专利名称：一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证的制作方法沙门氏菌是一种革兰阴性兼性厌氧菌，是重要的人畜共患肠道传染病病原菌，其传播途径主要为粪-口传播，大多数由食物传播，少数介水传播。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典，由于食用猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒，7717人中毒， 90人死亡。由于沙门氏菌型、菌株不同，使人发病的菌量也不同，一般食入含IO6 IO7Cfu/ g沙门菌的食品即可发病。据报道，沙门氏菌病为欧盟第二大爆发频繁的人畜共患传染病。 2005年，平均发病率为每10万人口发生38. 2例。人畜感染沙门氏菌后可呈无症状带菌，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率或者降低动物的繁殖生产力， 给国家经济造成巨大损失，同时严重威胁着人民的身体健康。护唇类化妆品如唇彩，唇膏，唇线笔，口红等系列产品，其组分配方中多含有角沙烷，胶原，尿囊素，软骨素硫酸等动物组织或提取物，由于其使用的特殊性，可能会有一部分被食入口中，引起细菌的感染。而沙门氏菌作为护唇类化妆品中主要的病原菌之一，可通过人、畜、禽类粪便或带菌接触，对人类具有明确的肠道致病意义，甚至也可导致局部感染，应对其进行方法学验证及检查。目前，在我国化妆品标准规范中，对这种含有动物组织包括提取物的护唇类产品，其微生物检验方法中却没有沙门氏菌的检验方法。国内、外的文献报道及专利记载中均没有护唇类化妆品中沙门氏菌的检验方法报道。
本发明的目的是提供一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证。本发明的技术方案一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证，所述的检测步骤如下1. 1菌液制备方法按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查试验菌液的制备方法，取经30 35°C培养18 M小时的沙门菌营养肉汤新鲜培养物1ml，加入9ml 质量体积百分比0. 9%的无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成10 IOOcfu的菌悬液备用；1. 2试验组1. 2. 1前增菌和增菌取供试品10g，加入无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各 10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混勻溶解，再加入试验用沙门氏菌悬液10 IOOcfu Iml于36士 1°C 18 M小时培养，取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36 士 1°C培养18 24小时；1. 2. 2分离取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BS) 和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和18 M小时(HE)，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色；1. 2. 3初步鉴定试验从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)平板上各挑取2 3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18 M 小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产气(H2S)；1. 2. 4镜检挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂培养基平板上，于36士 1°C 18 M小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌；1.2. 5生化试验(1)靛基质试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基細1/管中，于36士 1°C培养1 2天，必要时可延长至4 5天，加入柯凡克试剂约 0. 5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；(2)尿素酶试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36士 1°C培养M小时，观察结果，培养基未产碱变色；(3)氰化钾及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36士 1°C培养M小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口 ；于36士 1°C培养1 2天，观察结果，实验管澄清，对照管浑浊；(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，細1/管，培养18 M小时， 观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；以上生化实验结果为靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致。1.2. 6血清凝集试验取1滴A F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI) 琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混勻，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混勻作对照试验，结果对照无凝集现象，为血清凝集阴性反应；1.3阳性组1. 3. 1前增菌和增菌试验取无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混勻，再加入试验用沙门菌液10 IOOcfu Iml于36士 1°C，培养18 M小时，取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至 100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS) 至100ml，36士 1°C培养18 24小时；1. 3. 2分离取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和 18 M小时Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色；1. 3. 3初步鉴定试验从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)平板上各挑取2 3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18 M 小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产气(H2S)；1. 3. 4镜检挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂平板上于36士 1 °C 18 M小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌；1. 3. 5生化试验(1)靛基质试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基細1/管中，于36 士 1°C培养1 2天，必要时可延长至4 5天，加入柯凡克试剂约 0. 5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；(2)尿素酶试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36士 1°C培养M小时，观察结果，培养基未产碱变色；(3)氰化钾及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36士 1°C培养M小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口 ；于36士 1°C培养1 2天，观察结果，实验管澄清，对照管浑浊；(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，細1/管，培养18 M小时， 观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；以上生化实验结果为靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致。1.3. 6血清凝集试验取1滴A F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI) 琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混勻，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混勻作对照试验，结果对照无凝集现象，为血清凝集阴性反应；1. 4阴性组1. 4. 1前增菌和增菌分别取无菌聚山黎脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研勻加至胰酪胨大豆肉汤培养基中于36士 1°C 18 M小时培养，取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36 士 1°C培养18 M小时；1. 4. 2分离取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和1个 Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和18 M 小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应；1.5样品组1. 5. 1前增菌和增菌取供试品10g，再分别取无菌聚山黎脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研勻加至胰酪胨大豆肉汤培养基中于36士 1°C 18 M小时培养；取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36士 1°C培养18 M小时；1. 5. 2分离取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和1个 Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和18 M 小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应。本发明结合了食品安全国家标准中沙门氏菌的检测方法，既实现了护唇类化妆产品中沙门氏菌检测的需要，又由于选择性效果明显，避免了样品中其他杂菌的干扰，有利于沙门氏菌的快速定量。本发明为制定护唇类化妆产品中沙门菌的检查提供了理论指导，为提高护唇类化妆产品的产品质量具有重要的指导意义。2. 1菌液制备方法按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查试验菌液的制备方法，取经30 35°C培养18 M小时的沙门菌营养肉汤新鲜培养物1ml，加入9ml 质量体积百分比0. 9%的无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成10 IOOcfu的菌悬液备用。2. 2试验组2. 2. 1前增菌和增菌取供试品10g，加入无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各 10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混勻溶解，再加入试验用沙门菌悬液10 IOOcfu Iml于36士 1°C 18 M小时培养，取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36士 1°C培养18 24小时。2. 2. 2分离取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36士 1°C分别培养18 M小时(HE) 和40 48小时(BQ，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色。2. 2. 3初步鉴定试验从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)平板上各挑取2 3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18 M 小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产气(H2S)。2. 2. 4镜检挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂培养基平板上于36士 1 °C 18 M小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌。2. 2. 5生化试验(1)靛基质试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基細1/管中，于36士 1°C培养1 2天，必要时可延长至4 5天，加入柯凡克试剂约 0. 5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；(2)尿素酶试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36士 1°C培养M小时，观察结果，培养基未产碱变色；(3)氰化钾及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36士 1°C培养M小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口 ；于36士 1°C培养1 2天，观察结果，实验管澄清，对照管浑浊；(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，細1/管，培养18 M小时， 观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；以上生化实验结果为靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致。实验结果见表1。2. 2. 6血清凝集试验取1滴A F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI) 琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混勻，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混勻作对照试验，结果对照无凝集现象。为血清凝集阴性反应。 实验结果见表1。2. 3阳性组2. 3. 1前增菌和增菌试验取无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混勻，再加入试验用沙门菌液10 IOOcfu Iml于36士 1°C 18 M小时培养，取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至 100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS) 至100ml，36士 1°C培养18 24小时。2. 3. 2分离取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36士 1°C分别培养18 M小时(HE) 和40 48小时(BQ，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色。2. 3. 3初步鉴定试验从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基 (BS)平板上各挑取2 3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18 M 小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BQ平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产气(H2S)。2. 3. 4镜检挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂培养基平板上于36士 1 °C 18 M小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌。2. 3. 5生化试验(1)靛基质试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基細1/管中，于36士 1°C培养1 2天，必要时可延长至4 5天，加入柯凡克试剂约 0. 5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；(2)尿素酶试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36士 1°C培养M小时，观察结果，培养基未产碱变色；(3)氰化钾及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36士 1°C培养M小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口 ；于36士1°C培养1 2天，观察结果，实验管澄清， 对照管浑浊；(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，細1/管，培养18 M小时， 观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；以上生化实验结果为靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致。实验结果见表1。2. 3. 6血清凝集试验取1滴A F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI) 琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混勻，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混勻作对照试验，结果对照无凝集现象。为血清凝集阴性反应。 实验结果见表1。观察结果，菌落颜色略深于2. 2. 1试验组，形态均相同于2. 2. 1试验组菌落。2. 4阴性组2. 4. 1前增菌和增菌分别取无菌聚山梨脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研勻加至70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中于36士 1°C 18 M小时培养。取IOml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36 士 1°C培养18 24小时；2. 4. 2分离取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和1个 Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和18 M 小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应。实验结果见表1。2. 5样品组2. 5. 1前增菌和增菌取供试品10g，再分别取无菌聚山梨脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研勻加至70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中于36士 1°C 18 M小时培养。取IOml 培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42°C培养18 M小时；另取IOml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36士 1°C培养18 M小时。2. 5. 2分离取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和1个 Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36士 1°C分别培养40 48小时(BS)和18 M 小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BQ和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应。实验结果见表1。表1实验结果表
本发明涉及一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证，检测步骤如下①样品的前增菌、增菌培养；②显色培养基分离、培养；③培养物的初步鉴定试验；④镜检；⑤生化实验；⑥血清凝集试验；其中⑤和⑥为典型的沙门菌属确证实验。本发明结合了食品安全国家标准中沙门氏菌的检测方法，既实现了护唇类化妆产品中沙门氏菌检测的需要，又由于选择性效果明显，避免了样品中其他杂菌的干扰，有利于沙门氏菌的快速检出。本发明为制定护唇类化妆产品中沙门菌的检查提供了理论指导，为提高护唇类化妆产品的产品质量具有重要的指导意义。