专利名称：一种降解作物秸秆的复合微生物菌剂及其制备方法与应用的制作方法我国是农业大国，农作物秸杆产量大、分布广、种类多。改革开放以来，随着中央对农业扶持力度的加大，我国农业迅速发展，秸杆产出量已超过7亿吨，但绝大多数秸杆被随意丢弃或直接焚烧，不仅能源利用率低，而且严重污染环境，对人类健康造成严重危害。另有一部分秸杆未经任何处理直接用于肥料、饲料的传统应用模式，严重制约着秸杆利转化率的进ー步提高，因此加快推进秸杆综合利用，对于稳定农业生态平衡、缓解资源约束、减轻环境压カ具有十分重要的意义。目前以秸杆为原料生产的有机肥在农村得到广泛推广。传统的有机肥生产エ艺采 用直接堆肥法，由干物料中的微生物数量和种类有限，微生物活性低，导致腐熟时间长，产生的有机肥质量不高。利用微生物可将秸杆彻底分解，并通过微生物自身的生长可获得大量的菌体蛋白，发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有很好的抗病虫害效果，有利于改良土壤结构，提高作物产量和品质。因此运用微生物法处理秸杆，可以大幅度提高秸杆的利用率，与直接堆肥法相比具有诸多优点。中国专利文献CN101775359A (申请号200910013635. 4)公开了ー种直接分解农作物秸杆发酵产沼气的专用微生物复合菌剂制备及其应用方法。此专用微生物复合菌剂为液态或固态，由腊状芽孢杆、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、球状芽孢杆菌、产芽孢梭菌、丙酮丁酸梭菌、巴氏梭菌、拜氏梭菌、热纤梭菌、绿色木霉、瑞氏木霉、黑曲霉中的一株或几株，经发酵培养后，组合复配而成。该方法通过采用几种微生物制成复合微生物菌剂分解农作物秸杆，加快了发酵产沼气的速度，提高了沼气产量。但该复合菌剂在快速分解作物秸杆方面，仍然无法满足秸杆产生速度，寻找新的可以快速分解作物秸杆的复合菌剂成为解决目前秸杆利用率不高的问题。
本发明针对现有技术的不足，提供一种能够高效降解作物秸杆的复合微生物菌剂及其制备方法与应用。一种降解作物秸杆的复合微生物菌剂，其特征在干，是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CICC10088、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) ACCC03002、黑曲霉(Aspergillus niger) CICC41130> 黄曲霉(Aspergillus f lavus) CICC40258> 里氏木霉(Trichoderma reesei ) CICC41491、长柄木霉(Trichoderma viride) ACCC30150、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic) ACCC30346 和黄抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium) CICC40719 经固体发酵制得。根据本发明优选的，上述复合微生物菌剂每克含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) CICC10088 活菌数 IO8 101° 个、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) ACCC03002活菌数IO8 101°个、黑曲霉(Aspergillus niger) CICC41130孢子数IO7 IO9个、黄曲霉(Aspergillus niger) CICC40258 抱子数 IO7 IO9 个、里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子数IO7 IO9个、长柄木霉(Trichoderma viride) ACCC30150孢子数IO7 IO9个、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic) ACCC30346抱子数IO7 IO9个、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) CICC40719 抱子数 IO7 IO9 个。所述枯草芽抱杆菌(Bacillussubtili s) CICC10088、黑曲霉(Aspergillusniger) CICC41130、黄曲霉(Aspergillus flavus) CICC40258、里氏木霉(Trichodermareesei) CICC41491、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) CICC40719 均购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心；所述腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus) ACCC03002、长柄木霉(Trichodermaviride) ACCC30150、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic) ACCC30346 均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。上述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤(I)将枯草芽孢杆菌CICC10088接种于LB液体培养基，在30 37°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量接种于固体培养基A中，在30 37°C培养3 5天，制得含有枯草芽孢杆菌CICC10088活菌数8 15 X IO9个/g的固体菌剂A ；(2)将蜡状芽孢杆菌ACCC03002接种于LB液体培养基，在30 37°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量将蜡状芽孢杆菌接种于固体培养基B中，在30 37°C培养3飞天，制得含有蜡状芽孢杆菌ACCC03002活菌数8 15 X IO9个/g的固体菌剂B ；(3)将黑曲霉CICC41130接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将黑曲霉接种于固体培养基C中，在25 30°C培养5 7天，制得含有黑曲霉CICC41130孢子数I 3X IO9个/g的固体菌剂C ；(4)将黄曲霉CICC40258接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将黄曲霉接种于固体培养基D中，在25 30°C培养5 7天，制得含有黄曲霉CICC40258孢子数I 3X IO9个/g的固体菌剂D ;(5)将里氏木霉CICC41491接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将里氏木霉接种于固体培养基E中，在25 30°C培养5 7天，制得含有里氏木霉CICC41491孢子数I 3 X IO9个/g的固体菌剂E ;(6)将长柄木霉ACCC30150接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将长柄木霉接种于固体培养基F中，在25 30°C培养5 7天，制得含有长柄木霉ACCC30150孢子数I 3 X IO9个/g的固体菌剂F ;(7)将嗜热侧孢霉ACCC30346接种于PDA固体培养基，在40 45°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将嗜热侧孢霉接种于固体培养基G中，在40 45°C培养5 7天，制得含有嗜热侧孢霉ACCC30346孢子数O. 5 I. 5 X IO9个/g的固体菌剂G ;(8)将黄孢原毛平革菌CICC40719接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养2 3天，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基H中，在25 30°C培养5 7天，制得含有黄孢原毛平革菌CICC40719孢子数O. 5 I. 5 X IO9个/g的固体菌剂H ；(9)取I 3重量份步骤(I)制得的固体菌剂A、1 3重量份步骤(2)制得的固体菌剂B、1 3重量份步骤(3)制得的固体菌剂C、1 3重量份步骤(4)制得的固体菌剂D、1 3重量份步骤(5)制得的固体菌剂E、1 3重量份步骤(6)制得的固体菌剂F、1 3重量份步骤(7)制得的固体菌剂G和I 3重量份步骤(8)制得的固体菌剂H进行混合，制得复合微生物菌剂。根据本发明优选的，所述固体培养基A和固体培养基B的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份 麸皮粉600 800份，稻壳100 300份，玉米面60 100份，豆柏粉10 30份，(NH4)2S044 6 份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，KH2PO4 O. 4 O. 6 份，石灰粉 16 20 份，水1000 1200 份，pH 7. O 8. O。根据本发明优选的，所述固体培养基C、固体培养基D和固体培养基H的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份秸杆粉500 700 份，麸皮粉 300 500 份，(NH4)2SO4IO 30 份，KH2PO4 O. 5 I. 5 份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，水 1500 2500 份，pH 6. 0 6· 5。根据本发明优选的，所述固体培养基E和固体培养基F的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉200 400份，玉米面600 800份，过磷酸钙3 5份，水400 700份，pH 6. 0 6· 5。根据本发明优选的，所述固体培养基G采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉300 400 份，甘蔗渣 500 600 份，(NH4) 2S04 10 30 份，KH2PO4 I 3份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，水 1000 2000 份，pH 6. 0 6· 5。上述LB液体培养基和PDA固体培养基均为本领域常用培养基，LB液体培养基组分如下酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH和HCl调节ρΗ7· (Γ7. 2，分装灭菌;PDA固体培养基组分如下 马铃薯汁IOOOml，葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装灭菌；上述复合微生物菌剂在降解作物秸杆中的应用。上述应用，步骤如下(I)将作物秸杆经粉碎机粉碎后，按照每吨秸杆添加15 35千克的量添加尿素，カロ水使秸杆含水量达到60 70wt%，得到处理秸杆；(2)按照秸杆重量的2 3wt%量称取复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的处理秸杆中，混合均匀，堆制成堆，发酵2(Γ35天。根据本发明优选的，所述作物秸杆为玉米、小麦、水稻、高梁和/或豆类的秸杆。上述操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。有益效果I.能够腐熟玉米、小麦、水稻、高梁、豆类等多种植物秸杆，从而解决了秸杆运输和存放困难，避免了因焚烧秸杆造成的大气 污染，具有良好的环境效益。2.能够缩短秸杆腐熟时间，提高秸杆腐熟效率。发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有固氮、解磷、解磷的作用，以及很好的抗病虫害效果，有利于改良土壤结构，提高作物产量和品质。3.复合微生物菌剂为固体形态，単位原料中含菌量高，微生物在干燥情况下以芽孢和孢子的形式存在，可长期保存，利于分装、运输及贮存。4.制备エ艺简单，生产过程不需要大型设备，生产成本低，对环境污染低。具体实施方法下面结合实施例对本发明做进ー步阐述，但本发明所保护范围不限于此。微生物材料实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CICC10088、黑曲霉(Aspergillus niger) CICC41130> 黄曲霉(Aspergillus flavus) CICC40258> 里氏木霉(Trichoderma reesei ) CICC41491、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC40719均购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心；所述腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus) ACCC03002、长柄木霉(Trichodermaviride) ACCC30150、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic) ACCC30346 均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。实施例中所述培养基原料均为本领域常用原料，均可市场购得。实施例I降解作物秸杆的复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤(I)将枯草芽孢杆菌CICC10088接种于LB液体培养基，在37°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量将枯草芽孢杆菌接种于固体培养基A中，在37°C培养3天，制得含有枯草芽孢杆菌CICC10088活菌数101°个/g的固体菌剂A ；(2)将蜡状芽孢杆菌ACCC03002接种于LB液体培养基，在30°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量将蜡状芽孢杆菌接种于固体培养基B中，在30°C培养3天，制得含有蜡状芽孢杆菌ACCC03002活菌数8 X IO9个/g的固体菌剂B ；(3)将黑曲霉CICC41130接种于PDA固体培养基，在28°C条件下培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将黑曲霉接种于固体培养基C中，在28°C培养5天，制得含有黑曲霉CICC41130孢子数2 X IO9个/g的固体菌剂C ；(4)将黄曲霉CICC40258接种于PDA固体培养基，在28°C条件下培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将黄曲霉接种于固体培养基D中，在28°C培养5天，制得含有黄曲霉CICC40258孢子数2 X IO9个/g的固体菌剂D ；(5)将里氏木霉CICC41491接种于I3DA固体培养基，在28°C条件下培养72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按15wt%的接种量将里氏木霉接种于固体培养基E中，在28°C培养7天，制得含有里氏木霉CICC41491孢子数I. 5X IO9个/g的固体菌剂E ；(6)将长柄木霉ACCC30150接种于PDA固体培养基，在28°C条件下培养72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按15wt%的接种量将长柄木霉接种于固体培养基F中，在28°C培养7天，制得含有长柄木霉ACCC30150孢子数I. 5X IO9个/g的固体菌剂F ；(7)将嗜热侧孢霉ACCC30346接种于PDA固体培养基，在45°C条件下培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将嗜热侧孢霉接种于固体培养基G中，在45°C培养7天，制得含有嗜热侧孢霉ACCC30346孢子数 IO9个/g的固体菌剂G ；(8)将黄孢原毛平革菌CICC40719接种于PDA固体培养基，在30°C条件下培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基H中，在30°C培养7天，制得含有黄孢原毛平革菌CICC40719孢子数IO9个/g的固体菌剂H;(9 )取相等重量步骤(I)制得的固体菌剂A、步骤(2 )制得的固体菌剂B、步骤(3 )制得的固体菌剂C、步骤(4)制得的固体菌剂D、步骤(5)制得的固体菌剂E、步骤(6)制得的固体菌剂F、步骤(7)制得的固体菌剂G和步骤(8)制得的固体菌剂H进行混合，制得复合微生物菌剂。所述固体培养基A和固体培养基B的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得麸皮粉80kg,稻壳 IOkg,玉米面 8kg,豆柏粉 2kg, (NH4)2SO4 O. 5kg, MgSO4 · 7H2OO. 05kg, KH2PO4 O. 05kg，石灰粉 I. 8kg，水 100L, pH 7. 4。所述固体培养基C、固体培养基D和固体培养基H的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得秸杆粉60kg，麸皮粉 40kg, (NH4)2SO4 2kg，KH2PO4 O. 1kg，MgSO4 · 7H20 0. 05kg，水200L, pH 6. O0所述固体培养基E和固体培养基F的组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉30kg,玉米面70kg,过磷酸I丐O. 4kg,水50L, pH 6. O。所述固体培养基G采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉35kg，甘蔗渣 65kg，(NH4)2SO4 2kg，KH2PO4 O. 2kg，MgSO4 · 7H20 0. 05kg，水150L, pH 6. 0。经检测，制得的降解作物秸杆的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)活菌数I. 25X IO9个、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数IO9个、黑曲霉(Aspergillus niger)孢子数2. 5X IO8个、黄曲霉(Aspergillusniger)抱子数2. 5X IO8个、里氏木霉(Trichoderma reesei)抱子数I. 87X IO8个、长柄木霉(Trichoderma viride)抱子数 I. 87X IO8个、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic)抱子数 I. 25 X IO8 个、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)抱子数 I. 25 X IO8个。实施例2采用如实施例I所述的方法，不同之处在于，步骤(9)固体菌剂A、固体菌剂B、固体菌剂C、固体菌剂D、固体菌剂E、固体菌剂F、固体菌剂G和固体菌剂H的混合重量比为3 : I : 3 : I : 3 : I : 3 : I0制得的降解作物秸杆的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)活菌数 I. 87X IO9 个、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数 5X108 个、黑曲霉(Aspergillus niger)抱子数 3. 75X IO8 个、黄曲霉(Aspergillusniger)抱子数I. 25X IO8个、里氏木霉(Trichoderma reesei)抱子数2. 81 X IO8个、长柄木霉(Trichoderma viride)抱子数9. 37X IO7个、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic)抱子数 I. 87 X IO8 个、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)抱子数 6. 25 X IO7个。实施例3采用如实施例I所述的方法，不同之处在于步骤(9)固体菌剂A、固体菌剂B、固体菌剂C、固体菌剂D、固体菌剂E、固体菌剂F、固体菌剂G和固体菌剂H的混合重量比为2 : I : I : I : 2 : I : I : I0 制得的降解作物秸杆的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数2X IO9个、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数8X IO8 个、黑曲霉(Aspergillus niger)抱子数 2X IO8 个、黄曲霉(Aspergillus niger)抱子数2X IO8个、里氏木霉(Trichoderma reesei)抱子数3X IO8个、长柄木霉(Trichodermaviride)抱子数 L 5X IO8 个、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic)抱子数 IO8 个、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)抱子数 IO8 个。实施例4上述复合微生物菌剂在降解作物秸杆中的应用，步骤如下(I)将500kg玉米秸杆经粉碎机粉碎后，与IOkg尿素混合均匀，加水使秸杆含水量达65wt%,得到处理稻杆；(2)称取15kg复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的处理秸杆中，混合均匀，按堆宽2米，堆高I. 6米，堆制成堆进行发酵，发酵20天左右制得。按上述方法分别对实施例I、实施例2和实施例3制得的复合微生物菌剂进行试验，分别为处理I、处理2、处理3。秸杆在降解过程中，温度和顔色的变化显示了微生物对秸杆的作用效果，在发酵过程中，每隔一段时间记录秸杆的温度和顔色，其中顔色分为五个等级，分别为浅黄、深黄、黄褐、褐色、黑褐，当秸杆颜色变为黑褐色时说明秸杆腐熟完全。结果如表I所示。エ艺降解效果的优劣是通过测定处理后秸杆中纤维素、半纤维素、木质素(简称三素)含量变化的评价。本发明将玉米秸杆经发酵处理后，经60°C烘干至恒重，測定“三素”含量，以未处理的玉米秸杆的“三素”含量为对照。按照王金主在《玉米秸杆中纤维素、半纤维素和木质素的測定》(《山东食品发酵》，2010年03期)中检测方法对玉米秸杆进行降解程度的检测，降解程度如表3所示。实施例5上述复合微生物菌剂在降解作物秸杆中的应用，步骤如下(I)将500kg小麦秸杆经粉碎机粉碎后，与15kg尿素混合均匀，加水使秸杆含水量达65wt%,得到处理稻杆；(2)称取15kg复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的处理秸杆中，混合均匀，按堆宽2米，堆高I. 6米，堆制成堆进行发酵，发酵20天左右制得。按上述方法分别对实施例I、实施例2和实施例3制得的复合微生物菌剂进行试验，分别为处理4、处理5、处理6。检测方法与实施例4相同，温度和顔色的变化结果如表2所示，降解程度如表4所/Jn ο对照例I (I)将500kg玉米秸杆经粉碎机粉碎后，与IOkg尿素混合均匀，加水使秸杆含水量达65wt%，得到处理秸杆，按堆宽2米，堆高I. 6米，堆制成堆进行发酵。结果如表I、表3所/Jn ο对照例2參照中国专利文献CN101775359A中实施例I所记载的技术方案配制对比菌剂，按照本申请实施例4的方法施用上述对比菌剂。其中菌种采用腐熟剂常用菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CICC10088购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDMCC10292购自山东农业大学菌种保藏中心。腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ACCC10606购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CICC20611购自中国エ业微生物菌种保藏中心。胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC1. 232购自中国普通微生物菌种保藏中心。环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)CICC20133购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心。球状芽孢杆菌(BaciIIus sphaericus)CICC20687购自中国エ业微生物菌种保藏中心。产芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)CGMCC1.2157购自中国普通微生物菌种保藏中心。丙酮丁酸梭菌(Clostridiumacetobutylicum) CGMCCI. 70购自中国普通微生物菌种保藏中心。巴氏梭菌(Clostridiumpasterrianum)ACCC00100购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。拜氏梭菌(Clostridiumbei jerincki)ACCC00174购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)ACCC00168购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。绿色木霉(Trichodermaviride) ACCC30793购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。瑞氏木霉(Trichodermareesei )ATCC13631美国典型微生物菌种保藏中心、黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC30786购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。检测方法与实施例4相同，结果如表I、表3所不。对照例3(I)将500kg小麦秸杆经粉碎机粉碎后，与15kg尿素混合均匀，加水使秸杆含水量达65wt%，得到处理秸杆，按堆宽2米，堆高I. 6米，堆制成堆进行发酵。检测方法与实施例4相同，降解程度如表2、表4所示。对照例4參照中国专利文献CN101775359A中实施例I所记载的技术方案配制对比菌剂，按照本申请实施例5的方法施用上述对比菌剂。其中菌种如对照例2所示。检测方法与实施例4相同，结果如表2、表4所示。检测结果表I不同处理对玉米秸杆温度和顔色的影响

本发明涉及一种高效降解作物秸秆的复合微生物菌剂及其制备方法与应用，复合微生物菌剂由枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、黑曲霉、黄曲霉、里氏木霉、长柄木霉、嗜热侧孢霉和黄孢原毛平革菌经固体发酵制得。该复合微生物菌剂能够缩短秸秆腐熟时间，提高秸秆腐熟效率。发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有固氮、解磷、解磷的作用，以及很好的抗病虫害效果，有利于改良土壤结构，提高作物产量和品质。