专利名称:含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物用于抗病毒等药物的制作方法图1。分别为1.25,2.5和5.0g/kg组,在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3),取鸭血,分离血清,检测DHBV-DNA OD值,作自身比较。结果表明5.0g/kg组在给药第5天(T5)、第10天(T10),和停药后第3天(P3),鸭血清DHBV-DNAOD值与给药前(T0)比较,配对分析,有非常显著的抑制作用。(P<0.01)。成组分析,给药第5天,10天(T10),和停药后第3天(P3),给药组与对照组比较,有非常显著的抑制作用。(P<0.01)。2.5g/kg组,在给药第5天(T5)、第10天(T10),和停药后第3天(P3),鸭血清DHBV-DNA OD值与给药前(T0)比较,配对分析,有显著和非常显著的抑制作用。(P<0.05-0.01)。成组分析,给药第10天(T10),和停药后第3天(P3),给药组与对照组比较,有显著的抑制作用。(P<0.05)。1.25g/kg组,鸭血清DHBV-DNA OD值与给药前(T0)比较,配对分析,在给药第5天(T5),有显著的抑制作用。(P<0.05)。成组分析,给药第5天(T5),给药组与对照组比较,有显著的抑制作用。(P<0.05)。2.第二批实验结果表明见表3,4,图2。5.0g/kg组在给药后不同时间,鸭血清DHBV-DNA,OD值与给药前(T0)比较,给药后第5天(T5)、10天(T10),和停药后第3天(P3),有非常显著和显著抑制作用,(P<0.01-0.05),成组分析,与对照组抑制%作对比分析,给药第5天(T5)、第10天(T10),有非常显著和显著抑制作用,(P<0.01-0.05)。2.5g/kg组,配对分析,给药后第10天(T10),有非常显著抑制作用,(P<0.01),成组分析,与对照组抑制%作对比分析,给药第10天(T10),有显著抑制作用,(P<0.05)。1.25g/kg组,抑制作用不明显。3.第三批重复实验结果表明见表3,4,图3。5.0g/kg组给药后第5,10天,DHBV-DNA与给药前比较,配对分析,有非常显著和显著抑制作用,(P<0.01-0.05),成组分析,与对照组抑制%作对比分析,给药第5天(T5),有非常显著抑制作用,(P<0.01)。2.5g/kg组,配对分析,与给药前比较,给药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3),有非常显著和显著抑制作用,(P<0.05,0.01,0.05)。成组分析,与对照组抑制%作对比分析,给药第5天(T5)、第10天(T10),有显著和非常显著抑制作用,(P<0.05-0.01)。1.25g,抑制作用不明显。表3本发明实施例5的第一种组合物在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA OD值比较实验 剂量 鸭数(只) 鸭血清DHBV-DNA OD490值(X±SD)P3组别批次 g/kg bid×10 T0T5 T10生理盐水 60.958±0.06 0.926±0.07 0.930±0.07 0.910±0.07本发明实施 1.25 60.938±0.09 0.738±0.10**0.836±0.13 0.783±0.19I例5的第一 2.5 60.918±0.06 0.775±0.09* 0.675±0.08** 0.698±0.05**种组合物5.0 61.291±0.21 0.985±0.23**0.916±0.16** 0.943±0.09**生理盐水 60.549±0.05 0.528±0.04 0.514±0.03 0.515±0.03本发明实施 1.25 60.638±0.15 0.529±0.09 0.526±0.08 0.546±0.09II例5的第一 2.5 60.731±0.05 0.665±0.09 0.576±0.04** 0.656±0.06种组合物5.0 61.251±0.38 0.675±0.26**0.758±0.28** 0.810±0.24*生理盐水 60.802±0.05 0.795±0.06 0.755±0.02 0.776±0.08本发明实施 1.25 60.989±0.05 0.985±0.20 0.955±0.21 0.896±0.09III 例5的第一 2.5 61.383±0.23 1.005±0.10* 0.985±0.09** 0.995±0.13*种组合物5.0 61.385±0.09 0.679±0.32**0.915±0.39* 1.230±0.293TC 0.05 61.554±0.17 1.195±0.62 0.657±0.20** 1.742±0.14统计处理t1,P1给药组不同时间(T5、T10,P3)鸭血清DHBV-DNA OD值与感染前(T0)OD值比较(配对t检验)。*p1<0.05,**p1<0.01。表4.在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服本发明实施例5的第一种组合物治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较实验 剂量 鸭数 抑制率(%)药物(只) T5 P3批次 g/kg bid×10 T10病毒对照 63.32 2.91 4.90本发明实施例5的1.25 621.25* 10.25 16.18I 第一种组合物 2.5 615.25* 25.97 23.78*5.0 623.13**29.15** 26.35**病毒对照 63.51 5.86 5.62本发明实施例5的1.25 616.96* 17.58 14.25II 第一种组合物2.5 69.12 21.50*10.265.0 646.09**38.80*35.27*病毒对照 60.88 5.65 2.99本发明实施例5的1.25 60.41 3.18 9.25第一种组合物III2.5 627.21* 28.69** 27.865.0 650.98**33.98 11.563TC50mg/kg 623.88 56.67** -13.16病毒对照 63.32 2.91 4.90本发明实施例5的1.25 619.57* 8.31 14.80I 第一种组合物2.5 613.52 23.68 22.03*5.0 619.39**26.76** 23.96**II 病毒对照 63.51 5.86 5.62本发明实施例5的1.25610.50 6.687.06第一种组合物2.5 66.8617.02* 6.165.0 636.35** 26.80* 20.01病毒对照 60.885.652.99本发明实施例5的1.256-5.34 0.235.94第一种组合物III2.5 619.93* 26.39** 23.565.0 650.82** 32.87 9.533TC 50mg/kg 623.88 56.67** -13.16统计处理t2,P2给药组不同时间(T5、T10,P3)鸭血清DHBV-DNA水平与感染前(T0)比较的抑制%与病毒对照组抑制%比较(成组t检验)。*p2<0.05,**p2<0.01,***p2<0.001。总结本发明实施例5的第一种组合物在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗实验,三批实验结果表明鸭乙型肝炎病毒感染鸭在感染后第7天口服本发明实施例5的第一种组合物治疗,5.0g/kg一天2次10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果有非常显著性作用,(P<0.01),无毒性反应;2.5g/kg组在实验中给药第5,10天,具有一定的抑制作用。有显著和非常显著性作用,(P<0.05,0.01)。实验中1.25g/kg组,无明显抑制作用。阳性药拉米夫定口服对DHBV-DNA的抑制作用,有非常显著的抑制作用。与以往多次实验结果一致。以上实验结果表明本发明实施例5的第一种组合物治疗鸭乙型肝炎病毒感染鸭有效,有效剂量为2.5-5.0g/kg,一天2次10天。
用实施例1的组合物、实施例2组合物和实施例6的组合物进行上述试验,也得到了基本相同的结果,说明这些组合物治疗鸭乙型肝炎病毒感染鸭有效。
实施例9含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的抗流感病毒实验流感病毒的分离和鉴(滴)定目前常用鸡胚进行分离进行流感病毒,接种途径为鸡胚的尿囊腔,3天后出现后鸡胚死亡的病变特征和出现血凝素,对此,我们采用此方法进行对本发明实施例1,2或5得到的组合物的鉴定。我们采用一定浓度的提取液和4个血凝单位的流感病毒1∶1混合,让二者于室温作用20分钟后再注射鸡胚,注射量为每胚0.2ml。实验采用9至11日龄的鸡胚,进行尿囊腔接种,培养48小时后,于4℃放置过液,然后无菌取其尿液,经1000rpm离心10分钟后取上清,分装,-20℃存放,备检测之用,尿液的检测分血凝和血抑两种,使用的红细胞是来亨公鸡,方法为常规法。
抗病毒实验用不同浓度的本发明实施例5,6,1或2得到的组合物在鸡胚中进行抗病毒实验表5流感病毒血凝抑制试验血清稀释度原液 10× 20× 40× 80× 160× 320× 640× 1280×样品浓度原液1 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++++++原液2 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++++++原液3 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++原液4 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-5a++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++++++10-5b++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++++++10-5c++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-5d++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-6a++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-6b++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++ +++++10-6c++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++10-6d++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++++++ +++备注1、原液指初始浓度的二氢杨梅素4mg/ml2、10-5与10-6指从本发明实施例5的第一种组合物原液进行药的稀释度3、判定结果时按血凝强度分别以++++、+++、++、-表示以50%红细胞出现凝集++的血凝稀释度为其血凝下降红细胞呈细沙粒样无效主孔(管)底者为+++,即100%凝集;红细胞均匀铺于孔(管)底,但边缘不整而稍向孔(管)底集中者为+++,即75%凝集;红细胞于孔(管)底形成一个环状,四周有小凝集块者为++,即50%凝集;红细胞于孔(管)底形成圆团,但边缘不够光滑,四周稍有凝集块者为+,即25%凝集;红细胞于孔(管)底形成圆团,边缘光滑整齐者为一,即无凝集。
上述实验数据证明含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物具有抗流感病毒作用。
实施例10本发明的含有含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物增强免疫系统免疫力的功能的试验1.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响1.1实验目的观察含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠吞噬功能的影响。
1.2受试药物名称含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物溶剂热双蒸水用量0.5ml/20g小鼠1.3对照样品联苯双酯;上海天平制药厂,沪卫药准字(1995)第3765号-0111.4动物小鼠,昆明种,雄性,19~21g。
鸡红细胞5%浓度1.5方法昆明种小鼠,随机分为5组,即对照组、含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物75、150、300mg/kg、联苯双酯150mg/kg,对照组给予生理盐水,给药组均口服给药,每日1次,共6次,末次给药同时腹腔注射0.5%水解乳蛋白1.5ml/只,24小时后腹腔注射5%鸡红细胞0.1ml,30分钟后断头放血,用生理盐水冲洗腹腔,收集腹腔巨噬细胞37℃孵育半小时,离心,沉淀物涂片,染色,油镜下计数细胞,以下列公式计算,并与对照组比较。
1.6结果结果见表6,含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物低、中、高剂量均能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞及增加吞噬指数,联苯双酯150mg/kg剂量组也能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。
表6.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±SD)
**P<0.01与模型对照组比较2.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响2.1实验目的观察含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
2.2受试药物名称含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物溶剂热双蒸水用量0.5ml/20g小鼠2.3对照样品联苯双酯;上海天平制药厂,沪卫药准字(1995)第3765号-0112.4动物小鼠,C57BL/6,♂,19~21g。
2.5其他材料刀豆球蛋白(ConA)Sigma产品,50μg/ml浓度3H-TdR上海原子核研究所,放射性浓度1mci/ml培养基RPMI-1640,内含15%小牛血清、巯基乙醇、Hepes等2.6方法C57BL/6小鼠,随机分为5组,即正常对照组、含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物75、150、300mg/kg、联苯双酯150mg/kg,每天口服给药1次,连续7天,给药结束后,处死动物无菌条件下取脾,计数脾细胞,并调整细胞浓度为1×107/ml,在96孔细胞培养板上每孔加细胞悬液100μl,ConA 50μl,和培养液,各组均设三复管,37℃,5%CO2条件下培养48小时,加入3H-TdR 0.5μci/孔,继续培养18小时,用多头细胞收集器收集细胞,在液闪仪上测CPM值,并与对照组比较,结果见表7。
2.7结果表7.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
*P<0.05**P<0.01与对照组比较结果表明,含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物有明显的促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用,并以低剂量作用较其它两组强。
用实施例1、实施例2和实施例6的组合物进行试验,得到了大致相同的试验结果,说明这些组合物都有增强免疫力的功能。
本发明公开了含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备广谱抗病毒药物和制备提高免疫力药物中的用途,其中所述含有二氢杨梅索和杨梅素的组合物中二氢杨梅素含量是20%至98%重量比,杨梅素含量是2%至80%重量比,所述药物组合物所抗病毒是乙肝病毒、流感病毒和/或冠状病毒。
含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物用于抗病毒等药物制作方法
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