蛋白质的快速脱水制作方法

巴里·道格拉斯·穆尔, 玛丽·克莱尔·帕克, 彼得·詹姆斯·哈林, 约安·帕特里奇

2002年7月31日

2000年5月15日

1999年5月13日

斯特拉斯克莱德大学, 格拉斯哥大学董事会

A61K47/02GK1361789SQ0080960

脱水 蛋白质 快速

1.小于50μm的水溶性结晶形粒子，包含一种共沉淀剂和脱水的生物高分子，所述的生物高分子位于或接近于粒子的外表面2.根据权利要求1所述的水溶性粒子，其中所述的共沉淀剂为部分结晶的或完全结晶的3.根据前述任一权利要求所述的水溶性粒子，其中所述的脱水生物高分子选自肽、多肽、蛋白质和核酸4.根据前述任一权利要求所述的水溶性粒子，其颗粒直径小于10μm5.根据前述任一权利要求所述的水溶性粒子，其中共沉淀剂选自无机盐，如硫酸钾和氯化钾；糖、多糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，如海藻糖，其分子量一般小于10000Da；氨基酸，如甘氨酸和精氨酸；酸-碱缓冲剂，如磷酸氢钾、MOPS和POPSO；两性离子化合物，如甜菜碱；有机盐，如胆碱和苯甲酸钠；含有多个碱性基团的化合物，如亚精胺和亚精胺盐；含有多个酸性基团的化合物，如柠檬酸和柠檬酸盐；胆汁盐；水溶性染料；极性或离子聚合物；和极性或离子型树枝形物6.制备水溶性粒子的方法，包括以下步骤a)制备含有共沉淀剂和生物高分子的水溶液；b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物活性分子从溶液中立即共沉淀出来，形成所述的粒子；和c)从有机溶剂中分离出所述的粒子7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的包含共沉淀剂和生物高分子的水溶液是通过将共沉淀剂溶解于含有生物高分子的水溶液中制备的8.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于将生物高分子/共沉淀剂溶液加入到可与水混溶的有机溶剂中9.根据权利要求6至8中任何一个所述的方法，其中生物高分子与共沉淀剂的摩尔比大于5010.根据权利要求6至9中任何一个所述的方法，其中共沉淀剂选自无机盐，如硫酸钾和氯化钾；糖、多糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，如海藻糖，其分子量一般小于10000Da；氨基酸，如甘氨酸和精氨酸；酸-碱缓冲剂，如磷酸氢钾、MOPS和POPSO；两性离子化合物，如甜菜碱；有机盐，如胆碱和苯甲酸钠；含有多个碱性基团的化合物，如亚精胺和亚精胺盐；含有多个酸性基团的化合物，如柠檬酸和柠檬酸盐；胆汁盐；水溶性染料；极性或离子聚合物；和极性或离子型树枝形物11.根据权利要求6至10中任何一个所述的方法，其中有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮12.根据权利要求6至11中任何一个所述的方法，其中所形成的粒子是结晶形的13.根据权利要求6至12中任何一个所述的方法，其中所形成的粒子是以共沉淀物为内核，生物高分子位于或接近于粒子的外表面14.按照权利要求6至13中任何一个所述的方法得到的粒子15.一种药物制剂，包括权利要求1至5中任何一个或14所述的粒子和与其适合的载体16.一种医疗设备，包含权利要求1至5中任何一个或14所述的与之相关的粒子17.权利要求1至5中任何一个或14所述的用于治疗的粒子18.一种生物催化剂制剂，包含权利要求1至5中任何一个或14所述的与之相关的粒子19.一种清洗剂，包含权利要求1至5中任何一个或14所述的酶包膜的粒子20.一种保护剂或防污剂，包含权利要求1至5中任何一个或14所述的粒子，该保护剂或防污剂与油漆、清漆、涂料或薄膜一起使用21.权利要求1至5中任何一个或14所述粒子在制备薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和光学材料中的应用，这些材料可用作诊断用具和生物传感器22.权利要求1至5中任何一个或14所述的粒子在非水介质中对分子识别、分子粘合、分子印刻或抑制剂粘合的研究中的应用23.权利要求1至5中任何一个或14所述的粒子在用扫描探测显微镜对大分子结构和/或有机体的研究中的应用24.从水溶液中分离生物高分子的方法，包括以下步骤a)制备水溶液，该水溶液含有共沉淀剂和需要分离的生物高分子的混合物；和b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，同时生物高分子快速脱水

本发明涉及含有生物高分子的水溶性粒子，和从水溶液中分离生物高分子同时使蛋白质脱水的方法，提供了蛋白质生物高分子粒子本发明还涉及与水可混溶的、含有沉淀于其中的蛋白质的有机溶剂本发明还发现了以下的具体用途制备用于生物催化剂的酶；制备用于药物制剂的治疗蛋白质；生产含有酶的清洗剂；生产含有具有防护和/或防污性能蛋白质的油漆、清漆、涂料、薄膜等；生产含有蛋白质的薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和/或光学材料，所述的这些材料可用于诊断用具和/或生物传感器；蛋白质用于在非水介质中对分子识别、分子粘合、抑制剂粘合的研究；制备用于食品添加剂的酶另外，沉淀出来的生物高分子然后可溶解在有机溶剂中，以用于前述的至少一种应用中，和在固态化学中应用，例如制备用于对键合到不溶性载体上的化合物进行粘附，裂解和/或改性的催化剂蛋白质有很多的用途，但是一般来说，用于治疗用途时，则需要制备的蛋白质在使用时基本上不含杂质纯化的方法有许多种，例如差速离心法、选择沉淀法、溶剂抽提法和色谱法另外在使用前还经常需要对蛋白质进行脱水或干燥，也就是需要脱除蛋白质中的水分，以便更容易处理和/或延长蛋白质的保存期限众所周知，典型的蛋白质脱水方法有冷冻干燥技术、真空干燥技术或空气干燥技术然而，这些技术却存在一些缺点，例如，干燥方法一般时间较长而且费用较高此外，即使采用冷冻干燥的方法也会降低蛋白质的功能，特别是对于酶和脆性蛋白质为了保持蛋白质的功能，经常需要另外添加起稳定作用的赋形剂然而，例如从对于医用蛋白质被调整的角度看，加入稳定化赋形剂本身尤其是不受欢迎的US5,198,353中公开了一种制备固定化酶分散液的方法，其中公开了将聚合物与酶从水溶液中共沉淀出来得到精细分散的酶的方法，该酶可用于水性液体洗涤剂中通过加入盐或有机溶剂可使聚合物和酶沉淀当使用有机溶剂作为沉淀剂时，有机溶剂在强烈的搅拌下缓慢地加入到蛋白质/聚合物水溶液中，以使蛋白质沉淀然而，此种加入方式和有机溶剂的加入量并不足以使蛋白质充分和快速的脱水US5,589,167和US5,753,219公开了经有机溶剂处理的多肽的赋形剂稳定方法，在该方法中采用多元醇例如海藻糖来稳定干燥的或水溶性的经有机溶剂处理的多肽然而，该方法并没有提示多元醇可以与蛋白质在有机溶剂中进行共沉淀或对于蛋白质脱水的相关性/重要性Randen等(J.Pharm.Pharmcol.，1988，40，761-766)公开了采用酶与水溶性淀粉进行共沉淀来代替冷冻干燥法在与有机溶剂丙酮、乙醇或丙醇混合时，其将分子量为12700-100000的淀粉作为磷虾蛋白酶的共沉淀剂沉淀所得的颗粒为不规则的针形，具有较低的密度，颗粒大小为200-700μm粒子干燥后须进一步研磨或粉碎处理以获得较均匀的颗粒尺寸分布后来，Bustos等(J.Chem.Tech.Biotechnol.，1996，65，193-199)引用Randen等的文章公开了可使用其它聚合物作为共沉淀剂所公开的聚合物有水解的胶原蛋白、酪蛋白和麦芽糖糊精PSM10(12,100Mw)和PSM100(100,100Mw)本发明的目的之一是提供一种从水溶液中分离蛋白质同时使蛋白质脱水的快速方法本发明实施方案的另一个目的是提供生物活性分子包膜的粒子，例如蛋白质/核酸包膜的微晶另一方面，本发明提供了一种制备水溶性粒子的方法，包括以下步骤a)制备含有共沉淀剂和生物高分子的水溶液；b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，形成所述的粒子；和c)从有机溶剂中分离出所述的粒子应该理解，术语“生物高分子”是指蛋白质、肽、多肽等，或核酸，例如DNA或RNA下文所涉及的生物高分子一般均是参照蛋白质制备的然而，应该理解，这种参照与上述其他的生物高分子是可以相同的术语“结晶形”是指包含平面的三维形状，因此区别于一般的球形或球状体形状应该理解，术语“共沉淀剂”是指在加入有机溶剂时，可与蛋白质一起从溶液中沉淀出来的化合物；术语“共沉淀物”是作为名词使用的，是指生物活性高分子与共沉淀剂的复合物从水溶液中分离出的蛋白质可以是任何蛋白质或蛋白质的混合物典型的蛋白质包括酶，如枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶；血液蛋白，如清蛋白、纤维蛋白原、凝血酶和血液因子；和治疗蛋白，如胰岛素、抗体、血液和转运蛋白、调节蛋白、糖蛋白、脂蛋白、激素和干扰素共沉淀剂可以是固态的，例如粉末，其可以溶解在水溶液中共沉淀剂在溶解于水溶液之前也可以是溶液或悬浮液优选的共沉淀剂可以是完全饱和的溶液或高浓度的溶液共沉淀剂必须充分地溶解在水溶液中，使其在溶液中相对于蛋白质有一个适当的重量分数所希望的共沉淀剂应该在所选择的溶剂中的溶解度应该大大地低于在水溶液中的溶解度另外，若想得到较好分离的共沉淀物粒子，则要求共沉淀剂应该是结晶形的，并且具有较高的熔点所要求的共沉淀剂的浓度是蛋白质在水溶液中的数量和蛋白质分子量的函数一般而言，在沉淀之前，溶液中共沉淀剂与蛋白质的摩尔比应较高具体地，共沉淀剂与蛋白质的摩尔比应大于50；优选大于200；更优选大于400当暴露于潮湿的环境中时，优选共沉淀剂的固体形式(也可以是其水合物)应该吸很少的水在用于共沉淀的有机溶剂中，应该优选共沉淀剂具有较低的溶解度所选择的共沉淀剂应几乎或基本上不使蛋白质变性至少满足部分上述所需性能的共沉淀剂可选择如下无机盐，如硫酸钾和氯化钾；糖、多糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，如海藻糖，其分子量一般小于10000Da；氨基酸，如甘氨酸和精氨酸；酸-碱缓冲剂，如磷酸氢钾、MOPS和POPSO；两性离子化合物，如甜菜碱；有机盐，如胆碱和苯甲酸钠；含有多个碱性基团的化合物，如亚精胺和亚精胺盐；含有多个酸性基团的化合物，如柠檬酸和柠檬酸盐；胆汁盐；水溶性染料；极性或离子聚合物；和极性或离子树枝形物(dendrimer)当将蛋白质-共沉淀剂溶液和与水混溶的有机溶剂或与水混溶的溶剂混合物进行混合时，优选的溶剂或溶剂混合物是可完全与水混溶的应该指出的是，为了保证蛋白质-共沉淀剂溶液的快速脱水，蛋白质-共沉淀剂溶液优选加入到过量的有机溶剂中，而不是以其它方式加入从而，可获得重新析出的蛋白质包膜的粒子与水完全混溶的有机溶剂应大大地过量，使最终得到的溶剂/水溶液的混合物中，水的含量一般要小于30％，优选小于20-10％，最好小于5％(体积百分含量)因此，优选在最初的有机溶剂中，水的含量应小于10％(体积百分含量)或基本上是干燥的，但并不需要完全干燥合适的有机溶剂包含甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮在某些情况下，对有机溶剂可采用蛋白质和/或共沉淀剂进行预饱和，以保证在加入水溶液后两组分可共同沉淀出来应该理解，术语“掺合”是指在加入水溶液时，使有机溶剂与水溶液混合或搅拌的步骤这种混合必须是有效的，以使蛋白质在较短的时间内，与有机溶剂和水溶液形成的中间组分的混合物进行充分地接触，例如在25％-60％的溶剂中本行业的技术人员都会认识到，这种掺合并不意味着将全部的所需量的水溶液快速、完全地、一次性地加入到有机溶剂中，例如可采用滴加的方法另外，优选将蛋白质-共沉淀剂的溶液加入到过量的有机溶剂之中也就是说，将小体积的蛋白质-共沉淀剂溶液加入到大体积的过量有机溶剂中，使蛋白质-共沉淀剂溶液中的水迅速稀释到有机溶剂中，因而可使蛋白质快速脱水，形成蛋白质包膜的粒子另外，将水溶液加入到有机溶剂中的方法有很多，例如连续通入法、滴加法或喷洒、喷雾法沉淀过程的温度控制是可变化的，例如，水溶液和溶剂可被加热或冷却对于脆性蛋白质，冷却是十分有利的或者，水溶液混合物和溶剂的温度可以是不同的例如可控制溶剂的温度低于水溶液混合物的凝固点而且，压力也可以是变化的，例如高压有利于降低溶剂的挥发度在蛋白质-共沉淀剂溶液与过量有机溶剂掺合时，蛋白质和共沉淀剂的沉淀基本上是瞬间发生的然而，溶剂/水溶液的混合是可以在短时间内连续进行的，例如控制在5-15分钟，以便使尽可能多的蛋白质沉淀出来随着时间的进行，共沉淀物被沉淀出来后，需要对蛋白质包膜的粒子进行回收可采用如下方法进行共沉淀，例如，可采用离心分离和/或过滤的方法来快速地回收已沉淀出的蛋白质包膜的粒子然后采用简单地干燥方法蒸发残留的溶剂，以对蛋白质包膜的粒子进行干燥，使其不含溶剂现已发现，将沉淀出的蛋白质包膜的粒子置于有机溶剂中贮存是十分有利的，经过长时间的存放后，蛋白质仍然很好地保持了活性和稳定性另外，由于将沉淀的蛋白质保存于有机溶剂中，也可以防止细菌的侵蚀，因此增加了贮存寿命如果需要，可将沉淀出的蛋白质包膜的粒子通过进一步采用新鲜有机溶剂洗涤的方法，进一步脱水所沉淀出的蛋白质在使用前可重新溶于水溶液中也可以将所沉淀出的蛋白质直接溶解在有机溶剂中这需要采用以下试剂，例如可以采用有机溶解性的离子对试剂，非共价键键合的两性化合物例如非离子洗涤剂，或共价键连接的有机溶解性基团，例如PEG、长链烷基链、树枝形分子或聚合物现有技术曾经教导我们，离子对试剂可以用来将酶溶解于有机溶剂中，而离子对的产生使蛋白质溶解在水溶液中而本发明的方法则在很低水含量的条件下产生离子对，因此会带来一些潜在的优点，例如不会发生界面蛋白的变性；可以加强静电作用和/或极性作用；有可能直接溶解在极性溶剂中；可采用对水敏感的离子对试剂；可采用不同离子对试剂的混合物；可采用并不干扰离子化过程的固态酸碱缓冲剂来控制蛋白质的离子化态；蛋白质的溶解过程可以在控制水活性的条件下进行；不需要冷冻干燥步骤，并且该溶解过程仅需要简单的设备，因此很容易扩大生产本发明的方法也可使存在于水溶液中的可溶于有机溶剂的组分与蛋白质分离例如缓冲剂如三羟甲基氨基甲烷(Tris)，其游离碱形式可溶解于有机溶剂如乙醇中，通过沉淀可将其与蛋白质分离然而，需要通过向水溶液或有机溶剂中加入另一种可溶于有机溶剂的碱的方法，来使所有的缓冲剂转化为游离碱因此，本发明还公开了一种从蛋白质中除去不需要组分的方法，使不需要组分不与蛋白质一起共沉淀出来，而溶解在有机相中这可通过在蛋白质沉淀之前，向水溶液或有机溶剂中加入以下添加物的方法来实现，如酸、碱、离子对试剂和螯合剂本发明有很多方面的应用例如，酶-共沉淀剂粒子可用于生物催化剂，特别适用于在低水含量体系、有机溶剂和超临界流动的反应中与冻干法获得的粒子相比，本发明方法可得到精细、干燥的酶-共沉淀物粒子，其很好地保持了具有催化活性的酶结构，在低水含量体系、有机溶剂和超临界流动的生物催化作用中显示了突出的优点其应用包括精细化工和医药中间体有机合成反应中的生物催化作用、农用化学品、洗涤剂、脂肪、乳化剂、食品、维生素、甜味剂、香料和香水、单体和聚合物以及合成高分子和天然高分子的改进其他的应用还包括在组合生物催化作用中的应用，例如新的导向化合物的鉴定、酶催化的固-固态合成反应、肽的合成以及高温和低温的生物催化反应另外，酶-共沉淀物粒子中的生物催化剂还可以应用于化学品和聚合物的降解反应，例如有毒废物、化学和生化武器、家用和工业垃圾和自然资源中的废物的降解酶催化的方法与化学方法相比，通常具有区域专一性，结构对映性和立体定向性的优点另外，本发明的方法还可以用于药物制剂中具有治疗作用的生物活性分子的制备本发明的方法可以制备精细的、干燥的含有蛋白质和共沉淀剂的粒子因此，本发明的另一个方面是提供水溶性的、结晶形的、直径小于50μm的粒子，该粒子中含有共沉淀剂和脱水生物高分子，该脱水生物高分子位于或接近于粒子的外表面应该理解，术语“脱水生物高分子”是指基本上不与水缔合的生物高分子，术语“共沉淀剂”如前所定义典型地，所述的脱水生物高分子位于或接近于共沉淀剂的表面一般来讲，生物高分子经脱水后仍保持或基本保持其原来的结构，即其不会发生不可逆的变性例如如果生物高分子是酶时，则希望其保存于溶剂和/或在水溶性介质中再生时仍保持酶的大部分活性另外，酶和其他的生化催化剂处于脱水状态时，在低含量水的条件下，如有机溶剂中仍可有效地催化反应通过在低含量水的有机溶剂中，进行活性中心滴定试验可以探查在水解过程中蛋白质构型的保持程度在粒子中共沉淀剂优选为结晶的结晶的沉淀剂为粒子提供了一个致密中心，而脱水的蛋白质则位于或接近于粒子的表面这种最低程度的扩散限度使生物高分子的脱水状态很容易接近如溶剂、反应试剂、基材(培养基)、稳定剂或改性剂一般地，粒子的尺寸小于10μm，例如，小于5-1μm典型地，共沉淀物内的粒子具有非常均匀的尺寸和十分规则的结晶形状，例如立方体、菱形、片状和针形共沉淀物的结晶形状随共沉淀剂和蛋白质的不同而变化结晶形粒子所具有的平面表面使其非常适合于进行扫描探测显微镜和表面张力显微镜，例如原子力显微镜使用上述的技术可以记录脱水蛋白质在粒子表面的图象，并可探测其分布、组织和结构这种技术也可以用来探测蛋白质如膜蛋白的三级和四级结构，而采用X-射线晶体学是很难获得这种结构的应该理解，采用多种多样的如前所述的共沉淀剂均可以产生共沉淀物结晶一般地，这些粒子可以迅速地重新溶解在水溶液中或很容易地形成悬浮液，也可以采用如移液管(手动的或自动的)将其重新分散，因此对于医学用途来说，这些粒子作为复配蛋白质的起点是有吸引力的如果使用治疗蛋白，这些粒子可以应用于制药的多种形式的生产中，其包括片剂、膏状物、粉末、胶体、泡沫、气雾剂、悬浮液、绷带和膜片生物高分子包膜的粒子非常适于在粘膜表面上的运输，因此适于通过吸入法给药其粒子的尺寸大小非常适于通过吸入法进行肺部的给药，以达到肺脏中较低的肺泡区域，以利于血液的吸收，这样使对药物的吸收最为有效对于此种应用，最适宜的粒子尺寸为0.5-5μm需要时也可将蛋白质-共沉淀剂粒子与外加的赋形剂进行混合，所述赋形剂可起到例如填充剂、松散剂和/或粘合剂的作用还可将该粒子作为原料进一步进行加工，包括采用天然和合成的高分子对其进行包封以生产珠子、薄膜、纤维、绷带和胶布也可采用对粒子表面的包膜来改变其溶解性、加工性和分散性使用包膜后可以改变药的释放速度和改变粒子的表面性能本发明的方法还可以生产含有酶的清洗剂如前所述，本发明的方法可以制备精细的、干燥的含蛋白质和共沉淀剂的粒子，该粒子可以快速地重新溶解在水溶液中，因此该方法对于制备含酶的清洗剂也同样是具有吸引力的作为清洗应用时，可将酶结合进入片剂、膏状物、粉末、胶体、泡沫、气雾剂和悬浮液中需要时也可将蛋白质-共沉淀剂粒子与外加的赋形剂进行混合，所述赋形剂可起到例如填充剂、松散剂和/或粘合剂的作用实例包括a)制备可清洗隐形眼镜的含酶如蛋白酶或过氧化物酶的片剂，和b)制备含酶如蛋白酶、脂肪酶或纤维素酶的片剂、粉末或悬浮液，这些酶包含在用于对织物或洗碗机的洗涤粉末中还可将该粒子作为原料进一步进行加工，包括采用天然和合成的高分子对其进行包封可采用对粒子表面的包膜来改变粒子的溶解性、加工性和分散性包膜也可用来改变粒子的表面性能和改变粒子在溶剂中的性能或在水中的悬浮性能本发明的方法也可以用于生产油漆、清漆、涂料和薄膜，其含有起防护或防污作用的蛋白质可将精细的蛋白质—共沉淀剂粒子分散于载体介质中以制备涂料、清漆、涂层和薄膜，其分散方法类似于染料的分散如果采用酶如蛋白酶、脂肪酶或纤维素酶，则可使所得的涂料具有防污性能以防止活性生物体如细菌、酵母、真菌、微生物和软体动物的附着采用本发明的方法，也可以制备含有蛋白质的薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和光学材料，它们可用于诊断用具和生物传感器本发明精细的蛋白质—共沉淀剂粒子可分散于载体介质如涂料或墨水中，和用于制备测试带上的薄膜或涂层、电极或光学材料这些材料可用作诊断用具和生物传感器中的活性元件另外，根据本发明方法制备的蛋白质—共沉淀剂粒子还可以应用于在非水介质中对分子识别、分子粘合、分子印刻和抑制剂粘合的研究在蛋白质—共沉淀剂粒子中，蛋白质仍保持了类似原来的结构，酶仍具有高的催化活性因此，该沉淀物可以用来在非水介质中对分子识别、分子粘合和抑制剂粘合进行定量的研究例如在医学、鉴定科学和农业等应用中，其也可以用来对抑制剂和基材(培养基)设计的改进另外，本发明的蛋白质—共沉淀剂粒子还可以用做蛋白质基食品添加剂可以选择对人或动物的摄取或吸收无害的沉淀溶剂和共沉淀剂，使本发明的方法可用来快速和便宜地生产干燥的蛋白质基食品添加剂或药品下面将以实施例和参考附图对本发明作进一步地说明