专利名称：一种检测脱水蒜制品中沙门氏菌的方法食品卫生与安全问题同每个人的身体健康息息相关，历来被世界各国政府和主流传媒所关注。近年来随着人们对食品安全的关注度越来越高，特别是在近年来我国食品安全事故频发，与中国出口产品有关的食品质量安全事件时常见诸报端的大背景下，进口国对来自中国的食品检测越来越严格。我国是世界上最大的大蒜(Allium sativum L.)及其制品生产与出口国，已成为我国首位出口换汇蔬菜，其出口逐年增加。其中脱水蒜制品就是安徽省传统大宗出口农产品，产品主要出口日韩、欧美市场，出口量一直稳居全国前列。加强出口脱水蒜制品卫生检验监管不仅关系到单一产品出口，更是保护农产品全行业贸易正常进行。然而脱水蒜制品至今没有相关微生物检验标准出台，长期借用食品微生物GB4789 系列标准检验，但因为脱水蒜制品具有独特的产品特性，实际检测中暴露出大量问题，表现出明显的不适宜。没有合适检验标准对确保产品质量，消费者安全、保障农产品出口贸易顺畅构成很大隐患。因此开展脱水蒜制品的安全卫生检测技术的研发对于确保农产品贸易安全和消费者食用安全都有着重要的意义。脱水蒜制品主要为蒜粉、蒜粒和蒜片，是上好的调味品和保健食品原料，该广品选用优质大蒜，经过去皮、清洗、烘干、精选、磨粉、包装等多道工序加工而成。水分含量低于6%，不添加任何食品添加剂，不添加防腐剂。研究表明作为保健食品，对于消化不良、感冒、呼吸道感染、消化道溃疡、血脂偏高、血管硬化、患癌症的成年人士和中老年人心脏病、心脑血管疾病者；免疫力低下者均有辅助治疗的效果。蒜粉具有广谱抗菌和抑菌、杀菌作用可有效抑制大肠杆菌、沙门氏等有害菌类的生长、繁殖，对畜禽因革兰氏阴性及阳性菌感染引起的呼吸道、消化道疾病及其并发症显著疗效。大蒜素可有效刺激动物体内产生香味的氨基酸的形成，增加肉蛋中的香味成分，使肉蛋鲜味更美。加入饲料中可提高畜禽及鱼虾抗病能力，加快生长速度。有清瘟、解毒、活血化瘀的功能，可显著降低饲料中有效物质的毒性。脱水蒜制品蒜味浓烈、纯正，不产生抗药性，无毒无害，体内无残留。正是因为脱水蒜制品的优良品性，被越来越广泛的运用和消费，加强对其卫生安全研究才显得越发重要。脱水蒜制品的生产要经过多个环节，其中很多环节都存在微生物污染与繁殖的可能。那么为什么现行GB4789系列标准不适合脱水蒜制品的安全卫生检测呢？因为大蒜中含有一种天然植物抑菌剂大蒜素，蒜素是大蒜瓣和蒜精油中含硫化合物的总称，具有不同程度的杀(抑)菌作用，被誉为天然杀菌剂，有报道称它杀菌的能力几乎是青霉素的100倍！1/80000的大蒜素能抑制或杀灭葡萄球菌、链球菌、伤寒、痢疾杆菌等。大蒜鳞茎提取液对青霉、根霉、曲霉、木霉有明显的抑制作用。免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic Separation, IMS)整合了免疫反应的高度特异性和磁性分离的快速、简单优点，广泛用于细胞的分离提纯、体外扩增、HLA分型、靶向释药、微生物检测等。免疫磁性分离技术不但广泛用于医学的各个领域而且在食品卫生检测方面的应用也初见端倪。免疫磁珠分离技术能够有效分离纯化环境水样中的病原微生物，肠出血性大肠杆菌0157 H7等病原菌及两虫(贾第鞭毛虫、隐孢子虫)，此外该技术在病毒检测中也有良好应用前景。由于食品检样常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术，可以达到快速分离的目的。免疫磁性分离方法，是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病微生物不但得到分离，而且也得到浓集。免疫磁性分离技术以其特有的性能，在食品卫生检测和研究中取得了较好的结果。免疫磁分离技术就是将直径为0. 02 5 y m具有超顺磁性的微粒的表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原(待测菌)结合且有磁性的微珠，即免疫磁珠。在磁板背景下混合，如果有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，形成菌体一免疫磁珠复合物。接着在适当的磁场条件下，菌体一免疫磁珠复合物会分离出来，最后用其他方法进行测量，如传统的平板培养法、PCR、ELISA、光学传感器、电化学方法等。免疫磁珠分离技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高检测靶细菌的准确性，此外，在有些情况下可以节约12 18 h的培养时间。免疫磁分离技术是目前最具推广价值的技术之一。
本发明的目的旨在提供一种快速、有效地检测脱水蒜制品中沙门氏菌的方法。发明人认为针对脱水蒜制品中沙门氏菌的检测，应当解决样品中抑菌物质的干扰。故而，本发明提出以下技术方案 检测脱水蒜制品中沙门氏菌方法的具体操作步骤如下 (1)取蒜粉25g，加入225mL灭菌稀释液均质，经过有滤膜的均质袋过滤，吸取滤液，移A 500 mL离心瓶中，并得滤渣； (2)对滤渣进行第一次洗涤，即在滤渣中加入50mL灭菌稀释液边振荡边洗涤，振荡速率为70次/分钟，振荡时间为20分钟，得到第一次洗涤液和第一次滤渣，对第一次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第二次洗涤液和第二次滤渣，对第二次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第三次洗涤液和第三次滤渣，合并第一次洗涤液、第二次洗涤液和第三次洗涤液，得到合并液； (3)在合并液中加入浓度为lOmg/mL的沙门氏菌免疫磁珠缓冲液10-40y L，在温度25°C下振荡，振荡速率为70次/分钟，振荡时间为30分钟，得振荡物； (4)将振荡物在转速1800转/分钟条件下离心分离5分钟，接着在转速10000转/分钟条件下离心分离10分钟，除去上清液，得到离心沉淀物；
(5)在离心沉淀物中加入500mL缓冲蛋白胨水增菌液(参照国标GB4789系列)，温度 36°C培养24小时，得到培养液；
(6)在ImL培养液中加入10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(参照国标GB4789系列)，温度36 °C下培养24小时，所得培养物用全自动细菌检测系统(VIDAS )检测其中沙门氏菌的含量，检测得到的沙门氏菌含量即为脱水蒜制品中沙门氏菌的含量。所述灭菌稀释液的配置方法称取34. Og的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用175mL的lmol/L氢氧化钠溶液调节pH7. 2，用蒸馏水稀释至IOOOmL定容作为贮存液备用。取贮存液I. 25mL，用蒸馏水稀释至IOOOmL,分装于适宜容器中，121°C高压灭菌15分钟。所述滤膜孔径为330 u m、直径50mm。本发明的有益技术效果
(1)本发明通过免疫磁珠捕获样液中少量的目标菌，再将其从脱水蒜制品样品均质液中分离出来，以解决该检测难题。免疫磁珠分离技术很好地解决了脱水蒜制品中大蒜素抑菌作用对沙门氏菌检测的影响； (2)免疫磁珠分离技术检测靶细菌特异性强、灵敏度高，可以明显提高检测靶细菌的准 确性；
(3)本发明实现了脱水蒜制品中沙门氏菌的快速检测，检测时间仅需48小时。

I.I材料
沙门氏菌菌种{salmonella )由北京兰波瑞公司提供，沙门氏菌免疫磁珠缓冲液购自上海嘉禾生物科技有限公司，各种培养基由北京路桥公司提供，样品来自安徽东乾食品有限公司送检样品留样；缓冲蛋白胨水增菌液和亚硒酸盐胱氨酸增菌液配置参照国标GB4789系列；
1.2仪器
台式高速冷冻离心机(BECKMAN 64R)，立式高速冷冻离心机(BECKMAN J30I )，微量加样器0. 5 ii L 10 ii L，10 ii L 100 ii L，高压灭菌锅，VIDAS 30全自动细菌检测系统BAX Q7微生物检测系统，恒温摇床。2方法与结果
2.I免疫磁分离技术条件优化
取蒜粉25g，人工定量添加(一个麦氏单位)沙门氏菌菌种，加入225mL灭菌稀释液，均质后经过带滤膜的均质袋过滤，滤膜孔径为330 V- m、直径50mm,吸取滤液,移入500 mL离心瓶中。对滤渣进行第一次洗涤，即在滤渣中加入50mL灭菌稀释液边振荡边洗涤，振荡速率为70次/分钟，振荡时间为20分钟，得到第一次洗涤液和第一次滤渣，对第一次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第二次洗涤液和第二次滤渣，对第二次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第三次洗涤液和第三次滤渣，合并第一次洗涤液、第二次洗涤液和第三次洗涤液，得到合并液；
在合并液中加入浓度为lOmg/mL沙门氏菌免疫磁珠缓冲液(Dynabeads) 10_40iiL，在温度25°C下柔和振荡，振荡速率为70次/分钟，振荡时间为30分钟，得振荡物；将振荡物在转速1800转/分钟条件下离心分离5分钟，接着在转速10000转/分钟条件下离心分离10分钟，除去上清液，得到离心沉淀物；
在离心沉淀物中加入500 mL缓冲蛋白胨水增菌液，温度36°C培养24小时，得到培养液；
在ImL培养液中加入10 mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液，温度36°C下培养24小时，所得培养物用全自动细菌检测系统(VIDAS)检测其中沙门氏菌的含量，检测得到的沙门氏菌含量即为脱水蒜制品中沙门氏菌的含量。表I免疫磁分离技术捕获沙门氏菌条件优化
2.2检测方法灵敏度测定
取蒜粉25g，人工定量添加(一个麦氏单位)沙门氏菌菌种，加入225mL灭菌稀释液，均质后经带滤膜的均质袋过滤(滤膜孔径为330 V- m、直径50mm),吸取滤液,移入500 mL离心瓶中。在滤渣中加入50mL灭菌稀释液边振荡边洗涤(振荡速率为70次/分钟，振荡时间为20分钟)得到第一次洗涤液和第一次滤渣，对第一次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第二次洗涤液和第二次滤渣，对第二次滤渣按第一次洗涤条件进行洗涤，得到第三次洗涤液和第三次滤渣，将第一次洗涤液、第二次洗涤液和第三次洗涤液合并为合并液；
合并液中加入浓度为lOmg/mL沙门氏菌免疫磁珠缓冲液40 u L，在温度25°C下振荡(振荡速率为70次/分钟，振荡时间为30分钟)得振荡物；
将振荡物在转速1800转/分钟条件下离心5分钟，接着在转速10000转/分钟条件下离心10分钟，除去上清液，得到离心沉淀物；在离心沉淀物中加入500 mL缓冲蛋白胨水增菌液，温度36°C培养24小时，得到培养液；
在ImL培养液中加入10 mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液，温度36°C下培养24小时，所得培养物用全自动细菌检测系统(VIDAS)检测其中沙门氏菌的含量。表2免疫磁珠法检测方法灵敏度测定2.3研究显示在使用沙门氏菌免疫磁珠时，用量为40ii L、孵育时间达到20分钟，既可满足检测要求，又相对节省试剂 和时间。菌量稀少时适当延长孵育时间，增加免疫磁珠用量会有正面意义。


本发明公开了采用免疫磁珠分离技术检测脱水蒜制品中沙门氏菌的方法。该方法包括如下操作步骤(1)将蒜粉加入灭菌稀释液，均质后经带滤膜的均质袋过滤，得滤渣；(2)用灭菌稀释液边振荡边洗涤滤渣三次，合并三次的洗涤液；(3)将沙门氏菌免疫磁珠缓冲液和合并的洗涤液振荡；(4)离心分离，得到离心沉淀物；(5)在离心沉淀物中加入缓冲蛋白胨水增菌液，培养24小时；(6)移取培养液，再加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行增菌培养，培养结束后使用全自动细菌检测系统(VIDAS)检测脱水蒜制品中沙门氏菌。本发明利用免疫磁珠技术建立脱水蒜制品中沙门氏菌的快速检测，这一技术具有特异性强、灵敏度高的优点。