专利名称：佐剂组合制剂的制作方法免疫系统对攻击性病原体采用了各种机制。然而，这些机制并不一定在免疫后都被激活。免疫接种诱导的保护性免疫力取决于疫苗引发合适免疫反应来抵御或根除病原体的能力。根据病原体的不同，可能需要细胞介导的和/或体液免疫应答反应。辅助T细胞在免疫反应中的作用的当前范例是T细胞能根据它们产生的细胞因子分成亚组，这些细胞中所见的不同的细胞因子分泌模式决定了这些细胞的功能。该T细胞模式主要包括两小类产生使细胞和体液(抗体)免疫反应增强的γ干扰素和白介素(IL-2)的TH-1细胞；和产生使体液免疫反应增强的白介素-4、白介素-5和白介素-10(分别为IL-4、IL-5和IL-10)的TH-2细胞(参考书目1)。为了在免疫接种的生物中获得较强的免疫应答和增强宿主对携带抗原的因子的抵抗力，通常希望增强抗原的免疫原性。在某些情况下，希望将免疫应答从以体液(TH-2)应答反应为主变为更为平衡的细胞(TH-1)和体液(TH-2)应答反应。细胞应答反应涉及CD8+CTL(细胞毒性T-淋巴细胞)应答反应的产生。这种应答是开发针对胞内病原体的疫苗所需要的。对各种病原体的保护作用需要有强的粘膜应答反应、高的血清滴度、诱导产生CTL以及有强烈的细胞应答。大多数抗原制备物(制剂)，包括常规的亚单位疫苗都不能提供这些应答。在这些病原体中包括人免疫缺陷病毒。因此，需要开发出一种能在脊椎动物宿主中产生体液免疫应答反应和细胞免疫应答反应的抗原性组合物制剂。发明概述因此，本发明的目的是在抗原性组合物中利用了佐剂组合制剂，该制剂含有3-O-脱酰单磷脂A(MPLTM)或单磷脂A和其衍生物和类似物与细胞因子或淋巴因子(具体是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白细胞介素-12(IL-12))、或与所述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂联用。佐剂是一种当与免疫原或抗原一起给予时能增强免疫应答反应的物质。将本发明的佐剂制剂与所选抗原以抗原性组合物形式一起给予。本发明的抗原性组合物增强了脊椎动物宿主对于该所选抗原的免疫应答反应。所选抗原可以是衍生自下列物质的多肽、肽或片段(1)病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫，或(2)癌细胞或肿瘤细胞，或(3)变应原，以干扰IgE的产生，从而缓和对于变应原的变态性应答反应；或(4)淀粉样肽蛋白，从而预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病。在本发明的一个实施方案中，所选抗原来自HIV。所选HIV抗原可以是HIV蛋白、或衍生自所述蛋白质的多肽、肽或片段。在本发明的其它实施方案中，HIV抗原是一种特异性肽。在本发明的其它实施方案中，所选抗原来自淋病奈瑟氏球菌或呼吸道合胞病毒。MPLTM可以水溶液形式或稳定的水包油乳液(稳定的乳液或SE)形式存在。在本发明的一个较佳实施方案中，该水包油乳液含有鲨烯、甘油和磷脂酰胆碱。在该SE制剂中，在给药前，将MPLTM与细胞因子或淋巴因子混合形成抗原性组合物。细胞因子或淋巴因子无需进入乳液。在本发明的一个较佳实施方案中，MPLTM是SE形式。抗原性组合物还可进一步包含稀释剂或载体。本发明还涉及提高含所选抗原的抗原性组合物的能力的方法，所述抗原来自(1)病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫，以引发脊椎动物宿主免疫应答反应，或(2)癌细胞或肿瘤细胞的癌抗原或肿瘤相关抗原，以引发脊椎动物宿主的治疗性或预防性抗癌作用，或(3)变应原，以干扰IgE的产生，从而缓和对于变应原的变态性应答反应，或(4)淀粉样肽蛋白，从而预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病，上述方法是加入有效量佐剂与细胞因子或淋巴因子(尤其是MPLTM与GM-CSF或IL-12)或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂联合。
本发明还涉及提高含所选抗原的抗原性组合物的能力的方法，所述抗原来自病原性病毒、细菌、真菌或寄生虫，以引发脊椎动物宿主中的细胞毒性T淋巴细胞，所述方法是加入有效量佐剂与细胞因子或淋巴因子(尤其是MPLTM与GM-CSF或IL-12)或所述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂联合。
附图简述

图1显示了从5只Balb/c雌小鼠的组测得的终点滴度的倒数(reciprocal)，这些小鼠用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，该肽是多表位的39个氨基酸的肽，用CFA或IFA(三角)配制，或用50微克MPLTM2％稳定乳液(SE)配制(正方形)。小鼠于第0天免疫，于第28天加强免疫。在第42天，用ELISA测定所收集血清中的肽特异性IgG，IgG1和IgG2a滴度。
图2显示了单用SE、单用MPLTM或MPLTM和SE联用对于GM-CSF针对抗-T1SP10MN(A)(-Cys)IgG滴度的佐剂性能的影响。在第0天对每组5只Balb/c雌小鼠用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，在第28天用所述佐剂制剂加强免疫。使CFA和IFA与水性肽以1∶1的比例乳化。GM-CSF以10微克/剂的量使用。作为水性制剂，MPLTM以50微克的最终浓度输送给小鼠，或作为含1％SE的稳定乳液的一部分，以25微克的最终浓度输送。第二次接种后二周测定滴度，数据表示从5只小鼠测得的各小鼠滴度。
图3显示了病毒中和试验的结果。在第42天，从第0天免疫接种和第28天以所示制剂加强的小鼠取得血清，合并，稀释(1/1600)，在加入体外的AA5细胞中之前，加入T细胞适应的HIVMN稀释液中。培养7天后，测定细胞培养物上清的病毒逆转录酶作为病毒复制的指标。
图4显示了经T1SP10MN(A)(-Cys)以及各种佐剂制剂免疫接种的小鼠的脾细胞增殖。用3.3微克/毫升的T1SP10MN(A)(-Cys)体外刺激脾细胞4天。结果显示成因T1SP10MN(A)(-Cys)体外刺激所致的标记的胸苷掺入量相对于未受刺激的掺入量的变化(Δcpm)。
图5显示了二次免疫后第7天分离自小鼠的脾细胞的CTL活性。从每组3只Balb/c小鼠收获脾细胞，小鼠在第0天和第21天用50微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，所述T1SP10MN(A)(-Cys)用含或不含10微克GM-CSF的MPLTM的1％SE配制。使细胞与HIVMNCTL表位肽一起培育7天。在最后5天，将IL-2加入培养物中。将效应脾细胞加入铬标记的P815细胞中，该细胞以所示比例用HIVMN、另一株命名为HIVIIIB脉冲处理或不加入肽。CTL活性百分数计算如下 “E∶T”指效应细胞与靶细胞之比。
发明详述佐剂，细胞因子和淋巴因子是调节免疫的化合物，它们能增强和操纵针对本身免疫原性很差的各种抗原的免疫应答反应的产生和分布类型(profile)。合适地选择佐剂、细胞因子和淋巴因子能诱导产生好的体液和细胞免疫应答反应，而该反应在没有佐剂、细胞因子或淋巴因子时不会产生。具体地说，佐剂、细胞因子和淋巴因子具有显著增强对疫苗中亚单位和肽抗原免疫应答反应的作用。它们的刺激活性也有利于产生针对蛋白质抗原的抗原特异性免疫应答反应。对于需要强粘膜应答、高血清滴度、诱导产生CTL和强细胞应答反应的各种抗原，佐剂和细胞因子/淋巴因子组合可提供大多数抗原制剂不能提供的刺激。
众多研究已经在动物模型中评价了不同的佐剂制剂，但是目前铝(alum)(氢氧化铝或磷酸铝)是被许可广泛用于人体的唯一佐剂。有一类佐剂，由各种油包水或水包油组合组成的稳定的乳液，已经因其增强免疫的能力而受到相当多的注意。这些制剂一般包括各种可代谢的或惰性油的各种组合，它们起着稳定和贮存抗原于注射部位的作用。一种这样的佐剂是不完全的Freund佐剂(IFA)，它包括矿物油、水和乳化剂。完全的Freund佐剂(CFA)是IFA加上热灭活的分支杆菌。使用这些类型的佐剂的一个特别注意的问题是与注射部位有关的刺激，它通常是单核细胞渗透引起肉芽肿病灶的结果。因此，正在研究作为潜在佐剂的其它化合物和制剂。
一种这样的化合物是3-O-脱酰单磷脂A(monophosphoryl lipid A)(MPLTM)，它可从Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton，MT)购得。MPLTM在纳入本文作为参考的美国专利4,912,904(2)中有所描述。
最近，Ribi ImmunoChem Research Inc.已经配制出一种可代谢的水包油型制剂，当其与MPLTM混合时，会形成称为MPLTMSE的稳定化的乳液。该稳定化的乳液是通过MPLTM与鲨烯油、甘油和磷脂酰胆碱微流化而产生的。目前的制剂是达到GMP质量的微流化乳液。在下述实验中描述了含有1或2％油的乳液。
当皮下或肌内给予Balb/c小鼠时，MPLTMSE不产生可辨认的与注射部位有关的组织病理学变化。另外，制备了含有相同组分、但没有MPLTM的稳定化的乳液用作比较。具体地说，用40个氨基酸的HIV肽T1SP10MN(A)(+Cys)或半胱氨酸缺失的39个氨基酸肽T1SP10MN(A)(-Cys)(40个氨基酸的肽(+Cys)的第17氨基酸处的半胱氨酸残基缺失)作皮下或肌内免疫接种，用佐剂MPLTMSE和GM-CSF的组合物配制，免疫后两周没有产生可辨认的细胞渗入或组织异常。
单磷脂A的用途也在本发明范围内，该单磷脂A是MPLTM的前体形式，其在美国专利4,912,094(2)中也有所描述。另外，MPLTM和单磷脂A的衍生物和类似物也在本发明范围内。
在疫苗制剂中掺入细胞因子和淋巴因子已经显示出有希望扩大和增强疫苗潜力(3)。已经证实，细胞因子白介素-12(IL-12)能通过将T辅助细胞亚组的扩张转移到Th1细胞因子分泌模式(即，在小鼠模型中向IgG2亚类移动)，而引发和增强细胞介导免疫力(4-6)。已显示重组鼠IL-12增强了小鼠的Th1优势免疫应答类型(3)。
IL-12由各种抗原呈递细胞(理论上是巨噬细胞和单核细胞)产生。它是诱导从原初T-细胞产生TH1细胞的关键因素。IL-12的产生或对其应答反应的能力已经表明是产生保护性TH1-样应答(例如其寄生虫感染(最突出的是立什曼病))的关键(7)。IL-12的作用大部分由NK细胞和T辅助细胞产生的γ-干扰素来介导。γ-干扰素在诱导产生针对T细胞依赖性蛋白质抗原的IgG2a抗体(8)以及针对T细胞非依赖性抗原的IgG3应答(9)中很关键。IL-12，最初被称为天然杀伤细胞刺激因子，它是一种异二聚体细胞因子(10)。IL-12蛋白质在重组宿主中的表达和分离在出版的国际专利申请WO90/05147(11)中有所描述。
有希望作为佐剂的另一细胞因子是GM-CSF。GM-CSF是集落刺激因子(CSF)的一种具体类型。CSF是诱导骨髓中所见祖细胞分化成具体类型成熟血细胞的淋巴因子家族。如纳入本文作为参考的美国专利5,078,996(12)所述，GM-CSF能激活巨噬细胞或前体单核细胞来介导非特异性杀肿瘤活性。编码人GM-CSF基因的核苷酸序列已有描述(12)。含有GM-CSF cDNA的质粒已经转化到大肠杆菌中，并已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏号为39900。如纳入本文作为参考的美国专利5,229,496(13)所述，GM-CSF基因还被插入酵母表达质粒中，ATCC保藏号为53157。另外，如纳入本文作为参考的美国专利5,073,627(14)所述，编码糖基化位点已被除去的GM-CSF的DNA序列以保藏号67231保藏于ATCC。
GM-CSF显示出能上调抗原呈递细胞上已知能增强免疫应答反应的蛋白分子(15)，而且能影响纯种的鼠B细胞的Ig分泌(16)。
其它细胞因子或淋巴因子也显示具有免疫调节活性，它们包括但不局限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、β和γ、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α和β。
细胞因子或淋巴因子的全身给药相关问题是与细胞因子或淋巴因子活性有关的生物学结果。另外，如果细胞因子或淋巴因子的局部浓度得到维持，那么应能增强与产生抗原特异性免疫应答的产生有关的细胞因子或淋巴因子的作用。
在以前的研究中，分别评价了GM-CSF和IL-12，并观察到各种免疫应答参数的增强。
本文中描述的发明证实，通过将抗原、所选的细胞因子或淋巴因子佐剂以及第二种佐剂MPLTM(较佳的以稳定的可代谢乳液形式)组合，能增强针对该抗原的特异性免疫应答。
选择加入本发明抗原性组合物的抗原包含衍生自蛋白质的肽或多肽，和下列物质的片段糖类、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、或其它大分子成分。本文所用的术语“肽”包含一连串至少6个氨基酸，且含有至少一个抗原决定簇，而“多肽”是比肽更长、但不构成全长蛋白质的分子。本文所用的“片段”包含糖、蛋白质、多或寡核苷酸、或其它大分子成分的一部分而不是全部。在HIV情况下，本发明的抗原性组合物还包含全长HIV蛋白质。
本发明以采用衍生自HIV的肽抗原的模型系统为例。这些肽描述在或衍生自纳入本文作为参考的美国专利5,013,548(17)和5,019,387(18)中，现在作归纳如下。这些肽包含对应于HIV包膜蛋白区域(针对该区域产生中和性抗体和T细胞应答)的氨基酸序列。
HIV是一种人逆转录病毒，它是获得性免疫缺陷综合征(ADIS)的致病因子。HIV通过其外膜糖蛋白与T淋巴细胞表面的CD4(T4)分子结合而感染免疫系统的T淋巴细胞，因此，它用CD4(T4)分子作为进入和感染T细胞的受体。尝试通过免疫接种诱导针对HIV感染的特异性保护性免疫应答很少成功。目前许多方法寻求确定一种有效的保护性的疫苗策略。这些方法包括采用能表达HIV抗原性表位的减毒和重组细菌载体(19)、重组腺病毒(20)或牛痘病毒载体(21)、DNA疫苗(22)和含有HIV的各种T和B细胞表位的合成的肽(23)。
现已表明，HIV外膜糖蛋白gp120能诱导人体中和性抗体。编码整个gp120分子大约1/3的重组蛋白PB1显示具有能诱导中和性抗体形成的包膜蛋白部分。然而，黑猩猩研究表明，完整的gp120或PB1均不能诱导产生高滴度的中和性抗体。
用常规方法合成了对应于gp120抗原决定簇的短肽，结果产生了针对gp120的抗体应答反应，中和了病毒并诱导了针对该病毒的T辅助细胞和CTL应答。
一种这样的肽是含有多个C4/V3表位的HIV-1MN肽，命名为T1SP10MN(A)(+Cys)，以及其半胱氨酸缺失的变异体T1SP10MN(A)(-Cys)。这些肽包括Th，TCTL和B表位，但是不诱导干扰CD4结合的抗体。在以前已经证实，当将这些C4/V3 HIV肽和CFA或CFA样佐剂一起给予时，这些肽是有前途的免疫应答反应诱导候选物(24-29)。这些肽含有以前表明在小鼠和人中诱发CD4+Th细胞应答的表位，而且它含有一个主要的中和决定簇以及被Balb/c小鼠和人CD8+CTL识别的位点(HLA B7+)。这39个氨基酸的肽最近证实在HIV感染的患者中具有免疫原性和安全性(28)。
T1SP10MN(A)(+Cys)具有以下的40个氨基酸序列
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO1)(26).
T1SP10MN(A)(-Cys)是合成的，17位没有半胱氨酸，它具有下示的39个氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Lyr Lys (SEQ IDNO2).
该半胱氨酸残基位于Th细胞、CTL或B细胞识别的功能性表位之外。来自病毒基因组各区域的其它HIV肽在美国专利5,861,243(30)、美国专利5,932,218(31)、美国专利5,939,074(32)、美国专利5,993,819(33)、美国专利6,037,135(34)和出版的欧洲专利申请671,947(35)中有所描述，这些文献均纳入本文作为参考。
HIV抗原可以是蛋白质、或衍生自所述蛋白质的多肽、肽或片段。该蛋白质可以是糖蛋白，如gp41、gp120或gp160。或者，蛋白质可以是诸如gag，pol，vif，rev，vpr，tat，nef或env等基因编码的蛋白质。衍生自这些蛋白质的肽将含有至少一个长度至少为6个氨基酸的抗原决定簇(表位)。
针对HIV肽的免疫应答可通过将该肽与药学上可接受的载体分子共价连接(偶联)来增强。载体分子的合适例子包括破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白和对应于HIV gp120糖蛋白的T细胞表位的其它肽。
目前认为，成功的抵抗HIV的疫苗策略需要引发抗HIV的粘膜免疫力以及好的CTL应答。在最近采用T1SP10MN(A)多表位肽、粘膜佐剂霍乱毒素的鼠研究中，已表明鼻内免疫诱导了中和性血清IgG1抗体(36)。随后仍采用HIV-V3环状肽的研究证实诱导产生了粘膜合成的IgA抗体和强的细胞介导的应答，包括肽特异性CTL(37)。高滴度的全身中和性抗体在预防和稳定HIV感染个体中的功能作用未知，但是认为高滴度的病毒特异性抗体对于预防病毒传播很重要。
在本发明的较佳实施方案中，配制了含有MPLTM的稳定的水包油乳液，然后将其与细胞因子IL-12或GM-CSF混合。下示数据证实，这些组合产生了高滴度的HIV-中和性血清抗体。MPLTMSE和GM-CSF的组合诱导免疫接种雌小鼠阴道穹隆(vault)内产生高滴度的抗原特异性IgG和IgA抗体。用配以MPLTMSE和GM-CSF的T1SP10MN(A)肽的任一种疫苗免疫小鼠诱导产生了强烈的细胞免疫应答反应(通过增强的抗原特异性细胞增殖和细胞因子分泌入培养物中而确定)并诱导产生肽特异性CTL应答。
一般来说，MPLTM或MPLTMSE联合GM-CSF或IL-12以及所选蛋白质或肽的抗原/佐剂制剂能诱导高滴度的抗原特异性病毒中和抗体，IgG亚类的比例明显向较高比例的补体固定的IgG抗体移动(小鼠中为IgG2a占优)，提高了单核细胞在体外对抗原刺激反应中细胞因子的产生和细胞增殖。在MPLTM不存在时，无论有无GM-CSF或IL-12，抗原和SE的制剂均未观察到有这些性能。本发明的制剂还诱导了良好的细胞应答(通过CTL的诱导而确定)。
MPLTMSE的一个优点是该制剂不在注射部位诱导肉芽肿性累积和炎症；而油包水或水包油佐剂制剂通常会引起这些注射部位反应。
目前还没有报道过用其它治疗HIV的佐剂制剂能在没有局部肉芽肿炎症的情况下通过MPLTM结合GM-CSF或IL-12的刺激作用而诱导增强的免疫应答反应。
进行了一系列的研究来比较MPLTM(有或没有SE)加上GM-CSF或IL-12与单独的MPLTM、SE、GM-CSF、IL-12或CFA/IFA，或与HIV肽在一起的效果。现在将在更详细的讨论中展示这些结果的总结。
在第一个实验中，用和MPLTMSE以及GM-CSF一起配制的C4/V3 HIV肽T1 SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫Balb/c小鼠，结果注射仅2次后就产生了超过107的血清IgG滴度。该抗体反应是HIV中和性的，且证实IgG1、IgG2a和IgG2b肽特异性抗体滴度有显著增高。用肽刺激的培育脾细胞释放IL-4、IL-5和γ-干扰素的水平升高。总之，那些发现表明诱导产生了平衡的Th1/Th2型应答。在经MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠的阴道灌洗液中产生了对T1SP10MN(A)(-Cys)有特异性的IgG和IgA抗体。这些发现表明，MPLTMSE和GM-CSF与HIV肽抗原的组合诱导产生了有利的免疫应答类型。
在此第一个实验中，Balb/c小鼠用HIV肽T1 SP10MN(A)(-Cys)以及含有SE的佐剂制剂或GM-CSF来免疫，结果产生了对该肽有特异性的IgG抗体滴度(表1)。水包油型稳定乳液(SE)由鲨烯、甘油和乳化剂(磷脂酰胆碱)组成，它表明在与T1SP10MN(A)(-Cys)混合时能增强肽特异性IgG滴度。通过免疫接种以SE配制的25∶gT1SP10MN(A)(-Cys)诱导的IgG滴度诱导了二次应答滴度，其约为用肽和CFA免疫、然后用IFA和肽加强免疫的小鼠所诱导滴度的1/5。用CFA/IFA常规配制的疫苗的接种者在初次免疫应答反应中产生T1SP10MN(A)(-Cys)特异性IgG滴度。为了进行比较，单用25∶g(微克)的T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫小鼠。
将MPLTM的水性和SE制剂与用Freund佐剂或细胞因子IL-12和GM-CSF免疫小鼠所诱导的反应作比较。在几个重复的研究中，混合了IL-12的T1SP10MN(A)(-Cys)的接种者通常不产生肽特异性抗体滴度。相反，GM-CSF或MPLTMSE加上T1SP10MN(A)(-Cys)的接受者产生低的但很容易检测的IgG抗体滴度。在含有MPLTMSE和T1SP10MN(A)(-Cys)肽的制剂中加入IL-12或GM-CSF在免疫应答中诱导产生了明显较高的IgG滴度。实际上，用MPLTMSE和GM-CSF的联合来免疫小鼠导致二次应答滴度始终高于经其它任何测试制剂免疫的小鼠。该肽的特异性IgG滴度高于经Freund佐剂配制的125微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠的滴度。
所需的HIV特异性免疫应答反应的特征是细胞和体液免疫力之间的平衡。特定的免疫球蛋白同种型亚类与T辅助细胞亚组朝Th1或Th2占优势的方向偏离有关。这些T辅助细胞亚组各自分泌的细胞因子已证实具有指导IgG亚类转换的活性。测定第二次免疫后两周收集的合并血清IgG亚类的终点滴度(endpoint titer)(表2)。在几个重复的研究中，单用T1SP10MN(A)(-Cys)、或配以GM-CSF或IL-12免疫小鼠没有产生或产生低的IgG亚类滴度。IgG3抗体不能用ELISA检测到。用CFA乳化的T1SP10MN(A)(-Cys)免疫、IFA加强免疫的小鼠组主要产生了T1SP10MN(A)(-Cys)特异性的IgG1抗体应答。肽与SE、MPLTMSE、MPLTMSE加IL-12或MPLTMSE加GM-CSF的制剂也产生了高滴度的IgG1抗体。SE配制疫苗的接受者反复证实有明显的IgG1滴度，但是没有明显的IgG2a或IgG2b滴度。在SE制剂中加入MPLTM导致IgG2a和IgG2b T1SP10MN(A)(-Cys)特异性抗体滴度增高。在MPLTMSE和T1SP10MN(A)(-Cys)中加入IL-12或GM-CSF导致IgG1∶IgG2a抗体滴度比移动。若没有细胞因子，MPLTMSE配制的疫苗诱导了相似的IgG1和IgG2a滴度。IL-12和GM-CSF都提高了肽特异性IgG2a的相对血清浓度。另外，MPLTMSE和GM-CSF的组合还使T1SP10MN(A)(-Cys)特异性IgG2b抗体滴度显著增加(是MPLTMSE的47倍，是SE的74倍)。经MPLTMSE和GM-CSF以及T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫的小鼠所产生的滴度始终是各疫苗接种组中最高的。
为了确定经T1SP10MN(A)(-Cys)、MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠合并血清所测得的高滴度是否代表了该组中的各只小鼠，将该组中各只小鼠的滴度与经Freund佐剂配制的肽免疫的小鼠的滴度相比较(图1)。确定各个血清的IgG、IgG1和IgG2a滴度平均值与合并血清测得的滴度相似(数据未显示)。用MPLTMSE和GM-CSF共同配制T1SP10MN(A)(-Cys)使得IgG、IgG1和IgG2a的滴度明显高于接种CFA/IFA的小鼠中所诱导的滴度。经配以MPLTMSE和GM-CSF的肽所免疫的所有小鼠均产生了高于经CFA/IFA制剂免疫的小鼠中所测得的IgG抗体滴度。这些结果表明，MPLTMSE和GM-CSF的组合产生了有利的抗体应答特征(从高滴度的肽特异性抗体可以确定)和有利的IgG亚类分布。该制剂通常在所有所用疫苗制剂中诱导出最高的T1SP10MN(A)(-Cys)特异性滴度。
用与水性MPLTM、SE或MPLTMSE一起配制的GM-CSF免疫小鼠，比较小鼠的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG滴度，以确定GM-CSF作为补充佐剂的影响(图2)。结果提示，MPLTMSE和GM-CSF以及肽的组合是该特定实施方案中唯一诱导出高滴度抗体的一个组合。MPLTM加GM-CSF所引发的滴度与CFA/IFA相当。因此，当一起配制时，MPLTM和GM-CSF的佐剂性质看来有协同性，其中MPLTM可以是水性形式，或是稳定的乳液形式。
然后，测定第二次免疫后4周时合并的小鼠阴道灌洗液中T1SP10MN(A)(-Cys)特异性抗体滴度(图3)。经MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠产生了高滴度的IgA和IgG抗体。接种其它制剂的小鼠阴道灌洗液通常未能检测到有抗体滴度。由于阴道灌洗液中的IgG与IgA之IgG占优，且没有测定sIgA，因此不能得出阴道灌洗液中检测到的IgA抗体是由粘膜组织局部合成的结论。实际上，所检测到的IgA和IgG滴度可能是远离阴道粘膜的浆细胞所分泌的免疫球蛋白渗出的结果。
这些结果证实，用MPLTMSE结合IL-12或GM-CSF配制的HIV-肽T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠具有高滴度的肽特异性血清抗体。
为了评价那些抗体滴度在功能上是否有效，分析血清抑制细胞受实验室适应的HIV病毒株体外感染的能力。该试验测定了受合适HIV病毒株感染的细胞进入培养上清的病毒的逆转录酶活性。经MPLTMSE和GM-CSF或MPLTMSE和IL-12免疫的小鼠血清均有显著减少的病毒传染性(图3)。最高大的病毒逆转录酶(活性)单位为9481至10411范围内。用该制剂免疫的小鼠血清抑制了病毒复制。甚至在仅仅1/20的病毒稀释度下，经MPLTMSE和GM-CSF以及T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠血清仍能抑制大约50％的病毒复制。与经MPLTMSE、IL-12和HIV肽制剂免疫的小鼠所得的血清滴度为71相比，测得该制剂的血清中和滴度大于1600。
与用CFA和IFA免疫小鼠所引发的滴度相比，那些小鼠组的血清抗T1SP10MN(A)(-Cys)滴度是相似的(但是稍高一些)。在本试验中，接种CFA/IFA乳化的T1SP10MN(A)(-Cys)的小鼠血清没有显示出中和HIV作用。接种肽以及作为佐剂联用MPLTMSE加GM-CSF的小鼠血清表现出中和活性比任何其它血清都高。在相同的稀释度下，经MPLTMSE加GM-CSF以及HIV肽免疫的小鼠血清中和比其它疫苗制剂接受者血清更高的病毒浓度。
然后测定了培养物中HIV肽特异性脾细胞增殖。细胞对T1SP10MN(A)(-Cys)的应答的测定方法是，使脾细胞与肽或对照蛋白一起体外培养。该试验测定了掺入正在分裂的细胞的DNA中的3H-胸苷(表4)。与未经佐剂免疫的小鼠脾细胞不同，免疫接种和SE一起配制的T1SP10MN(A)(-Cys)的小鼠脾细胞在对该肽反应中迅速增殖。疫苗接种者的脾细胞对培养中不相关的抗原(溶菌酶)不起反应，或没有抗原刺激反应。所有组均对促分裂素ConA的刺激有相似的反应。在大多数组中，显示了抗原特异性剂量依赖型增殖反应。在所有三种肽剂量下，接种MPLTMSE共同配制的GM-CSF的小鼠组测得最高程度的增殖。接种以CFA/IFA、或IL-12加HIV-肽配制疫苗的小鼠组脾细胞测得有最低的增殖反应。经肽以及SE或GM-CSF免疫的小鼠脾细胞在培养物中有相似的胸苷掺入水平。这些结果表明，用MPLTMSE和GM-CSF共同配制HIV肽使得鼠脾细胞在体外抗原呈递反应中有最高的增殖潜力。
检查培养的脾细胞将细胞因子IL-4(表5)和γ-干扰素(表6)分泌到培养上清中的可能性。测定用抗原或促分裂素体外刺激后三天和六天后收获的培养上清中的这些细胞因子。IL-4(T辅助细胞2型相关的细胞因子)的测定结果表明，尽管所有组均在3天后在对促分裂素ConA刺激的反应中产生了可检测水平的IL-4，但只有用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠在对肽刺激的反应中产生IL-4。只有用MPLTMSE加GM-CSF和T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠在用于刺激脾细胞的所有肽剂量下将可检测水平的IL-4分泌入培养物中。在培养6天后，用肽以及MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠脾细胞的IL-4分泌水平高于用肽以及MPLTMSE、MPLTMSE加IL-12或SE免疫的小鼠所检测到的水平。IL-4水平甚至还高于培养中受ConA刺激的那些细胞所诱导产生的水平。从用MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠的培养脾细胞也对T1SP10MN(A)(-Cys)的6天刺激起反应，将可检测水平的IL-5(另一T辅助细胞2型细胞因子(未显示))分泌入培养物中。而其它组小鼠的脾细胞在这些培养物中均未产生可检测的IL-5。
所有组小鼠的脾细胞均对培养物中ConA的3天刺激起反应，将可检测水平γ-干扰素分泌到培养中(表6)。只有用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠细胞在对HIV肽的三天刺激的反应中产生可检测水平的γ-干扰素。在刺激培养6天后，观察到在对ConA和肽的反应中均有较高浓度的γ-干扰素。感兴趣的是从用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠脾细胞培养上清测得的γ-干扰素水平。这两个接种组的脾细胞分泌到培养上清中的γ-干扰素浓度显著高于用肽以及MPLTMSE加IL-12或SE免疫的小鼠脾细胞。
第一个实验的结果证实，在稳定的水包油乳液中加入MPLTM、然后将该乳液与HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)以及GM-CSF混合，结果诱导产生了中和性抗体。而且，GM-CSF与MPLTMSE以及疫苗抗原一同配制使得分泌到培养上清中的IL-4、IL-5以及γ-干扰素水平提高，并增强了培养物中经免疫性抗原刺激的脾细胞的增殖反应。该制剂也诱导出所试验的疫苗制剂中最高的IgG、IgG2a和IgG2b滴度。只有接种了MPLTMSE和GM-CSF以及肽组合的小鼠组的阴道灌洗液在多次反复研究中始终有可检测的IgG和IgA滴度。MPLTMSE、IL-12和肽的组合还提高了IgG1和IgG2a的滴度，提高了病毒中和效果，提高了脾细胞增殖以及IL-4和γ-干扰素的分泌。
用任何单一佐剂配以HIV肽接种小鼠都不会产生具有引发中和抗体性质的免疫应答反应。
常发现，用T1SP10MN(A)(-Cys)和MPLTMSE或MPLTM以水性制剂形式免疫小鼠诱导产生了良好的抗体滴度。然而，这些制剂并不始终诱导具有阴道抗体滴度、中和性抗体滴度(或强的CTL应答，如下文实验8所述)的免疫应答反应。与肽结合的MPLTM或MPLTMSE偶尔能诱导阴道灌洗液可测定的IgA和IgG滴度。在一些研究中，在疫苗制剂中的MPLTM中加入IL-12或GM-CSF产生的滴度与用CFA/IFA、或具有或没有细胞因子的MPLTMSE制剂免疫的小鼠中产生的滴度相似。该发现提示产生HIV肽特异性的高滴度抗血清不需要SE形式的MPLTM。在SE载体中加入GM-CSF可使肽特异性滴度比单用SE或用SE和IL-12免疫的小鼠有所提高。然而，诱导好的IgG2a和IgG2b抗体滴度一般依赖于肽加MPLTM和GM-CSF的配方。感兴趣的是，注意到该配方诱导的IgG滴度与用其它制剂(如CFA/IFA和肽)免疫所诱导的那些滴度相似。MPLTMSE与GM-CSF和肽的组合是唯一表现出诱导高滴度中和性抗体和CTL的制剂(见实验8)。IL-12加MPLTMSE和肽也诱导了有利的免疫应答反应。结果表明，MPLTMSE和细胞因子GM-CSF或IL-12的共同配制在抗体应答反应中与用CFA和IFA免疫相比有质的差别。认为该差别可归因于IgG2a和IgG2b水平的提高。
在第二个实验中，按照第一个Balb/c-HIV肽实验的程序稍作改动。MPLTM也以含有或不含细胞因子的水性形式给予。
用不含佐剂的HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)免疫Balb/c小鼠，结果不诱导产生显著的抗体滴度。相反，含有各种佐剂/细胞因子组合的肽抗原制剂在两次免疫后诱导产生了高的抗体滴度。
用肽和IL-12或单用SE进行免疫，结果使滴度与没有佐剂使诱导的滴度没有区别(表7)。以GM-CSF共同配制的肽的接受者具有适当增加的滴度。与含有CFA/IFA的疫苗接受者相比，微流化的MPLTMSE显示产生相似的肽特异性抗体滴度。与CFA/IFA疫苗接受者相比，MPLTMSE诱导了更高水平的肽特异性IgG2a。所用的免疫方案可能影响所观察的抗体滴度。然而，用MPLTM(水性)配制的肽免疫小鼠却诱导出高滴度的肽特异性抗体。在该制剂中加入GM-CSF或IL-12使得滴度增加超过106。因此，HIV肽与MPLTM和细胞因子IL-12或GM-CSF的组合诱导产生了对该肽有特异性的高滴度抗体。
对阴道灌洗获得的液体进行检测，只有用肽和MPLTM以及IL-12或MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠组产生了较高的抗体滴度(表8)。实际上，只有用MPLTM和IL-12以及肽免疫的该组小鼠产生肽特异性IgA。
在体外肽刺激的反应中通过掺入胸苷测定培养脾细胞的增殖能力。表9中的数据以这样的方式来表示，对增殖进行归一化，标准化成通过ConA刺激确定的增殖最大值。用MPLTMSE以及GM-CSF或IL-12免疫的小鼠脾细胞，或单用GM-CSF免疫的小鼠脾细胞显示出低水平的肽相关的增殖。相反，用肽结合MPLTM以及GM-CSF免疫的小鼠的脾细胞显示出明显的增殖。
另外测定了体外培养的脾细胞的细胞因子产生。对于IL-4，只有用MPLTMSE结合GM-CSF和T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠在对肽刺激的反应中分泌高水平的IL-4(表10)。对于γ-干扰素，用MPLTMSE和GM-CSF或IL-12、或水性MPLTM和GM-CSF或IL-12免疫的小鼠在培养上清中产生了易于检测水平的该细胞因子(表11)。
因此，细胞因子GM-CSF或IL-12与MPLTM或MPLTMSE的组合诱导出对该肽抗原特异性的高滴度抗体。该滴度与用肽和CFA/IFA免疫小鼠所诱导产生的滴度相似。数据表明，这些组合也诱导培养脾细胞最高的增殖反应，并建立了在对肽刺激反应中分泌最高水平γ-干扰素的脾细胞群。
该第二个实验的结果表明，MPLTM和细胞因子GM-CSF或IL-12和T1SP10MN(A)(-Cys)的共同配方可诱导出类似于或更好于用肽和CFA免疫并用肽和IFA加强免疫的小鼠中所诱导的免疫应答类型。
第二次免疫后两周对注射部位进行组织学评价(未显示)，表明用微流化MPLTMSE免疫小鼠不会产生或维持单核细胞渗入真皮。苏木精/伊红染色的组织看上去象未接受佐剂者制得的组织。相反，用CFA和IFA作为佐剂(油包水乳液)免疫的Balb/c小鼠在该区域有大量的单核细胞积聚。MPLTMSE和GM-CSF以及肽的接种者与没用GM-CSF的MPLTMSE接种者相比显示出单核细胞明显但边缘性增加。仅用GM-CSF和肽免疫的小鼠组织未作检查。
第三个实验按照第二个实验的方案，用Swiss-Webster小鼠代替Balb/c小鼠。采用Swiss-Webster小鼠来确定HIV肽抗原的佐剂效果，其中受MHC限制的辅助性T细胞表位不会影响免疫应答反应。Swiss-Webster小鼠是杂交繁殖的小鼠株系；因此，不进行细胞研究。在本实验中仅测定抗-HIV肽IgG终点滴度和阴道灌洗液IgG和IgA终点滴度的倒数。从表12和13看出，应答类型与第一和第二实验中测得的Balb/c小鼠所得的数据相当。
在第四个实验中，按照第二个实验的程序进行，并稍作变化，采用Balb/c小鼠。如表14所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐剂制剂引发了明显高于单用MPLTM的IgG GMT反应。如表15所示，MPLTMSE和GM-CSF的佐剂制剂引发了明显的IgG2b亚类反应。MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐剂制剂引发了显著高于单用MPLTM的IgG2a亚类反应，同时，MPLTMSE和GM-CSF或IL-12的制剂引发了高于单用MPLTM的IgG2a亚类反应。如表16所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的制剂在阴道灌洗液中引发了明显高于单用MPLTM的IgG滴度。最后，如图4所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐剂制剂，以及MPLTMSE和GM-CSF或IL-12的制剂分别显示出高于单用MPLTM或MPLTMSE的脾细胞增殖。
在第五个实验中，按照第二个实验的程序进行，并稍作变化，采用Balb/c小鼠，佐剂制剂中不加入IL-12。如表17所示，含有MPLTM和GM-CSF的佐剂制剂引发了明显高于单用MPLTM的IgG2a和IgG2b应答反应。而且，含有MPLTM和GM-CSF的佐剂制剂还引发了明显高于单用MPLTM时的所有IgG亚类的应答反应。
在第六个实验中，按照第二个实验的程序进行，并稍作变化，采用Balb/c小鼠，佐剂制剂中不加入IL-12。HIV肽的氨基酸长度为40，因为氨基酸17位有半胱氨酸。如表18所示，含有MPLTMSE和GM-CSF的佐剂制剂引发了明显高于单用MPLTM时的所有IgG亚类的反应，和显著高于单用MPLTMSE时的所有亚类的反应。
在第七个实验中，按照第六个实验的程序进行，并稍作变化，采用Balb/c小鼠，佐剂制剂中不加入IL-12。如表19所示，含有MPLTMSE和GM-CSF的佐剂制剂引发了明显高于MPLTMSE的所有IgG亚类的反应，含有MPLTM和GM-CSF的佐剂制剂引发了明显高于单用MPLTM时的所有IgG亚类的反应。
在第八个实验中，将MPLTMSE、或MPLTMSE加GM-CSF与多表位肽T1SP10MN(A)(+Cys)配制在一起，对小鼠进行免疫，评价该小鼠脾细胞产生HIVMN特异性CTL反应的能力作为功能性细胞介导的免疫力的指标。
如图5所示，用MPLTMSE、或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠脾细胞显示出对未标记或用IIIB CTL表位经脉冲标记的靶细胞活性很低。用与MPLTMSE和GM-CSF一起配制的T1SP10MN(A)(+Cys)免疫的小鼠脾细胞在一次免疫后诱导出好的HIVMN特异性CTL活性。在第二次免疫后7天测定时，HIVMN特异性CTL介导的靶细胞裂解显著增强(图5)。在另一个实验中，未用佐剂免疫的小鼠未诱导CTL反应。用水性MPLTM和肽免疫的小鼠产生较低的(＜30％)肽特异性CTL反应。
评价该免疫原性组合物抵御HIV的潜在效力的困难是HIV感染的非人灵长类动物不产生类似于AIDS的症状。因此，潜在的动物模型不能模拟HIV引起的人体症状。幸运的是，被猿猴免疫缺陷病毒(SIV，该病毒与HIV密切相关)感染的非人灵长类动物能产生类似于AIDS的症状。
这样就能在非人灵长类动物中评价SIV抗原。SIV抗原可以是蛋白质或衍生自所述蛋白质的多肽、肽或片段。该蛋白质可以是诸如gp41、gp120或gp160等糖蛋白。或者，该蛋白质可以是诸如gag，pol，vif，rev，vpr，tat，nef或env等基因编码的蛋白质。衍生自这些蛋白质的肽将含有至少一个长度至少为6个氨基酸的抗原决定簇(表位)。
与HIV相似，在非人灵长类动物中采用多表位SIV肽。进行研究以评价各种肽与MPLTMSE和GM-CSF的组合是否能引发CTL反应。在0、4、8和18周，用MPLTMSE和GM-CSF以及下列三个肽中任一肽对猕猴进行皮下免疫(接种)(见表20)(1)每个肽含有如下所示的Mamu A*01限制性CTL表位Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ IDNO3)(gag)(38，39)Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ IDNO4)(pol)(40)Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ IDNO5)(env)(40)(2)或者，这三个肽各与具有以下序列的混杂(promiscuous)T辅助细胞表位相连Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID NO6)(根据文献41改进)因此，这三个肽具有下列序列Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn GlnMet(SEQ ID NO7)Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg LeuVal(SEQ ID NO8)Glu Leu Tyr Tys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly GlnIle(SEQ ID NO9).
每两周收集肝素化血液，用51Cr释放试验、新鲜外周血单核细胞(PBMC)的四聚体染色以及培养的PBMC的四聚体染色来分析外周血单核细胞的CTL。新鲜PBMC的四聚体染色和51Cr释放测定的溶细胞杀伤作用未显示有活性。然而，用MPLTMSE和GM-CSF配制的Mamu A*01限制的Th/CTL肽混合物对猕猴进行免疫却导致检测出四聚体阳性的CD8阳性T细胞。表21-24中显示的结果表明与各肽培养11天的PBMC中检测到四聚体阳性CD8+(表21-23)或CD4+(表24)T细胞的百分数。
总之，用具有Th表位(Rh 55，Rh 142)或不具有Th表位(Rh 73，Rh 80)的CTL表位免疫的所有四只MamuA*01阳性猕猴显示检测到对gag、pol或env有特异性的CD8阳性四聚体阳性细胞。如所预计的，在MamuA*01阴性动物(Rh 41，Rh 47)中没有检测到四聚体阳性CD8细胞。在初次免疫后见到了SIV gag和env特异性免疫应答反应，而在加强免疫后观察到pol特异性四聚体阳性。由于第18周的最后一次加强免疫没有使应答反应进一步提高，因此在表21-24中没有显示14周后的数据。
总之，用佐以MPLTMSE和人GM-CSF的Mamu A*01限制性的Th/SIV gag，pol和env CTL表位肽混合物对猕猴进行免疫，结果如灵敏的特异性四聚体试验所证明的那样，引发了细胞应答反应。
淋病奈瑟氏球菌的膜孔蛋白B蛋白也称为PIB蛋白，该蛋白已被重组表达(42，纳入本文作为参考)，它是预防或治疗淋病奈瑟氏球菌所引起的感染的候选抗原。
进行了一系列的研究，比较了和淋病奈瑟氏球菌的膜孔蛋白B蛋白改进版本(其中氨基端的16个氨基酸来自噬菌体，其后是成熟形式的膜孔蛋白B蛋白)在一起时，采用MPLTM(有或没有SE)加GM-CSF或IL-12与单用MPLTM(有或没有SE)的效果。下面将提供研究结果的小结。
在第一个实验中，用重组膜孔蛋白B蛋白在Swiss-Webster小鼠臀部作皮下免疫接种，产生抗原特异性抗体滴度，表明该膜孔蛋白B蛋白是有活性的候选抗原。在MPLTM和膜孔蛋白B蛋白中加入GM-CSF，结果使血清抗体IgG和IgG2a滴度比接受MPLTM和膜孔蛋白B蛋白有所提高(见表25和26)。
在第二个实验中，用重组膜孔蛋白B蛋白加IL-12和MPLTM或MPLTMSE在Swiss-Webster小鼠臀部作皮下免疫，结果诱导产生了高于接受膜孔蛋白B蛋白加MPLTM或MPLTMSE时的抗原特异性抗体滴度(尤其是IgG)。在初次和第二次免疫后均观察到有较高的滴度。在制剂中加入IL-12导致阴道灌洗液中测得的IgG滴度增加约10倍(见表27)。
天然二聚体形式的人呼吸道合胞病毒(RSV)的纯化的天然融合(F)蛋白是预防RSV感染的候选抗原(43，纳入本文作为参考)。
进行一系列研究，比较了在与RSV纯化的天然F蛋白一起时，用MPLTM(有或没有SE)加GM-CSF或IL-12与单用MPLTM(有或没有SE)、磷酸铝或StimulonTMQS-21的效果。下面提供研究结果的小结。
在第一个实验中，经天然RSV F蛋白肌内免疫的Balb/e小鼠产生了抗原特异性抗体滴度，表明该F蛋白是有活性的候选抗原。将GM-CSF加入MPLTM中，结果在初次和第二次免疫后诱导出高于单用MPLTM的抗F蛋白终点滴度(见表28)，而且还使脾细胞对体外刺激的细胞应答反应比单用MPLTM时有所增强(见表29)。将GM-CSF加入MPLTMSE中使得对F蛋白的初次IgG应答比单用MPLTMSE时更高(见表28)。
第二个实验重复第一个实验的程序。将GM-CSF加入MPLTM中，结果在初次和第二次免疫后均诱导出高于单用MPLTM时的抗F蛋白终点滴度(见表30)。将GM-CSF加入MPLTMSE中也在初次免疫后诱导了比单用MPLTMSE更高的抗F蛋白终点滴度(见表30)。在F蛋白和MPLTM或MPLTMSE的制剂中加入GM-CSF诱导了比用缺少GM-CSF的制剂更高百分比的RSV特异性脾细胞CTL活性，如免疫小鼠脾细胞所测定的那样(见表31)。
第三个实验用IL-12代替GM-CSF。IL-12和MPLTM的共同制剂在初次免疫后诱导了比F蛋白单加MPLTM输送时更高的IgG滴度(见表32)。然而，在MPLTM或MPLTMSE中加入IL-12对于效应细胞体外刺激后测得的RSV特异性CTL活性没有影响(见表33)。
进行一个研究，比较了当与流感病毒NP(核壳)蛋白一起时，MPLTM(有或没有SE)加上GM-CSF与单用MPLTM(有或没有SE)的效果。进行实验测定抗体滴度的NP量不够。用有或没有佐剂的NP肽免疫小鼠，在最后一次免疫后14天，分析脾细胞对于抗原刺激的应答反应。在含有MPLTM或MPLTMSE的制剂中加入GM-CSF，结果使CTL活性明显降低(数据未显示)。
还不清楚为何会获得该反常的结果。可能在进行试验时有技术问题。
在给予本发明的抗原性组合物后，该抗原性组合物可通过提高脊椎动物宿主抗体反应和细胞介导的免疫力来调节免疫应答反应，该组合物包含选自病原性病毒、细菌真菌或寄生虫的抗原，以及与细胞因子或淋巴因子(尤其是GM-CSF或IL-12)结合的有效辅佐量的MPLTM(以水性或稳定的乳液形式)。已显示具有免疫调节活性的其它细胞因子或淋巴因子包括，但不局限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、β和γ、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α和β。
所述细胞因子或淋巴因子的激动剂或拮抗剂也在本发明范围内。本文所用的术语“激动剂”指增强所述细胞因子或淋巴因子活性或以和其相同的方式起作用的分子。该激动剂的例子是所述细胞因子或淋巴因子的模拟物。本文所用的术语“拮抗剂”指抑制或阻止所述细胞因子或淋巴因子活性的分子。该拮抗剂的例子是可溶的IL-4受体和可溶的TNF受体。
本文所用的术语“有效辅佐量”指本文所述佐剂的结合量，该结合量适合在脊椎动物宿主中引发增强的免疫应答。具体剂量将部分取决于宿主的年龄、体重和医疗状况，以及给药方法和抗原。在较佳的实施方案中，佐剂组合将采用1-100微克/剂范围内的MPLTM。本领域技术人员不难确定合适的剂量。本发明的抗原性组合物还可以常规方式与免疫学上可接受的稀释剂或载体混合，制得可注射的液体溶液或悬浮液。
本发明的抗原性组合物可通过各种途径给予人或非人脊椎动物，这些途径包括但不局限于，鼻内、经口、阴道、直肠、肠胃外、皮内、透皮(例如见国际申请WO98/20734(44)，纳入本文作为参考)、肌内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。抗原性组合物中的抗原成分的量部分取决于抗原的身份、宿主的年龄、重量和医疗状况、以及给药方法。同样，本领域技术人员很容易确定合适的剂量。尽管不需要，但较佳的是抗原与佐剂组合同时给予。抗原性组合物的剂数和剂量方案也是本领域技术人员容易确定。在一些情况下，佐剂组合的佐剂性质可减少所需的剂数或剂量方案的时间。
本发明的佐剂组合适用于含有各种抗原的抗原性组合物，该抗原可来自各种病原性微生物，它们包括但不局限于感染人和非人脊椎动物的病毒、细菌、真菌、寄生虫微生物，或来自癌细胞或肿瘤细胞。抗原可包含衍生自蛋白质的肽或多肽，以及下列物质的片段糖类、蛋白质、多或寡核苷酸、癌或肿瘤细胞、变应原、淀粉样肽蛋白或其它大分子组分。在一些情况下，抗原性组合物中加入多种抗原。
含有本发明佐剂组合的所需病毒疫苗包括目的为预防和/或治疗由下列病毒引起的疾病的那些疫苗，这些病毒包括但不局限于人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、萼状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒、牛伤寒病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽类传染性粘液囊病病毒、新城堡疾病病毒、马立克氏病病毒、猪呼吸生殖道综合征病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
含有本发明佐剂组合的所需细菌疫苗包括目的是预防和/或治疗由下列细菌引起的疾病的那些疫苗，这些细菌包括但不局限于流感嗜血杆菌(可分类的(typable)和不可分类的(nontypable))、睡眠嗜血杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、幽门螺杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、砂眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、百日咳博德特氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、白喉棒杆菌、结核分枝杆菌、贪食分支杆菌、胞内分支杆菌复合体、奇异变形菌、普通变形菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌、问号钩端螺旋体、布氏疏螺旋体、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、大叶性肺炎放线杆菌和鸡败血枝原体。
含有本发明佐剂组合的所需抗真菌病原体疫苗包括目的是预防和/或治疗下列真菌引起的疾病的那些疫苗，这些真菌包括但不局限于，曲霉、芽酵母、假丝酵母、球孢子菌(Coccidiodes)、隐球菌和组织浆菌。
含有本发明佐剂组合的所需抗寄生虫疫苗包括目的是预防和/或治疗下列寄生虫引起的疾病的那些疫苗，这些寄生虫包括但不局限于，Leishmania major、蛔虫、Trichuris、Giardia、Schistosoma、Cryptosporidium、Trichomonas、Toxoplasma gondii和、Pneumocystis carinii。
含有本发明佐剂组合的引发脊椎动物宿主治疗性或预防性抗癌作用的所需疫苗包括采用癌抗原或肿瘤相关抗原的那些疫苗，这些抗原包括但不局限于，前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
含有本发明佐剂组合的缓和脊椎动物宿主对变应原应答反应的所需疫苗包括含有变应原或其片段的那些。这些变应原的例子在美国专利5,830,877(45)和出版的国际专利申请WO99/51259(46)中有所描述，这些出版物均纳入本文作为参考，包括花粉、昆虫毒液、动物鳞屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。该疫苗干扰IgE抗体(变态性应答反应的已知病因)的产生。
含有本发明佐剂组合的预防或治疗脊椎动物宿主以淀粉样沉积为特征的疾病的所需疫苗包括含有淀粉样肽蛋白(APP)部分的那些疫苗。该疾病另外被称为阿尔茨海默疾病、淀粉样变性或致淀粉样(amyloidogenic)疾病。β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)是APP的42个氨基酸的片段，它通过β和γ分泌酶加工APP而产生，并具有下列序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NOl0).
在一些患者中，淀粉样沉积采用聚集Aβ肽的形式。令人惊奇的是，已经发现分离的Aβ肽的给予诱导了脊椎动物宿主中抵抗淀粉样沉积的Aβ肽成分的免疫应答反应。因此，本发明的疫苗包括本发明的佐剂组合再加上Aβ肽，以及Aβ肽的片段和针对Aβ肽或其片段的抗体。一个Aβ肽的片段是具有下列序列的28个氨基酸的肽(48)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO11).
在HIV和SIV的情况下，抗原性组合物包含至少一种蛋白质或衍生自所述蛋白质的多肽、肽或片段。在一些情况下，抗原性组合物中可包括多个HIV或SIV蛋白质、多肽、肽和/或片段。
本发明的佐剂组合制剂(配方)还适合作为多核苷酸疫苗(也称为DNA疫苗)的佐剂。这些疫苗可进一步包括促进剂如布匹卡因(bupivicaine)(见美国专利5,593,972(49)，纳入本文作为参考)。
为了更好地了解本发明，列举了下列实施例。这些实施例仅仅是为了描述，而不应理解成限制了本发明的范围。
实施例实验1用HIV肽和各种佐剂免疫接种Balb/c小鼠实施例1材料和方法动物7-9周龄的雌性Balb/c小鼠购自Taconic Farms，Inc.(Germantown，NY)。所有小鼠均饲养在美国实验室动物饲养鉴定协会批准的设施中。在开始研究之前，使小鼠适应饲养设施1周。
肽多表位HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)(-Cys)的序列如下Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO2).该肽在以前已有描述(28，29)，它含有在小鼠和人中均引起CD4+Th细胞应答反应的HIV-1 gp120MN的序列(主要的中和决定簇)以及被Balb/c小鼠CD8+CTL识别的位点。该肽由R.Scearce博士(Duke University，Durham，NC)提供。对于CTL分析，对应于HIV-1-IlID的V3环中的CTL表位的肽(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile(SEQ IDNO12)，H-2Dd限制性)或HIV-1-MN(Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr(SEQ IDNO13)，H-2Dd限制性)购自Denosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)。将肽溶解在无菌水中，在使用前用合适的缓冲液或细胞培养液稀释。
佐剂所有含MPLTM的佐剂制剂从Ribi ImmunoChem Research，Inc.(Hamilton，MT)获得。MPLTM用三乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)制成水性制剂。溶解后，按照生产商说明书对MPLTM进行超声处理，产生一乳光/澄清溶液，作无菌过滤。MPLTMSE以预先配制的鲨烯基水包油(1-2％的油)乳液形式提供，其中MPLTM的浓度在0-2500微克/毫升之间。磷酸铝由自己制得。Freund完全佐剂(CFA)和不完全佐剂(IFA)购自DifcoLaboratories，Detroit，MI。T1SPl0MN(A)肽和Freund佐剂用两个连接的注射器以1∶1的比例乳化。重组表达的鼠IL-12由Genetics Institute(Cambridge，MA)提供。重组鼠GM-CSF由Immunex(Seattle，WA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)提供，或以无载体冻干粉末形式购自Biosource International(Camarillo，CA)。
免疫接种在小鼠臀部进行皮下免疫，总体积为0.2毫升，等量分在尾部的每一侧。在下述不同时间间隔处进行免疫。将抗原和细胞因子稀释在磷酸缓冲盐溶液中至合适的浓度，在免疫前16小时以内在无菌条件下配以佐剂。轻轻搅动混合疫苗，4℃下保藏。在临免疫时，涡流混合该制剂。
样品收集在初次免疫前以及所示时间点取动物血液。分析各小鼠的血清或同组小鼠的合并物。对安乐死的小鼠上进行阴道灌洗，评价抗体水平。这用下述方式来进行用200∶1移液管将75∶1 RPMI-10滴注入雌小鼠的阴道穹隆中。反复输送和取出液体来洗涤该穹隆，然后加入10∶1的FBS。分析阴道灌洗合并液。
细胞制备对于增殖试验和体外细胞因子分析，在所示时间点获得小鼠的脾细胞。从3-5只小鼠的合并物制得单细胞悬浮液(如结果所示)。对于增殖和细胞因子分析，将细胞悬浮在96孔圆底培养板中，孔内预先用HIV肽抗原、对照蛋白或仅仅RPMI-10包被过夜。利用具有2x补充物的培养液以5×105细胞/孔的密度加入脾细胞。在培养开始后3天或6天，收获一式三孔细胞培养上清进行细胞因子分析。紧接收获上清后，培养中加入3H-胸苷脉冲18-24小时，收获以定量测定细胞增殖。
酶联免疫吸附试验为了分析HIV肽特异性抗体和亚类的分布，将该肽以1微克/毫升的浓度悬浮在碳酸盐缓冲液(15mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠、pH 9.6)或PBS中，以100∶1(微升)的体积接种到96孔微量滴定板(Nunc)中。37℃培育过夜后，洗涤该板，室温下封闭(0.1％明胶/PBS)2-4小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.1％TweenTM20)洗涤ELISA板，然后加入连续稀释的血清(PBS，0.1％明胶，0.05％TweenTM20，0.02％叠氮钠)。培育4小时后，洗涤各孔，加入生物素化抗同种型/亚类抗体的合适稀释液，4℃培育过夜。洗涤各孔，与链亲和素偶联的辣根过氧化物酶一起培育。培育后，洗涤各孔，用ABTS显色。在405nm下读各孔。用对照血清将滴度标准化。
对于细胞因子分析，将细胞培养上清加入经BVD6-11B11(用于抗IL-4)或R4-6A2(用于γ-干扰素)包被的孔中。培育和洗涤后，用生物素标记的BVD6-24G2(用于IL-4)或XMG1.2(用于γ-干扰素)使各孔显色。用从重组鼠γ-干扰素或自介素-4得到的标准曲线测定细胞因子浓度。所有细胞因子试剂购自Pharmingen(San Diego，CA)。
HIV-1MN中和试验中和试验在Duke大学Thomas Matthews博士的实验室中进行。试验基本上如前(25)所述那样进行。简言之，将测试血清的稀释液等分在96孔微量滴定板的孔中(25∶1/孔)。在各孔内加入等体积的连续稀释的病毒原液。培育后，将病毒/抗体混合物加入AA5靶细胞中。将细胞培养在96孔微量滴定板中，每隔一天加入新鲜的培养液。感染7天后，测定上清中病毒逆转录酶的存在作为病毒复制、成功感染或抑制的指标。
实施例2抗T1SP10MN(A)IgG终点滴度的倒数在初次免疫后的所示时间点测定合并血清(n＝5Balb/c)的抗HIV肽特异性IgG终点滴度的倒数。在第0天和第27天用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)对小鼠臀部作皮下免疫，除非另有描述。对于Freund佐剂接受者，用CFA乳化的肽使小鼠接触抗原，用IFA加强。MPLTMSE以含2％鲨烯油的乳液形式提供，每剂50微克MPLTM。SE是由鲨烯、甘油和乳化剂组成的水包油乳液载体。重组鼠IL-12以50毫微克/小鼠的剂量给予。重组鼠GM-CSF以10微克/小鼠的剂量给予。结果显示在表1中。
表1抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点滴度的倒数终点滴度佐剂 微克HIV肽 第4周 第6周第8周无 25 ＜100 ＜100＜100CFA/IFA25 23,998 137,683 313,200rIL-12 25 ＜100 ＜100＜100GM-CSF 25 ＜100 17,579 12,537SE 25 ＜100 171,923 76,479MPLTMSE 25 ＜100 104,331 79,021MPLTMSE+ 25 ＜100 1,313,330631,688rIL-12MPLTMSE+ 25 14,824 ＞10,000,000 3,752,870GM-CSF实施例3抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点亚类滴度的倒数测定初次免疫后6周、第二次免疫后2周的合并血清(n＝5 Balb/c)的IgG亚类终点滴度的倒数。用25微克肽对小鼠臀部作皮下免疫，除非另有描述。对于Freund佐剂的接受者，使小鼠接触完全Freund佐剂乳化的肽，第4周和第6周用不完全Freund佐剂加强。MPLTMSE以含2％鲨烯油的乳液形式提供，每剂50微克MPLTM。SE是由鲨烯、甘油和乳化剂组成的水包油乳液载体。重组鼠IL-12以50毫微克/小鼠的剂量给予。重组鼠GM-CSF以10微克/小鼠的剂量给予。结果显示在表2中。
表2抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG亚类终点滴度的倒数终点滴度佐剂 微克HIV肽 IgG1 IgG2a IgG2b无25 ＜100 ＜100 ＜100
CFA/IFA 25 29,907 143 798rIL-12(.05) 25 ＜100 ＜100 ＜100GM-CSF(10)25 1,78 3＜100＜100SE(2％) 25 74,293 ＜100 3,331MPLTM(50)SE(2％) 25 11,441 10,1765,280MPLTM(50)SE(2％) 25 169,27827,1612,303+rIL-12(.05)MPLTM(50)SE(2％) 25 3,494,862 954,707 245,828+GM-CSF(10)实施例4阴道灌洗液的IgG和IgA抗T1SP10MN(A)(-Cys)抗体滴度测定首次免疫后两周获得的阴道灌洗液的IgG和IgA抗肽抗体滴度。在第0、28和42天，用25微克T1 SP10MN(A)(-Cys)和所示佐剂制剂对每组5只Balb/c雌小鼠进行免疫。测定合并的灌洗液阴道抗体滴度。结果显示在表3中。
表3阴道灌洗液IgG和IgA抗T1SP10MN(A)(-Cys)抗体滴度佐剂 IgG IgA＜20 ＜20无CFA/IFA 20＜20rIL-12(.05) ＜20 ＜20GM-CSF(10) ＜20 ＜20MPLTM(50)SE(2％)＜20 ＜20MPLTM(50)SE(2％)+ 24＜20rIL-12(.05)MPLTM(50)SE(2％)+ 1,125 113GM-CSF(10)SE(2％) ＜20 ＜20实施例5脾细胞增殖测定用T1SP10MN(A)(-Cys)和不同佐剂制剂免疫的小鼠脾细胞的增殖。在第0和28天，用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)和所示佐剂对每组5只Balb/c雌小鼠进行免疫。第56天建立脾细胞培养物，收获以测定96小时后3H-胸苷掺入。用以水性制剂或含2％SE的稳定乳液中的50毫微克IL-12、10微克GM-CSF和50微克MPLTM免疫小鼠。数据表示成与无刺激时培养生长的细胞所测得的增殖值相比的Δcpm值。本底刺激计数小于800cpm。结果列在表4中。
表4脾细胞增殖
实施例6脾细胞的IL-4分泌测定经25微克T1SP10MN(A)(-Cys)刺激的脾细胞分泌到培养液中的白介素-4。从5只Balb/c雌小鼠合并收获脾细胞，并和所示的抗原性刺激物(所示的50毫微克IL-12、10微克GM-CSF、50微克MPLTM)一起培育3天或6天。用ELISA测定白介素-4的水平，并与具有已知浓度的标准品比较。空白孔表明试验不能在那些培养条件下检测到白介素-4。检测灵敏度的下限为22单位/毫升。结果列在表5中。
表5脾细胞的IL-4分泌三天培养物
表5(续)脾细胞的IL-4分泌六天培养物
实施例7脾细胞的γ-干扰素分泌测定经25微克T1SPl0MN(A)(-Cys)刺激的脾细胞分泌到培养物中的γ-干扰素。从5只Balb/c雌小鼠合并收获脾细胞，并和所示的抗原性刺激物(与实施例6相同)一起培育3天或6天。用ELISA测定γ-干扰素的水平，并与具有已知浓度的标准品比较。空白孔表明试验不能在那些培养条件下检测到γ-干扰素。检测灵敏度的下限为4皮克/毫升。结果列在表6中。
表6脾细胞的γ-干扰素分泌三天培养物
表6(续)脾细胞的γ-干扰素分泌六天培养物
试验2用HIV肽和不同佐剂免疫Balb/c小鼠实施例8材料和方法动物采用上述实施例1中的7-9周龄的Balb/c雌小鼠。
肽采用实施例1中描述的HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)。使该肽在盐水中重新水化至浓度为1毫克/毫升。
佐剂所用佐剂如实施例1所述，只是在一些情况下保持MPLTM为水性制剂的形式，而不是采用稳定乳液形式。
免疫接种在小鼠臀部进行皮下免疫，总体积为0.2毫升，等量分在尾部的每一侧。在第0天和第21天用25微克HIV肽以及所示量的佐剂进行免疫。接受CFA/IFA的小鼠在第0天接受CFA，在第21天接受IFA。稀释和混合如实施例1所述。
样品收集根据实施例1的程序，在每次免疫前1天和第二次免疫后14天收集动物样品。
细胞制备细胞制备物的产生和操作按照实施例1的程序。
酶联免疫吸附试验根据实施例1的程序进行ELISA。
HIV-1MN中和试验同样，根据实施例1的程序，在Duke大学进行中和试验。
实施例9抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点滴度的倒数从第二次免疫后14天获得的个别小鼠的几何平均值(GMT)或合并的血清(n＝5Balb/c)测定抗肽IgG终点滴度的的倒数。另外还测定了合并血清的IgG1和IgG2a亚类终点滴度。对于Freund佐剂的接受者，使小鼠接触以CFA乳化的25微克肽，然后用IFA加强。MPLTMSE以含1％鲨烯油的乳液形式提供，每剂50微克MPLTM。水性MPLTM以每剂50微克的量输送。重组鼠IL-12以40毫微克/小鼠的剂量给予。重组鼠GM-CSF以10微克/小鼠的剂量给予。结果显示在表7中。
表7抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG终点滴度的倒数终点滴度佐剂 IgG IgG IgG1IgG2a(微克/剂) (合并物)(GMT) (合并物)(合并物)无＜1000 720 ＜1000 ＜1000CCFA/IFA 72,387 135,740 126,433 9,023MPLTMSE 183,802 197,808 162,480 98,342SE2,426 6,029 1,859 ＜1000MPLTMSE+148,139 133,171 103,298 50,415GM-CSFMPLTMSE+182,852 611,076 6,610 111,662rIL-12GM-CSF27,333 1,756 14,538 4,864rIL-12＜1000 500 ＜11000 ＜1000MPLTM219,705 241,918 134,428 7,127MPLTM+ 946,695 1,101,449 545,444 12,291GM-CSFMPLTM+ 377,972 2,378,702 204,334 12,795rIL-12实施例10抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG亚类终点滴度的倒数从第二次免疫后15天获得合并血清(n＝5Balb/c)测定HIV肽特异性阴道灌洗液IgG和IgA抗体终点滴度的倒数。小鼠如实施例9那样进行免疫。MPLTMSE以含1％鲨烯油的乳液形式提供，每剂50微克M