用于激光扫描共聚焦显微镜检测三维培养体系的培养皿的制作方法 [0002]内皮细胞采用内皮细胞生长培养基(EGM)培养，间充质干细胞采用含有10%胎牛血清的DMEM (—种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基 [0003])培养。将内皮细胞与间充质干细胞按3:2，共计约16个混合于Iml胶冻状三维培养体系中。三维培养体系的配置主要采用鼠尾胶原和纤维蛋白原配置，该培养体系在4°条件下为液态，37°条件下可转化为胶冻状。为了观察三维培养体系中两种细胞的相互作用，可采用激光扫描共聚焦显微镜观察。 [0004]传统的激光共聚焦显微镜专用培养皿如图1所示，其为一上端敞口容器，容器配有培养皿盖，在培养皿底有一圆形小凹槽，由于小凹槽槽底比培养皿底部其余部位要薄，这样可以让激光扫描共聚焦显微镜发出的光束透过小凹槽槽底的薄层玻片来清楚地观察贴壁培养的细胞情况。但是，由于小凹槽的直径要小于培养皿底部直径，并且凹槽深度不超过Imm,因此在将三维培养体系构建于培养皿中会遇到以下困难:第一，如果将胶冻状三维培养体系建立在以小凹槽为底部的培养皿中，由于胶冻状三维培养体系缺少周围培养皿壁的支持，胶冻状三维培养体系可以出现形态改变，或向周围扩散，这些情况特别是在加入液体培养液后表现更为明显，有时甚至出现胶冻状三维培养体系溶解，不利于长期观察。第二，如果将胶冻状三维培养体系以培养皿壁为支撑进行构建，则需要大量的细胞和胶原，浪费实验材料，不利于成本节省。因此，我们在研究实施过程中，采用了新设计的适用于激光扫描共聚焦显微镜观察的培养皿，可以有效的解决上述困难。 实用新型内容 [0005]本实用新型对现有激光扫描共聚焦显微镜的专用培养皿进行改进，提供了结构简单，使用方便的适用于激光扫描共聚焦显微镜检测三维培养体系的培养皿。 [0006]为了解决原有激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿存在的上述问题，本实用新型采用了下列技术方案:
[0007]用于激光扫描共聚焦显微镜检测三维培养体系的培养皿，包括外培养皿，中空管状的内培养皿和培养皿盖，外培养皿底部设有一深度不超过Imm的圆形凹槽，内培养皿为中空管状容器，内培养皿与外培养皿之间设有定位支架，内培养皿通过定位支架竖直悬置于外培养皿内，内培养皿下端开口能伸入所述圆形凹槽内，且内培养皿下端与圆形凹槽的槽底、槽壁之间留有用于外培养皿，内培养皿之间培养液交换的间隙。
[0008]进一步改进:内培养皿上端低于外培养皿上端口 ；
[0009]进一步改进:外培养皿内壁设有两定位块,两定位块位于外培养皿内壁两相对侧，圆形凹槽位于外培养皿底部中心，所述定位支架为一中部宽而两端狭窄的椭圆形板，椭圆形板中心设有卡孔，所述内培养皿紧套在卡孔内，椭圆形板的两狭窄端挂靠在上述两定位块上。
[0010]进一步改进:定位块与外培养皿为一体玻璃结构。
[0011]本实用新型的有益效果是:
[0012]1、三维培养体系构建于内培养皿中，借助内培养皿内槽壁束缚培养体系，防止坍陷，有利于对三维培养体系长时间观察，因为内培养皿下端与外培养皿上圆形凹槽的槽底、槽壁之间间隙，使得，既可以保证内培养皿中培养体系的营养供应，又能防止内培养皿中三维体系因大范围接触培养液而出现漂浮或溶解；同时还能节省实验材料和细胞，有利于推广。
[0013]2、激光扫描共聚焦显微镜的激光束可通过外培养皿座部中心的圆形凹槽区射入，当内培养皿置入外培养皿后，这种在现有培养皿的基础上增加的内培养皿结构，内培养皿可用于构建较大体积的三维细胞培养体系，并且这种三维细胞培养体系可借助激光扫描共聚焦显微镜观测其中的细胞形态和功能，另外，这个构建的三维培养体系后期可用于组织学，分子生物学的检测。
[0014]3、内培养皿上端低于外培养皿上端口，内培养皿下端与圆形凹槽槽底之间留有间隙，这样可根据实验要求构建不同体积的三维细胞培养体系，培养液加在内培养皿与外培养皿之间的空间，培养液可借助内培养皿低部与圆形凹槽之间的间隙，以及内培养皿上端与外培养皿顶部的空间进行交换和流通，有利于三维培养体系的营养支持。将培养皿的盖子盖好，封闭整个培养体系，可保持培养体系的稳定性。
[0015]4、内培养皿通过定位支架竖直悬置于外培养皿内，结构简单,制作成本低，有利于推广使用。
[0016]5、定位支架的椭圆形板结构使得定位支架与外培养皿内壁之间也存在间隔，方便在外培养皿，内培养皿之间进行培养液添加和吸取。




[0017]图1为现有培养皿结构示意图。
[0018]图2为本实用新型中外培养皿结构示意图。
[0019]图3为本实用新型中培养皿盖结构示意图。
[0020]图4为本实用新型中内培养皿结构示意图。
[0021]图5为本实用新型结构示意图。
[0022]图6为本实用新型中内培养皿在外培养皿内卡装结构俯视图。


[0023]如图2至图6所示，用于激光扫描共聚焦显微镜检测三维培养体系的培养皿，包括外培养皿1，内培养皿3和培养皿盖2，外培养皿I底部设有一深度不超过1_的圆形凹槽，圆形凹槽位于外培养皿I底部中心。内培养皿3为中空管状容器，内培养皿3与外培养皿I之间设有定位支架，内培养皿通过定位支架竖直悬置于外培养皿内，且内培养皿上端低于外培养皿上端口 ；内培养皿下端开口能伸入所述圆形凹槽内，且内培养皿下端与圆形凹槽的槽底、槽壁之间留有用于外培养皿，内培养皿之间培养液交换的间隙。
[0024]具体实施结构:外培养皿I内壁设有两定位块，两定位块位于外培养皿内壁两相对侧，圆形凹槽位于外培养皿底部中心，定位支架为一中部宽而两端狭窄的椭圆形板，椭圆形板中心设有卡孔，内培养皿紧套在卡孔内，椭圆形板的两狭窄端挂靠在上述两定位块上。在外力作用下，内培养皿可相对卡孔上下滑动，通过调整内培养皿在卡孔上的位置，可实现内培养皿下端与圆形凹槽的槽底之间的间隙大小的调节，一般圆形凹槽深Imm时，保持培养皿下端与圆形凹槽的槽底之间的间隙在0.3-0.6mm范围内，间隙为0.4mm和0.5mm时最佳。
[0025]本实用新型在现有外培养皿I的基础上，增加了一个空心管状的内培养皿3。通过设计外培养皿1，内培养皿3尺寸，可借助这个内培养皿3与外培养皿I上的圆形凹槽一起构建高度达到40mm，直径140mm圆柱状的大体积胶冻状三维细胞培养体系，并且构建的三维细胞培养体系可用激光扫描共聚焦显微镜观测体系内的细胞形态和功能。例如:内皮细胞与间充质干细胞共培养是体外构建三维血管网的一种有效方法，一般两种细胞共培养成血管网的时间要12-18天，对比本实用新型与现有技术中两种培养皿结构，采用传统培养皿培养后，三维培养体系只能在圆形凹槽维持5-8天，5-8天之后会出现培养体系坍陷，漂浮，溶解，最终无法观察到血管网的形成。采用本实用新型技术培养皿，培养体系维持时间可以大大延长，实际使用过程中最长的观测时间达到了 38天，平均可达到22.3天，培养体系维持时间长度已足够血管网的构建和观测，而且对组织工程血管网的体外构建有很好的借鉴意义。
[0026]除了上述技术特点外，借助本实用新型构建的圆柱状的大体积胶冻状三维细胞培养体系空间，当要观察某两种细胞在大体积三维培养体系中的相关作用和形态学改变时，可将两种细胞建立在以鼠尾胶原为基质的三维细胞培养体系中，并可用激光扫描共聚焦显微镜进行观测。当要完成梯次构建大体积三维培养体系时，可借助内培养皿3，从内培养皿3上端口加入形成一层层累积叠加的培养体系，并且可借助激光扫描共聚焦显微镜对每次叠加和最终总体叠加的三维培养体系进行观测。