专利名称：心肌病的基因治疗的制作方法 尽管近来在医学领域取得了令人振奋的技术进步，仍有很多问题有待解决。心肌病的问题便是其中最重要的待解决问题之一。心肌病是一类因心肌的器质性或功能性异常所致疾病的总称。例如，通常将心肌病分为继发性心肌病，其依次发生高血压、代谢障碍、局部缺血性疾病等；自发性心肌病(ICM)，其在无任何其它重要疾病的情况下发生。肥大性心肌病(HCM)归类于ICM，现主要在基因水平揭示了其致病机理。现认为半数HCM患者具有家族史，其为常染色体显性遗传。以多个患者为目标对这类家族进行关联分析，迄今发现5个致病位点，而致病基因本身在其中4个位点上为特化形式。多例扩张型心肌病(DCM)的发生相互无关联，但有20％的病例被认为有家族史。以多个患者为目标对这类家族的关联分析揭示了7类致病位点(致病基因目前未知)。关于心肌病，在明确致病基因和揭示发病机制方面的研究取得进展，但迄今未实施基因治疗方面的具体行动。另一方面，近来分子生物学的快速进展使得有可能通过基因转移方法活化细胞功能，已做了各种努力。具体是，已有关于针对心脏的基因转移方法的报道，象静脉点滴(临床研究杂志，90，626-630(1992))，直接注射(循环，82，2217-2221(1990)；循环，90，2414-2424(1994))，或应用质粒本身进行的冠状动脉扩散性输注法(J.Thorac.Carduivasc.Surg.，109，716-720(1995))等，但远未达到具体的非侵袭性治疗这一步。发明公开本发明的目的是提供非侵袭性治疗心肌病(其目前尚无有效治疗方法)的方法及相应治疗剂。即，本发明涉及通过非侵袭性给予HGF基因而治疗心肌病的基因治疗方法及所用治疗剂。更具体地，本发明涉及通过非侵袭性给予HGF基因至心肌而治疗心肌病的基因治疗方法，尤其涉及更有效治疗心脏病如心肌病、心绞痛、及心力衰竭的基因治疗方法，其方式是通过回波的使用向心肌患处注射HGF基因，本发明还涉及其中所用的治疗剂。此外，本发明涉及可应用除HGF基因以外的其它基因，并包括通过回波的使用向组织患处非侵袭性给予基因的基因治疗方法。本发明人通过将HGF基因以非侵袭性方式直接输注至心肌层患处获得了有效结果。即，本发明人发现，无需切开心肌患处或施行胸廓切开术，仅通过回波观察即可将HGF基因有效输注至患处。由于这是一种非侵袭性治疗方法，故有可能根据实际情况重复给予所述基因，并因此有可能对心肌病进行有效治疗。本发明人最新发现可通过回波观察向患处输注基因来实施有效治疗，本发明的方法已显示能对各种器官特异性疾病进行基因治疗。
例如，根据本发明使用HGF基因，可治疗各种器官特异性疾病如肺纤维化，肝硬变，肝纤维化等。此外，除HGF基因以外的其它基因也可有效用于本发明的上述方法中。
因此，本发明主要涉及(1)一种用于非侵袭性给药治疗心肌病的治疗剂，其包含一种肝细胞生长因子(HGF)基因作为有效成分；(2)(1)的治疗剂，其用于将HGF基因给药至心肌；
(3)(1)或(2)的治疗剂，其中HGF基因为仙台病毒(HVJ)-脂质体形式；(4)(2)或(3)的治疗剂，其通过回波的应用非侵袭性给药于心肌患处；(5)(1)至(4)中任一项的治疗剂，其被给予至少8次，一周一次；(6)(1)至(5)中任一项的治疗剂，其中至少使用10μg HGF基因；(7)(1)至(6)中任一项的治疗剂，其中所述心肌病选自心肌病、心绞痛、及心力衰竭；(8)一种用于通过回波的应用而将基因非侵袭性给药至组织患处的基因治疗剂，其包含可有效治疗疾病的基因作为有效成分；(9)(8)的基因治疗剂，其中所述组织患处为心肌；(10)(8)或(9)的基因治疗剂，其中所述基因是HGF基因；(11)一种基因治疗心肌病的方法，其包括将HGF基因非侵袭性给药至哺乳动物的心肌，包括人的心肌；(12)(11)的基因治疗方法，其中所述HGF基因为仙台病毒(HVJ)-脂质体形式；(13)(11)或(12)的基因治疗方法，其中所述HGF基因是通过应用回波而非侵袭性给药于心肌患处的某一部位；(14)(11)至(13)中任一项的基因治疗方法，其中所述HGF基因至少给予8次，一周一次；(15)(11)至(14)中任一项的基因治疗方法，其中所述心肌病选自心肌病、心绞痛、及心力衰竭；(16)一种基因治疗方法，其包括在使用回波的前提下将能有效治疗疾病的基因非侵袭性给药于组织患处；(17)(16)的基因治疗方法，其中所述组织患处为心肌；(18)(16)或(17)的基因治疗方法，其中所述基因是HGF基因；(19)HGF基因在非侵袭性给药治疗心肌病之治疗剂的生产中的应用；(20)(19)的应用，其中所述HGF基因是仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式；(21)(19)或(20)的应用，其中所述治疗剂是可通过回波的应用将HGF基因非侵袭性给药于心肌患处的治疗剂；(22)(19)至(21)中任一项的应用，其中所述心肌病选自心肌病、心绞痛、及心力衰竭；
(23)基因在生产基因治疗剂中的应用，所述基因治疗剂用于通过回波的应用将能有效治疗疾病的基因非侵袭性给药于组织患处；(24)(23)的应用，其中所述组织患处为心肌；和(25)(23)或(24)的应用，其中所述基因是HGF基因。
附图简述

图1图示通过回波的应用实施基因转移是可能的。以萤光素酶作为报道基因，利用HVJ将其导入心肌病豚鼠的心脏，由该豚鼠中萤光素酶的高活性比可证实所述可能性。
图2是用ALP(碱性磷酸酶)染色测定的心脏毛细血管密度，显示HGF基因与对照基因的比较结果。
图3是用激光多普勒影像仪(LDI)评估的心脏血流量，显示HGF基因组，对照组，以及未处理组的比较结果。
图4是用Masson染色测定的心脏纤维化分布密度的比较结果。
实施本发明的最佳模式本文中“HGF基因”指可表达HGF(HGF蛋白)的基因。这类基因包括在所述基因序列中一部分已缺失、被另一碱基取代、有其它碱基序列插入、或在5’端和/或3’端有碱基结合，使表达的多肽具有与HGF基本相同作用的基因。例如，自然342440(1989)；日本专利申请2777678；生物化学和生物物理学通讯163967(1989)；生物化学和生物物理学通讯172321(1990)所述的HGF基因。这些基因可在本发明中使用。
本发明HGF基因的碱基序列(编码HGF的cDNA)已在上述文献中描述，并在数据库如Genbank中登记。因此，根据这类序列信息，可利用适当DNA片段作为PCR引物；通过如对肝脏或白细胞的mRNA实施RT-PCR，可克隆HGF的cDNA。这类克隆可由本领域技术人员根据基础教材如分子克隆，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)很轻易地实施。对HGF基因的修饰等也可由本领域技术人员根据上述基础教材轻易实施。
随后阐述本发明基因治疗中应用的基因转移方法、剂型、剂量等。
含有上述基因作为有效成分以便给药于患者的基因治疗剂的剂型可大致分为两组一组使用非病毒载体，另一组使用病毒载体。它们的制备和给药方法详述于实验室手册(实验医学增刊，基因治疗的基本技术，Yodosha(1996)；实验医学增刊，基因转移和表达分析中的实验方法，Yodosha(1997)；基因治疗的开发及研究手册，日本基因治疗协会编，NTS(1999))。具体描述如下。
A.非病毒载体的使用将目的基因整合至一种常用的基因表达载体中，产生的重组表达载体可用于将该目的基因用以下方法导入细胞或组织。
将基因转移至细胞中的方法包括脂转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、用显微玻璃管将DNA直接导入法等。
就基因转移至组织中的方法而言，将所述重组表达载体掺入细胞可通过，如使用内在型脂质体的基因转移方法，使用静电型脂质体的基因导入方法，HVJ-脂质体法，改良的HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)，受体-介导的基因导入法，将DNA分子与载体(金属粒子)一起通过粒子枪导入的方法，直接导入裸露DNA的方法，使用带正电的多聚体的导入方法，等。
它们中，HVJ-脂质体是一种融合产物，其通过在脂质双层所构成的脂质体中容纳DNA而产生，其中所述脂质体已融合至灭活的仙台病毒(日本血凝病毒HVJ)。HVJ-脂质体法的特征是与常规脂质体法比较，它与细胞膜的融合具有非常高的融合活性，它是优选的导入方法。制备HVJ-脂质体的方法可详见文献(实验医学单册，基因治疗的基本技术，Yodosha(1996)；基因导入和表达分析中的实验方法，Yodosha(1997)；临床研究杂志，931458-1464(1994)；美国生理学杂志，271R1212-1220(1996))等，以及下文详述的实验实施例。
具体优选Z株(可得自ATCC)作为HVJ病毒株，但也可使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。
此外，直接导入裸露DNA的方法是上述方法中最简单的一种，因此也是优选的导入方法。
本文所用表达载体可以是任何表达载体，只要它们可体内表达目的基因。实例如pCAGGS(基因108193-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)等。
B.病毒载体的使用使用病毒载体的代表性方法包括使用诸如重组腺病毒、逆转录病毒等作为病毒载体的方法。更具体地，可将目的基因导入DNA病毒，如脱毒的逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，痘苗病毒，痘病毒，脊髓灰质炎病毒，新培斯病毒，仙台病毒，SV40，人类免疫缺陷病毒(HIV)等，然后使病毒感染细胞以便将所述基因导入细胞。
上述病毒载体中，已知腺病毒的感染效力比其它病毒载体的高很多。故优选使用腺病毒载体系统。
将基因治疗剂导入患者的方法有，能将基因治疗剂直接导入机体的体内法，和从人体取出细胞，将基因治疗剂导入其中，然后再导回体内的离体法(Nikkei Science，1994年4月期20-24页；Monthly Yakuji，36(1)23-48(1994)；实验医学增刊12(15)(1994)；基因治疗的开发及研究手册，NTS(1999))。本发明优选体内法。
可根据上述给药方案采用各种剂型(如液体)。当使用含有所述基因作为有效成分的注射剂时，可通过将所述有效成分溶于一种标准溶剂(缓冲液如PBS，生理盐水，无菌水等)来制备。然后可按要求将所述注射液用滤膜过滤除菌，再装入已灭菌的容器中。可在该注射液中加入常规载体等。脂质体，如HVJ-脂质体可采取悬浮剂，冷冻制剂，离心浓缩的冷冻制剂等形式。
除了本发明中导入的HGF基因，还可针对心肌使用内源性心肌保护因子或再生因子。例如，据报道TGF-β和热休克蛋白(HSP)在心肌损伤期间高度表达，缓解心肌病并参与心肌修复。因此，可使用它们的编码基因。此外，据报道，生长因子如EGF可修复各种组织中的细胞损伤，因此它们的编码基因也可以使用。除了这些心肌保护因子和再生因子，还可使用与心肌保护和再生相关的因子。
根据本发明，可将目的蛋白运送至受损的细胞，如心肌细胞，其通过将HGF基因单独或与其它基因一起导入心脏的心肌细胞并使它们高效表达而实现。这样能活化受损心肌的修复和再生，并恢复心肌病中涉及的心脏功能。因此，本发明的基因治疗剂可用于患有危重心肌病的患者，并为除了心脏移植以外无法有效治疗的患者提供治疗方案。
此外，本发明的治疗剂不仅可用于严重心肌病患者，还可用于患有进行性轻度心肌病的患者。它也可用于心肌病样心绞痛和心力衰竭的患者。
对本发明的基因治疗中，针对待处理的疾病或症状足量用药的正确方法和用药部位进行了筛选。优选心肌(心肌患处)为用药部位。优选的给药方法为非胃肠道给药。
非胃肠道给药的方法有，用非侵袭性导管给药，用非侵袭性注射器给药等。更优选通过回波的使用来实施非侵袭性导管给药，非侵袭性注射器给药等。利用非侵袭性导管的方法如直接注射HGF基因。
本发明治疗剂的用量根据患者的症状变化，可将每成人患者的剂量定为HGF基因0.0001mg-100mg，优选约0.001-10mg。
当选用HVJ-形式时，每成人患者可选用HGF基因约1-约4000μg，优选约10-约400μg。
本发明的治疗剂适于每数日或每数周给药一次，优选每周一次。
给药频率根据患者症状决定。为了达到治疗的目的，最好多次给药，优选给药8次。
本发明还提供了一种新的基因治疗方法及其使用的治疗剂，包括通过回波的使用而将对疾病有治疗效应的基因非侵袭性给予组织患处。即本发明首次揭示，通过回波的使用直接将基因给药于患处确实可达到有效治疗的目的。根据本发明的治疗，基因是以非侵袭性方式给予，因此可根据病情需要尽可能多地给予所需基因，这是较以前的方法的优势所在。除了HGF基因以外，本发明的基因治疗方法适用于任何基因。该基因治疗方法应用于心肌患处时尤其有效。在这类情况下给予的基因包括HGF基因，TGF-β基因，HSP基因，VEGF基因，FGF基因，EGF基因等。
现用以下实施例具体说明本发明。但应注意，本发明无论如何不限于这些实施例。
材料和方法实验动物仓鼠心肌病模型(心肌病仓鼠；Bio14.6)购自Oriental Yeast。
HGF基因人的HGF基因按常规方法克隆自人的HGF cDNA(日本专利2777678)并已插入表达载体pcDNA(Invitrogen).
实验方法
1.通过回波的使用将萤光素酶报道基因借HVJ脂质体导入心肌病仓鼠。一周后，测定萤光素酶的活性。通过回波的使用仅导入了PBS的动物为对照。萤光素酶活性用发光计(LamatLB9507(BERTHOLO))测定。
2.通过心回波图(MD500，YOKOKAWA-GE)的使用，将HVJ-脂质体试剂注射至心肌病仓鼠(12周龄)侧腹部的心脏心肌处，然后进行以下检测1)通过ALP(碱性磷酸酶)染色测定心肌中毛细血管的密度，将HGF基因的结果与对照的比较。
2)用激光多普勒影像仪(LDI)评分来评估已接受HVJ-脂质体的心脏的血流，将HGF基因的结果与对照的比较。
3)对心肌进行Masson染色，经计算机分析测定纤维化的分布密度。将HGF基因的结果与对照的比较。
参考例1HVJ-脂质体试剂的制备将10mg干脂质(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、与胆固醇1∶4.8∶2的混合物)与含HGF基因(100μg)-HMG1(高迁移率1组核蛋白，25μg)的200μl平衡盐溶液(137μM NaCl，5.4μM KCl，10μM Tris-HCl；pH7.6)经强烈搅拌及超声处理而混合，形成脂质体。纯化的仙台病毒(Z株)用UV(110尔格/mm2/秒)照射3分钟。将脂质体悬浮液与仙台病毒(HVJ)混合，4℃加热10分钟，然后37℃加热30分钟。弃去游离的HVJ，从而得到HVJ脂质体试剂。
参考例2萤光素酶活性的测定将含有10μg萤光素酶基因的脂质体试剂给药于仓鼠(每组6只动物)。一周后测定萤光素酶活性。结果示于图1。
如图1所示，高水平的萤光素酶活性出现于心脏中。从而表明通过回波的使用进行基因转移是可能的。
实验1用HGF基因治疗心肌病仓鼠将萤光素酶试剂注射至心肌病仓鼠(12周龄，每组6只动物)侧腹部的心脏心肌处。以同样的方式将含有对照载体的脂质体试剂注射至一组心肌病仓鼠(12周龄，每组6只动物)作为对照，未处理的心肌病仓鼠(每组6只动物)作为未处理组使用。然后每周注射脂质体试剂一次，共8次。8周后，经ALP染色测定20周龄心肌病仓鼠的心脏心肌中毛细血管的密度，经LDI评分评估血流。对这些仓鼠行安死术，摘取心脏，经Masson染色后，用计算机分析来测定纤维化的分布密度。
ALP的染色结果说明，HGF基因治疗组由于血管生成使毛细血管显著增多。结果见图2。
至于LDI评分，以对照组为100％，HGF基因处理组则为163±7％，这表明血流的显著增多。结果见图3。
根据对Masson染色的分析，HGF基因处理组的纤维化分布密度显著下降。结果见图4。
工业实用性本发明含有HGF基因的心肌病治疗剂可诱导心肌患处的血管生成，增加该患处的血流并同时抑制和减少心肌的纤维化，其可恢复心脏功能。此外，本发明的治疗剂可通过回波的使用而非侵袭性地、精确地注射至心肌层的患处。因此本发明的治疗剂能更有效地治疗心肌病。


经回波描记术以仙台病毒(HVJ)－脂质体的形式非侵袭性给予HGF基因至受损心肌,使得有可能促进心肌层的血管生成并抑制心肌层的纤维化,从而恢复心脏功能。