图33为神经突起生长实验的结果。其为表示确认到神经突起的细胞的比例(左)与神经突起的长度(右)的曲线图。图34为表示凋亡抑制实验(TUNEL法)的结果的照片。图35为凋亡抑制实验(TUNEL法)的结果，其为对牙髓干细胞的培养上清所致的凋亡抑制效果进行统计处理的曲线图。左为对CSPG存在下的凋亡抑制效果进行确认的曲线图，右为对MAG存在下的凋亡抑制效果进行确认的曲线图。图36为表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果的曲线图。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；BMSC-CM :骨髓间充质干细胞培养上清给药组；对照PBS给药组。图37表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。表示对照组与SHED-CM组的脊髓状态的比较(上)和脊髓重量的比较(下)。图38表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；对照=PBS给药组。图39表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；对照=PBS给药组。


在可根据所应用的被检体的状态来维持所期待的治疗效果的条件下，在本发明的组合物中追加其它成分来进行使用也是无妨的。可在本发明中追加使用的成分的一例如下。(i)生物体吸收性材料可以使用作为有机系生物体吸收性材料的透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原(例如B0LHEAL (注册商标))等。
(ii)凝胶化材料凝胶化材料优选使用生物体亲和性高的材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白或纤维蛋白糊等。作为透明质酸、胶原蛋白，可以选择各种物质进行使用，优选采用适于本发明组合物的应用目的(应用组织)的物质。所使用的胶原蛋白优选为可溶性的(酸可溶性胶原蛋白、碱可溶性胶原蛋白、酶可溶性胶原蛋白等)。(iii)其他也可以含有制剂上容许的其它成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟基甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。也可以含有抗生素、pH调节剂、生长因子(例如上皮细胞生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF))等。对本发明组合物的最终形态没有特别限定。形态例为液体状(液态、凝胶状等)和固体状(粉状、细粒、颗粒状等)。本发明的其它方式还包括对靶组织的损伤部位进行修复的方法、以及对损伤的组织进行治疗的方法。这些方法包括将上述干细胞培养上清分别对靶组织的损伤部位或损伤组织进行给药。由此，可有效修复具有损伤部分的靶组织。特别是在靶组织为脑的情况下，也可优选适用作脑梗塞的治疗方法。作为上述损伤部位治疗用组合物的给药方法和给药途径并无 特别限制。例如，优选进行上述损伤部位治疗用组合物的非口服给药，作为非口服给药，可以为全身性给药，也可以为局部给药。作为局部给药的示例，可以举出向目的组织中的注入、涂布或喷雾等。作为上述损伤部位治疗用组合物的给药方法的示例，可以举出静脉给药、动脉给药、门静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔给药以及鼻腔给药等。其中，鼻腔给药等是低侵袭性的，为优选。作为给药方案，例如可以采用一日一次 数次、两日一次、或三日一次等。在给药方案的制作中，可以考虑对象(接受者)的性別、年龄、体重、病症等。给药方法的选择可由本领域技术人员基于靶组织的种类、治疗对象疾病的种类等来进行。例如，在靶组织位于头部的疾病的治疗或损伤组织的修复等中，出于无需考虑血脑屏障的透过、低侵袭性的原因，特别优选适用鼻腔给药等。例如，在靶组织为脑的情况下，可优选适用鼻腔给药。另外，对于脑梗塞的治疗，可优选适用鼻腔给药。上述损伤部位治疗用组合物进行给药的对象代表性地为靶组织具有损伤的人患者，认为其也可应用于人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体地说，例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫等)中。另外，本发明的脑梗塞的治疗方法包括以上述干细胞培养上清进行鼻腔给药，对脑的损伤部位进行修复的步骤。根据本治疗方法，能够以低侵袭性且有效地使由于脑梗塞而受到损伤的区域得到恢复。
<中枢神经疾病治疗用组合物>本发明的其它方式特别包括中枢神经疾病治疗用组合物和中枢神经疾病治疗方法。本发明人在上述背景下进行了研究。从而明确了牙髓干细胞为共表达神经干细胞标记物、分化神经细胞标记物、星形细胞标记物以及少突神经胶质细胞标记物等全部的神经谱系标记物的稀有细胞群，明确了牙髓干细胞高表达脑源性神经营养因子(BDNF ；Brain-derived neurotrophic factor),同时通过动物实验验证了牙髓干细胞促进神经的再生(参照日本特愿2010-92585号)。如上所述，以往期待牙髓干细胞(SHED、DPSC)的潜在能力，从各种角度对作为细胞的有用性进行了研究。 在研究的进一步进展中，本发明人对以往的视点进行了极大的改变，着眼于牙髓干细胞培养上清施行了各种实验。此处，作为已知的事实，末梢神经在损伤后易于再生，中枢神经(大脑、脊髓)几乎不再生。不会发生中枢神经的再生的最大理由在于“损伤后的中枢神经系统中存在各种会抑制再生轴突生长的因子”。到目前为止已经鉴定出了活化星形细胞来源的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)之类的神经再生抑制因子。这些抑制物质通过细胞内蛋白Rho、R0CK的活化来抑制神经轴突的生长、诱发凋亡。尚未发现即使在神经再生抑制因子的存在下也会抑制凋亡、发挥出轴突生长效果的药剂。本发明人的分析结果揭示出了牙髓干细胞培养上清即使在损伤的中枢神经系统环境(即在存在有会抑制神经突起的生长、诱发凋亡的物质的环境)下也可抑制神经再生抑制物质的作用(解除抑制)、促进神经突起的生长、抑制凋亡这样的令人吃惊的事实。另外还使用脊髓损伤模型动物验证了牙髓干细胞培养上清的效果，结果牙髓干细胞培养上清的给药使下肢运动功能有显著改善。并且，根据组织学评价的结果，牙髓干细胞培养上清的给药抑制了脊髓的形态变化和神经损伤的扩大。由此，通过动物实验也确认到了牙髓干细胞培养上清的优异的再生-治疗效果。如上所述，本发明人进行了深入研究，结果带来了牙髓干细胞培养上清对于中枢神经系统的再生-治愈极为有效这样的技术思想。以下示出的本发明主要以该技术思想为基础。需要说明的是，牙髓干细胞培养上清在事先准备和保存的方面要比使用牙髓干细胞本身的情况更为有利 ，特别适于中枢神经系统疾病的急性期或亚急性期的治疗。并且，在不含有细胞成分、可克服免疫排斥问题这一点上，牙髓干细胞培养上清的有用性也是极高的。本发明的本方式包括下述内容。[I] 一种中 枢神经疾病治疗用组合物，其中，其含有牙髓干细胞培养上清。[2]如[I]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其在神经再生抑制物质存在下显示出神经突起生长作用。[3]如[2]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述神经再生抑制物质为硫酸软骨素蛋白多糖或髓磷脂相关糖蛋白。[4]如[I] [3]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其对神经细胞显示出凋亡抑制作用。[5]如[I] [4]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其不含有牙髓干细胞。[6]如[I] [4]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其是与牙髓干细胞组合形成的。[7]如[6]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其特征在于，上述牙髓干细胞为在采集后未经分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞。 [8]如[I] [7]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其不含有血清。[9]如[I] [9]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述培养上清为对牙髓细胞中的粘附细胞或其传代细胞进行培养而得到的培养上清。[10]如[I] [9]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等神经退行性疾病；脑缺血、脑内出血或脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[11]中枢神经疾病治疗用组合物的制造法，其包括下述步骤(I) (3)(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；和(3)回收培养上清的步骤。[12]如[11]中所述的制造法，其中，使用不含有血清的培养基进行步骤(2)。[13]如[11]或[12]中所述的制造法，其中，在步骤(3)中，回收传代培养后的培
养上清。[14]如[11] [13]的任一项所述的制造法,其进一步包括下述步骤⑷(4)对于回收后的培养上清进行处理的步骤，所述处理选自由离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐和保存组成的组中一种以上。[15]如[11] [14]的任一项所述的制造法，其进一步包括下述步骤(a)和/或(b)(a)针对所回收的培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；(b)针对所回收的培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。[16]如[11] [15]的任一项所述的制造法，其中，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等神经退行性疾病；脑缺血、脑内出血、或者脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[17] 一种中枢神经疾病的治疗方法，其包括将[I] [10]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。[18]如[17]中所述的治疗方法，其中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以牙髓干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[19]如[18]中所述的治疗方法，其中，上述牙髓干细胞为在采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或者为采集后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。
[20]如[17]中所述的治疗方法，其中，在上述中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[21] 一种方法，其是判断所制备的牙髓干细胞培养上清作为中枢神经系统疾病治疗用的有效成分是否有效的方法，该方法包括下述步骤(a)和/或(b)(a)针对上述培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和(b)针对上述培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。本发明的中枢神经疾病治疗用组合物的特征在于，其含有牙髓干细胞培养上清。牙髓干细胞大致存在有两种。即为乳牙牙髓干细胞与恒牙牙髓干细胞。在本说明书中，按照惯例，将乳牙牙髓干细胞简称为SHED、将恒牙牙髓干细胞简称为DPSC。SHED培养上清和DPSC培养上清的任意一种均可用作构成本中枢神经疾病治疗用组合物的培养上清。上述中枢神经疾病治疗用组合物可通过下述特性、即“在神经再生抑制物质的存在下显示出神经突起生长作用”而具有特征。与末梢神经系统不同，中枢神经系统中存在有神经再生抑制物质(神经突起生长抑制因子)。这一点在谋求中枢神经疾病的治疗(主要为神经再生)上是重要的，需要进行考虑。利用具备上述特性的上述中枢神经疾病治疗用组合物，可抑制神经再生抑制物质的作用，促进神经的再生。神经再生抑制物质的示例为硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)。上述中枢神经疾病治疗用组合物是否具备该特性例如可通过使用神经细胞和神经再生抑制物质(CSPG或MAG)的体外实验(详细内容参照后述的实施例)来进行确认(在被测组合物与CSPG或MAG的共存下进行神经细胞的培养的情况下，只要观察到神经突起的生长，就可判断被测组合物具备该特性)。上述中枢神经疾病治疗用组合物还可通过下述特性、即“对神经细胞显示出凋亡抑制作用”而具有特征。上述中枢神经疾病治疗用组合物是否具备该特性例如可通过使用神经细胞的体外实验(详细内容参照后述实施例)来进行确认(在被测组合物的存在下进行神经细胞的培养的情况下，只要观察到抑制了基于凋亡的细胞死亡，即可判断被测组合物具备该特性)。需要说明的是，在优选方式中，上述中枢神经疾病治疗用组合物同时具备该特性与上述特性(在神经再生抑制物质的存在下显示出神经突起生长作用)。在本方式中，术语“牙髓干细胞培养上清”为对牙髓干细胞进行培养而得到的培养液，其不含有细胞成分(即牙髓细胞或牙髓干细胞)。因而，例如通过培养后分离除去细胞成分，能够得到可用于本发明的培养上清。可以使用适当施有各种处理(例如离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。培养上清处理方法的详细内容如后述 。牙髓干细胞可以以牙髓细胞中的粘附细胞的形式来挑选。因而，可以将对采集自脱落的乳牙或恒牙的牙髓细胞中的粘附细胞或其传代细胞进行培养而得到的培养上清作为“牙髓干细胞培养上清”进行使用。另外，关于“牙髓干细胞培养上清”制备方法的详细内容如后述。如上所述，“牙髓干细胞培养上清”被定义为对牙髓干细胞进行培养而得到的、不含有细胞成分的培养液。上述中枢神经疾病治疗用组合物含有“牙髓干细胞培养上清”作为有效成分，在其一个方式中，作为组合物整体也不含有细胞(不论细胞的种类如何)。该方式的组合物由于该特征，因而与牙髓干细胞本身有明显区别，这自不必说，因此与含有牙髓干细胞的各种组合物有明显区别。另外，该方式的典型例为仅由牙髓干细胞培养上清构成的组合物。另一方面，本方式的一个实施方式的特征在于组合应用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。优选使用乳牙牙髓干细胞(SHED)。这是由于，与恒牙牙髓干细胞(DPSC)相比，其细胞增殖能力高。并且还由于据考虑其分化能力也更高。进一步地，SHED的BDNF表达水平高(参照日本特愿2010-92585号)，可发挥出更高的治疗效果，这一点也是使用SHED的优点。此外，SHED还具有采集简单的优点。近年来，有多个研究组进行了面向使用细胞来实现再生医疗的研究。在利用细胞的情况下，对由生物体采集的细胞施以培养、选择、处理等，其后进行回收，作为移植物的成分。通常，在一系列的操作过程中，培养上清被废弃或被置换为生理缓冲液等。因而，不会积极地在最终的移植物中含有培养上清。鉴于该情况，在以牙髓干细胞培养上清为必须有效成分这一点上，即使是组合使用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”的该方式的组合物，也与着眼于牙髓干细胞本身的有用性并在有效成分中使用牙髓干细胞的组合物或制剂等具有文字上(这自不必说)、实质上的严格区别。该实施方式的特征为组合使用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。此处的“组合使用”意味着合用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。代表性地为将上述中枢神经疾病治疗用组合物以“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”混合而成的配合剂的形式提供的方式。在这样的情况下，优选使用在采集后未进行分化诱导(换言之，维持未分化状态)的牙髓干细胞(在本说明书中也称为“未分化型牙髓干细胞”)。这种情况下，由于上述中枢神经疾病治疗用组合物发挥出较强的神经保护作用，因而特别适合应用于急性期或亚急性期的中枢神经疾 病(例如脊髓损伤、脑梗塞等伴随有严重的神经细胞脱落-退行的难治性神经疾病)中。该实施方式所用的牙髓干细胞中，神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)为阳性、神经干细胞标记物双皮质素(Doublecortin)为阳性、神经细胞标记物β-1II微管蛋白为阳性、神经细胞标记物NeuN为阳性、星形细胞标记物GFAP为阳性、少突神经胶质细胞标记物CNPase为阳性，且高表达BDNF (参照日本特愿2010-92585号)。另一方面，例如还可以以试剂盒的形态提供上述中枢神经疾病治疗用组合物，该试剂盒由含有“牙髓干细胞培养上清”的第I构成要件与含有“牙髓干细胞”的第2构成要件构成。这种情况下，对于进行第I构成要件的给药的治疗对象(通常为中枢神经疾病患者)，在与第I构成要件给药的同时或在其给药后进行第2构成要件的给药。同时进行第I构成要件与第2构成要件的给药的使用方法特别适于应用至急性期或亚急性期的中枢神经疾病中。为了在应用至急性期或亚急性期的情况下发挥出较高治疗效果，优选使用未分化型牙髓干细胞作为第2构成要件的有效成分。需要说明的是，此处的“同时”并不要求严密的同时性。从而，不消说，将两要件混合后向对象进行给药等的在两要件的给药无时间差的条件下进行实施的情况是包含在“同时”的概念中的，而即使是在一方给药后迅速进行另一方的给药等的两要件的给药实质上无时间差的条件下进行实施的情况也是包含在此处的“同时”的概念中的。
利用在急性期或亚急性期进行第I构成要件的给药、在其后(例如3天 I周后)进行第2构成要件的给药的使用方法，可以期待连续且综合的治疗效果。在计划该使用方法的情况下，作为第2构成要件的有效成分，优选使用分化诱导为神经系统细胞的牙髓干细胞(在本说明书中也称为“分化诱导型牙髓干细胞”)。此处的术语“神经系统细胞”包括运动神经元、多巴胺生成细胞、各种中枢神经细胞、星形细胞、少突神经胶质细胞、雪旺细胞。关于应该使用分化诱导为哪种神经系统细胞的牙髓干细胞这一点，可以考虑治疗对象的疾病、病症来确定。例如，若为脊髓损伤治疗用，则可在第2构成要件中使用分化诱导为成熟型神经细胞、少突神经胶质细胞或雪旺细胞的牙髓干细胞。下面给出分化诱导为神经系统细胞的方法的实例。在分化诱导为多巴胺产生神经细胞时，可利用由下述2个工序构成的方法。在第I工序中，使用聚-L-赖氨酸包被培养皿，利用例如含有12. 5U/ml制霉菌素、N2添加剂、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的DMED培养基对牙髓干细胞进行2 3天培养。利用该工序，将牙髓干细胞分化诱导为神经干细胞。在第2工序中，将第I工序后的细胞利用例如含有B27添加剂、ImM db_cAMP、0. 5mM ΙΒΜΧ、200 μ M抗坏血酸和50ng/ml BDNF的Neurobasal 培养基进行6 7天培养。所诱导出的多巴胺产生神经细胞可以使用抗酪氨酸羟化酶的抗体通过免疫染色进行确认。除上述方法外，还可根据需要将经报告为将神经干细胞或胚胎干细胞分化诱导为多巴胺产生神经细胞的方法的下述各种方法进行适宜修正后进行利用，所述方法为在bFGF存在下进行培养后利用悬浮聚集培养系进行培养的方法(Studer, L. et al. , Nat. Neurosc1. , 1:290-295, 1998);在 bFGF 和神经胶质细胞株培养上清的存在下进行培养的方法(Daadi, Μ. M. and Weiss, S. J. :Neuroscience, 19:4484-4497, 1999.);利用 FGF8、Shh, bFGF 和抗坏血酸等的方法(Lee, S. H. et al.，Nat.Biotechnol.，18:675-679, 2000.);与骨髓间质细胞进行共培养的方法(Kawasaki, H. etal. , :Neuron, 28:31-40，2000.);等等。

在分化诱导为星形细胞时，可以利用由下述2个工序构成的方法。在第I工序中，使用聚-L-鸟氨酸与纤连蛋白双重包被的培养皿，利用例如含有N2添加剂和10ng/mlbFGF的DMEM/F12培养基对牙髓干细胞进行4天培养。在第2工序中，使用进一步添加有80ng/mlLIF、80ng/ml BMP2的培养基进行3天培养。分化诱导出的星形细胞可以通过使用抗GFAP抗体的免疫染色进行确认。在分化诱导为少突神经胶质细胞时，可以利用由下述2个工序构成的方法。与分化诱导为星形细胞同样地，在第I工序中，使用聚-L-鸟氨酸与纤连蛋白双重包被的培养皿，利用例如含有N2添加剂、10ng/ml bFGF和0. 5%FCS的DMEM/F12培养基对牙髓干细胞进行4天培养。通过该工序将牙髓干细胞诱导为少突神经胶质细胞前体细胞。接下来在第2工序中，利用含有20ng/ml T3 (三碘甲状腺原氨酸)、20ng/ml T4 (甲状腺素)和N2添加剂的DMEM/F12培养基进行4天培养。分化诱导出的少突神经胶质细胞可使用抗04抗体进行确认。作为第2构成要件的成分，可以在分化诱导型牙髓干细胞的基础上使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞，也可以替代分化诱导型牙髓干细胞而使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞。多能干细胞的示例为诱导多能干细胞(iPS细胞)和胚胎干细胞(ES细胞)。“诱导多能干细胞(iPS细胞)”为通过初期化因子的导入等而对体细胞进行重新设定所制作出的具有多能性(多分化能力)与增殖能力的细胞。诱导多能干细胞表示出与ES细胞相近的性质。iPS细胞可以通过以往报告的各种iPS细胞制作法来制作。另外，认为当然也可应用今后开发出的iPS细胞制作法。 iPS细胞制作法的最基本方法为将转录因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc这4种因子利用病毒导入到细胞中的方法(Takahashi K, Yamanaka SiCell 126 (4)，663-676，2006 ;Takahashi, K, et al:Cell 131 (5)，861-72，2007)。关于人 iPS 细胞，有通过导A 0ct4、Sox2、Lin28 和 Nonog 这 4 种因子来建立的报告(Yu J, et al: Science318 (5858)，1917-1920, 2007)。也有通过导入除 c-Myc 外的 3 种因子(Nakagawa M, etal:Nat. Biotechnol. 26(1)，101-106，2008)、通过导入 0ct3/4 和 Klf4 这 2 种因子(Kim JB, et al: Nature 454 (7204)，646-650，2008)、或通过仅导入 0ct3/4 (Kim J B, et al:Cell136 (3) ,411-419，2009)来建立iPS细胞的报告。另外还报告了将作为基因表达产物的蛋白质导入到细胞中的方法(Zhou H, Wu S，Joo JY, et al:Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009 ；KimD, Kim CH, Moon JI, et al:Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，还有通过使用组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294或组蛋白脱乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等可提高制作效率或可降低导入的因子等的报告(Huangfu D, et al :Nat.Biotechnol. 26(7), 795-797，2008 ；Huangfu D, et al:Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008 ；Silva J, et al:PLoS. Biol. 6(10), e 253,2008)。关于基因导入法也进行了研究，开发出了将逆转录病毒、以及慢病毒(Yu J，et al: Science 318 (5858)，1917-1920，2007)、腺病毒(Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903)，945-949，2008)、质粒(Okita K, etal: Science 322 (5903)，949-953，2008)、转座子载体(Woltjen K, Michael IP, MohseniP, et al:Nature 458,766-770, 2009 ；Kaji K,Norrby K,Pac a A, et al:Nature458, 771-775, 2009 ；Yusa K, Rad R, Takeda J, et al :Nat Methods 6，363-369，2009)、或附加型载体(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al:Science 324, 797-801, 2009)用于基因导入中的技术。产生了向iPS细胞的转化、即产生了初期化(重新设定)的细胞可通过以Fbxol5、Nanog、0ct/4、Fgf-4、Esg-l和Cript等多能干细胞标记物(未分化标记物)的表达等为指标来进行选择。可将所选择的细胞作为iPS细胞进行回收。另一方面，有多种ES细胞可由公共机构提供或有市售。作为小鼠ES细胞的示例，可以举出ES-E14TG2a细胞(ATCC)、ES-D3细胞等(ATCC)、Hl细胞(理研生物资源中心，日本筑波市)、B6G-2细胞(理研生物资源中心，日本筑波市)、Rl细胞(SamuelLunenfeldResearch Institute，加拿大多伦多)、小鼠ES细胞(129SV、目录编号R-CMT1-1-15、R-CMT1-1A)(大日本住友制药株式会社，日本大阪)、小鼠ES细胞(C57/BL6，目录编号R-CMT1-2A(大日本住友制药株式会社，日本大阪)。猴ES细胞可由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心等获得。人ES细胞可由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心、WiCell Research Institute (美国麦迪逊)、ES Cell InternationalPte Ltd(新加坡)等获得。已确立了 ES细胞的建立方法，其一部分也已被常规化，因而，也可按照常规方法自行建立目的ES细胞。例如，关于小鼠ES细胞的树立方法可以参M Nagy. A. et al. , eds. !Manipulating the MouseEmbryo, A Laboratory Manual, ThirdEdition, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2003,实验医学分册培养细胞实验手册(羊土社)等。若为猴ES细胞的建立方法,则可参照Suemori H, Tada T, Torii R, et al.,,Dev Dyn 222，273-279，2001等。若为人ES细胞的建立方法，则可参照Wassarman, P. M. etal.，Methods in Enzymology, Vol. 365(2003)等。上述中枢神经疾病治疗用组合物优选不含有血清。通过不含有血清，其安全性得到提高。例如，通过利用不含有血清的培养基(无血清培养基)对牙髓干细胞进行培养，可以制备出不含有血清的培养上清。可进行I次或多次传代培养，最后或最后几次的传代培养利用无血清培养基进行培养，即可得到不含血清的培养上清。另外，可利用通过透析或柱所进行的溶剂置换等由回收的培养上清中除去血清，由此也可得到不含血清的培养上清。上述中枢神经疾病治疗用组合物用于中枢神经(脑、脊髓)疾病的治疗中。作为可适用上述中枢神经疾病治疗用组合物的中枢神经疾病，可举出脊髓损伤、神经退行性疾病(肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等)、伴有脑缺血或脑内出血等的脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、伴有神经细胞障碍的视网膜疾病。若应用上述中枢神经疾病治疗用组合物，则通过对神经突起生长作用和/或神经细胞的凋亡抑制作用，促进中枢神经组织的再生-治愈。只要是基于这样的机理进行治疗会有效的疾病或病症，则不管其种类或原因(例如，外伤或脑梗塞等所致的一次原因；感染、肿瘤等所致的二次原因)等如何，均可为本发明的对象疾病。脊髓损伤指的是脊髓由于来自外部的冲击、脊髓肿瘤或疝气等内在因素而发生损伤的状态。根据损伤的程度，分为完全型(脊髓在中间被完全切断的状态)与不完全型(脊髓尽管受到损伤或压迫但脊髓仍维持部分功能的状态)。在目前的医疗技术中，脊髓损伤无法完全恢复，迫切希望确立新的治疗方法。脊髓损伤为期待适用再生医疗的疾病之一，研究了骨髓、神经干细胞、胚胎干细胞、人工多能干细胞等的使用。但是，由于各种问题，尚未实现决定性的治疗技术。在这样的状况下，上述中枢神经疾病治疗用组合物提供了可期待较闻治疗效果的治疗方法，其意义、价值极 闻。可适用上述中枢神经疾病治疗用组合物的其它疾病、病症为由于急性期或亚急性期脑缺血、脑内出血等所致的神经细胞的退行-脱落而产生的脑梗塞；作为由于围产期的缺氧缺血而广生的新生儿脑疾病的脑室周围白质软化症等。脑缺血为脑内血液不足、脑中未供给充分的氧或营养的状态。脑缺血引起神经细胞死亡、脑水肿，为脑梗塞的原因。本发明的组合物也可适用于由于这样的脑缺血等所引起的神经细胞的破坏或与其相伴的各种疾病的治疗。帕金森氏病、脊髓小脑变性症、阿兹海默氏病、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、进行性核上清麻痹为由于大脑、中脑和小脑区域中的区域特异性神经细胞的脱落变异所引起的难治性神经疾病。上述中枢神经疾病治疗用组合物通过抑制神经细胞的退行-脱落而在这些疾病中发挥出治疗效果。上述中枢神经疾病治疗用组合物也可适用于伴有神经细胞障碍的视网膜疾病中。视网膜中可大致分为5种神经细胞，S卩，其中存在有视细胞(椎体细胞、杆体细胞)、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和神经节细胞。上述中枢神经疾病治疗用组合物通过对下述疾病中的神经细胞死亡和脱落进行抑制，从而可发挥出治疗效果，所述疾病不仅有以视网膜中存在的这些神经细胞(I种或2种以上)的障碍为原因的视网膜疾病，还有作为这些神经细胞(I种或2种以上)呈现出障碍的病症的视网膜疾病(外伤性视网膜脱落、视网膜裂孔、视网膜震荡症、视神经管骨折、糖尿病视网膜症、老化黄斑变性、视网膜色素变性症、青光眼、无脉络膜、Leber’s遗传性视神经病变、椎体营养不良、家族性玻璃疣、中心性晕轮样脉络膜营养不良、常染色体显性视神经萎缩等)。在可维持所期待的治疗效果的条件下，在本发明的组合物中追加其它成分进行使用也是无妨的。下面列举出可在本发明中追加使用的成分。(i)生物体吸收性材料作为有机系生物体吸收性材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原(例如B0LHEAL (注册商标))等。(ii)凝胶化材料凝胶化材 料优选使用生物体亲和性高的材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白或纤维蛋白糊等。作为透明质酸、胶原蛋白，可以选择各种物质进行使用，优选采用适于本发明组合物的应用目的(应用组织)的物质。所使用的胶原蛋白优选为可溶性的(酸可溶性胶原蛋白、碱可溶性胶原蛋白、酶可溶性胶原蛋白等)。(iii)其他也可以含有制剂上容许的其它成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟基甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。也可以含有抗生素、PH调节剂、生长因子(例如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF))等。对上述中枢神经疾病治疗用组合物的最终形态没有特别限定。形态例为液体状(液态、凝胶状等)和固体状(粉状、细粒、颗粒状等)。对上述中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法没有特别限定，优选为包括下述步骤(I) (3)的制造方法，即(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；(3)回收培养上清的步骤。下面，对每一步骤进行说明。在步骤(I)中，从牙髓细胞中挑选出属于粘附细胞的牙髓干细胞。在下文中，只要事先从生物体中进行分离等来准备牙髓细胞即可。本挑选步骤可包括牙髓细胞的准备。下面给出从牙髓细胞的准备到牙髓干细胞的挑选的一系列操作过程的具体例。(a)牙髓的采集将自然脱落的乳牙(或拔下的乳牙、或恒牙)利用氯己定或聚乙烯吡咯酮碘(IS0DINE)溶液消毒后，分离出齿冠部，利用牙钻回收牙髓组织。(b)酶处理将采集的牙髓组织悬浮在基础培养基(含有10%牛血清-抗生素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM))中，利用2mg/ml的胶原酶和分散酶(Dispase)在37°C处理I小时。通过5分钟的离心操作(5000转/分钟)回收酶处理后的牙髓细胞。由于利用细胞滤网进行的细胞挑选会降低SHED、DPSC等神经干细胞级分的回收效率，因而原则上不使用该方法。(C)粘附细胞的挑选 将细胞利用4cc基础培养基进行再悬浮，播种在直径6cm的粘附细胞培养用培养皿中。添加培养液(例如含有 10%FCS 的 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium))后，利用调整为5%C02、37°C的培养箱进行2周左右的培养。去除培养液后，利用PBS等对细胞进行I次或多次清洗。也可以进行形成了菌落的粘附细胞(牙髓干细胞)的回收来代替该操作(培养液的去除和细胞的清洗)。这种情况下，例如利用O. 05%胰蛋白酶-EDTA于37°C进行5分钟处理，回收从培养皿脱落的细胞。在接着步骤(I)的步骤(2)中，对挑选出的粘附细胞进行培养。例如，将细胞播种在粘附细胞培养用培养皿中，利用调整为5%C02、37°C的培养箱进行培养。根据需要进行传代培养。例如在通过肉眼观察达到亚融合(细胞占据培养容器表面的约70%的状态)或融合时，将细胞从培养容器剥离进行回收，再次播种在填满培养液的培养容器中。可反复进行传代培养。例如进行I 8次传代培养，增殖到必要的细胞数(例如约I X IO7个/ml)。另外，细胞从培养容器的剥离可通过胰蛋白酶处理等常规方法来实施。在上述培养后，可回收细胞进行保存(保存条件例如为_198°C)。也可将从各种供体回收的细胞以牙髓干细胞库的形态进行保存。培养液中可以使用基础培养基、或在基础培养基中添加有血清等而成的培养液等。其中，为了制备不含血清的“牙髓干细胞培养上清”，可在整个过程中、或在最后或最后几次的传代培养中使用无血清培养基。另外，基础培养基，可以使用DMEM，还可以使用伊思考夫改良杜尔贝可培养基GMDM) (GIBC0社等)、Ham’s F12培养基(HamF12) (SIGMA社、GIBCO社等)、RPMI1640培养基等。也可以合用两种以上的基础培养基。作为混合培养基的一例，可以举出将頂DM与HamF12等量混合而成