专利名称：具有佐剂活性的复合物的制作方法 对暴露在病原体中而产生的保护性免疫是两种不同的免疫应答联合完成的。它们分别是先天性应答和抗原特异性应答，后者也称作适应性应答。先天性免疫应答在感染早期发挥作用，它在几分钟内探测出来自侵入病原体的广泛信号并做出应答。相反，适应性免疫应答需要长达两周的时间才能发挥作用，但是它具有精确的抗原特异性，这对于完全消除病原体和产生免疫记忆是必需的。先天性免疫系统中病原体的抗原独立识别导致直接动员免疫效应物和调控机制，提供给宿主三种重要的生存优势(i)迅速启动先天性和适应性免疫应答，并建立抗原识别所需要的炎性和共刺激环境。(ii)在适应性应答成熟时期建立抑制病原体的第一道防御。(iii)控制适应性应答达到免疫应答的细胞或体液元件，这对于保护其免受特殊感染源感染是最有效的。因此，尽管接种的全部目的都是为激活抗原的特异性免疫，但在没有首先并有效激活先天性免疫应答的病原体探测机制的情况下，疫苗并不能最理想地完成这一任务。许多疫苗都包含抗原和佐剂。根据其功能，它们被广泛定义为当联用时可以增强抗原体内免疫原性的物质。这样，佐剂成为大多数成功疫苗的重要组分，特别是以包括被杀灭的病原体和/或重组抗原的隔离片段的病原体亚单位为基础的疫苗。然而，由于对先天性免疫机制和抗原加工与抗原递呈的情况认识的增长，需要有新的和更复杂的佐剂。因此，传统的和新的佐剂逐渐被分成作为递送系统的佐剂和作为免疫增强剂的佐剂。然而，递送系统的主要功能是把疫苗组分集中到抗原呈递细胞上，免疫增强剂则通过包括类-Toll受体的特异性受体直接激活抗原呈递细胞。重要的是记住，传染原和大多数已许可的疫苗，特别地是减毒活疫苗和被杀死的全细胞疫苗制品，包含激活整个免疫应答所需要的所有组分。这是因为在这些疫苗中使用的病原体具有微粒形式的所有相关抗原，作为一个完整的细胞，也包含许多有效的免疫调节因子；即，分子模式的病原体。但是疫苗发展的趋势是去除这些产物，而成为更安全和更好的确定的亚单位疫苗并作为高度纯化的重组蛋白质制造出来。不幸的是，这些重组抗原的免疫原性常常很低，因为它们缺乏内在的免疫增强活性。因此在亚单位疫苗发展中的挑战是，再导入选择性信号以激发先天性免疫应答，以充分模拟自然传染或整个病原体细胞接种的途径。与完整细胞的疫苗相比，用于改善亚单位疫苗效能的递送系统和免疫增强剂应当是低廉、更有效和更安全的。尽管术语“递送系统”和“佐剂”在与疫苗相关的领域一般是可互换使用的，但常常要区分它们之间明显的区别和各自所具有的作用。所列举的疫苗“佐剂”包括许多的微粒递送系统，例如，乳剂、脂质体、免疫刺激复合物、病毒类粒子和微粒体，其作用的原理类型是促进抗原递送到负责诱导免疫应答的关键抗原呈递细胞上。但是，它们是较弱的免疫调节因子，因此需要加入免疫增强剂显著改善它们的性能。除非另有定义，此处的术语“佐剂”代表免疫增强剂。作为免疫增强剂的新的和改良型的佐剂，其发展的主要障碍在于安全性，因为如果可以接受用于临床，那么新的疫苗必须具有最低的不良反应。因此，尽管许多佐剂已经做过临床前和临床的广泛评估，但仅有来源于铝(一般称作“Alum”)的佐剂在北美成功获得作为疫苗佐剂应用的许可。Alum在产生细胞毒素CD8 T细胞免疫方面是较弱的。它优先介导偏重于Th2的免疫应答，而不是偏重于Th1的免疫应答。尽管在动物中使用天然的包含病原体相关性分子图式分子作为免疫增强剂佐剂的观点已经得到证明，但未来的趋势则是设计合成类似物。这主要是由于良好确定和标准化的合成免疫增强剂制造价格较低廉并且调节障碍较小。
正如最早在1968年报道的那样，一些合成的聚阴离子聚合物可以保护用致死量脑膜炎病毒进行免疫性试验的小鼠，并且当其体外给予羧酸盐共聚物或其盐时，鼠科腹膜巨噬细胞产生出抑制囊状口腔炎病毒的因子(Merigan&Finkelstein.Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionicpolymers.Virology 1968；35363-374)。
最近，报道了藻酸盐(分离自海藻的聚合物)可以诱导TNF-α、IL-1和IL-6释放(Otterlei M et al.Induction of cytokine production from human monocytesstimulated with alginate.J.Immunother.1991；10286-291)。藻酸盐的1-4-β-甘露糖醛酸部分也可以通过CD14/类Toll受体调节机制诱导TNF-α从单核细胞中释放。木质素衍生物和墨角藻多糖也可以诱导TNF-α从巨噬细胞中释放(Sorimachi K et al.Secretion of TNF-a from macrophages following induction with a ligninderivative.Cell Biol.Int.1995；19833-838；Heinzelmann et al.Modulation ofLPS-induced monocyte activation by heparn-binding protein and fucoidan.Infect.Immun.1998；66；5842-5847)。当给猪尾猴注射时，硫酸墨角藻多糖和硫酸葡聚糖也显示可以显著提高IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF和G-CSF的循环水平(Sweeney EA等，Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does notrequire selectin presence.Proc.Natl.Acad.Sci.200；6；6544-6549)。
趋化因子是一组异源性的可诱导促炎趋化细胞因子，包括TNF-α、IL-1和IL-6，包括MIP-1α和MIP-1β在内的β-趋化因子，在单核细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱型利细胞和淋巴细胞中作为化学诱导物(LusterAD.Chemokines-chemotactic cytokinesthat mediate inflammation.New Eng.J.Med.1998；338；436-446)。将趋化因子结合到各自的受体上会导致细胞激活的串联过程，包括肌醇三磷酸的产生、细胞内钙的释放及蛋白激酶C的激活。由此，趋化因子激活了可控制趋化性的细胞机制。这样，它们在向其蓄积区域补充白细胞和产生局部免疫应答中发挥了关键性的作用。
然而，由上述聚合物导致的促炎细胞因子过度释放，这意味着它们具有非常大的毒性而不能安全施用于人。因此，尽管许多聚合物都显示出具有免疫调节的性质，但由于它们从天然来源中分离、分离的重现性、实验室中合成型聚合物的合成及当施用于动物时聚合物的毒性等问题，它们从未被有效开发应用于人的治疗中。


本发明提供一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物药理活性的物质，或(ii)具有抗癌药理活性的物质，或(iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
本发明也提供一种药物制剂，包括将本发明的复合物与药学上适宜的载体混合或结合。
本发明进一步提供一种用作药物的本发明的复合物。
本发明还提供一种复合物，用于治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物产生免疫应答，其中该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染的方法，包括向对象施用治疗有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中诱导对病原生物产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种用于治疗癌症的复合物，其中该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗癌症的方法，包括向对象施用治疗有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对癌症产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和一种或多种选自抗原和免疫原的试剂，用于诱导对抗原或免疫原产生免疫应答。
本发明进一步提供一种在对象中诱导对抗原或免疫原产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的复合物，该复合物包括窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和具有抗病原生物药理活性的物质一起治疗病原生物感染和/或诱导对病原生物产生免疫应答。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对病原生物产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和一种或多种选自抗原和免疫原的试剂一起诱导对抗原或免疫原产生免疫应答。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中诱导对抗原或免疫原产生免疫应答的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于和具有抗癌药理活性的物质一起治疗癌症和/或诱导对癌产生免疫应答。
本发明进一步提供一种在需要这种治疗的对象中治疗癌症的方法，包括向对象施用治疗有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种在需要治疗的对象中诱导对癌产生免疫应答的方法，包括向对象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于在疫苗的制造中作为免疫增强佐剂。
本发明进一步提供一种窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元，用于在疫苗的制造中作为免疫增强佐剂，其中所述疫苗包含诱导产生免疫应答的抗原或免疫原。
在制造疫苗的方法中，本发明进一步提供一种改进，包括使用一种窄分子量分布的聚合物作为免疫增强佐剂，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其盐的单元。
定义此处所述的术语“包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物”表示一种包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的聚合物，例如本文所述聚合物中的一种，例如包含衍生自甲基丙烯酸或其盐的单元的聚合物，如聚甲基丙烯酸或其盐，例如其钠盐。该聚合物可以是丙烯酸的均聚物或共聚物，例如丙烯酸或甲基丙烯酸或它们的盐。
聚合物具有窄分子量分布，具体而言多分散性为1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。由此，通常优选多分散性小于1.2。
聚合物通常具有这样的分子量以使得存在于血液中时，在通过肾以后聚合物基本都保留在循环血液中，没有或只有少量聚合物经过肾小球器官的过滤。肾过滤(也称为肾小球过滤)大分子是其一项功能，尤其是根据分子的大小和形状进行过滤，而部分也依赖于分子量。一般地，对于任意特定的聚合物，存在阈分子量或窄范围的分子量，低于该分子量则发生肾过滤，高于该分子量则不发生或很少发生肾过滤。任意特定聚合物的阈分子量可以通过标准试验例如用放射标记聚合物来确定。
作为一般性的指导，该聚合物的分子量一般为例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。该聚合物的分子量一般为例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。该聚合物可具有如上较大分子量和较小分子量的组合范围的分子量。例如，该范围包括但不限于，80,000至4,000、75,000至5,000、65,000至10,000、55,000至10,000及45,000至10,000。进一步的实例包括的范围例如是50,000至4,000，例如40,000至25,000。一般优选分子量范围为45,000至10,000。
此处术语“PMAA-Na”表示聚甲基丙烯酸，钠盐。除非另有说明，它表示实施例A1-A4制备的聚甲基丙烯酸，钠盐。
此处术语“复合物”表示包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和其他所述物质的联合体，该联合体各组分之间主要是非共价结合的，例如包括一种或多种离子、静电和范德华力。尽管根据本发明的复合物各组分之间主要是非共价结合的，但其中也会有一些共价结合。


附图1附图1显示的是在RPMI中细胞与PMAA-Na培养后红细胞的溶解。
人红细胞的2％v/v溶液与PMAA-Na(“药物”)溶液在RPMI 1640介质中在37℃培养1小时和24小时。在1小时或24小时后当PMAA-Na浓度高达2,000μg/ml时未观察到显著毒性。该图显示了3个人类供体(A、B和C)的结果。附图1a显示供体A的结果，附图1b显示供体C的结果，附图1c显示供体B的结果。培养1小时后得到的结果如圆所示，培养24小时后得到的结果如菱形所示。
附图2附图2显示的是在RPMI中与PMAA-Na培养后全血中红细胞的溶解。
全人血(供体D)的2％v/v溶液与PMAA-Na(“药物”)溶液在RPMI 1640介质中培养。当使用人全血的PMAA-Na浓度高达500μg/ml，在1小时(如交叉所示)、6小时(如三角形所示)或24(如圆所示)后均未观察到显著毒性。
附图3附图3显示的是PMAA-Na对来源于人单核细胞的巨噬细胞(附图3a)和人原代腹膜巨噬细胞(附图3b)的毒性的缺失。
附图3a显示的是当来源于人单核细胞的巨噬细胞在包含浓度为0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介质中培养所得到的结果。将细胞培养71小时，然后加入噻唑蓝(MTT，Sigma 5mg/ml)。使用PMAA-Na的结果如闭合方块所示，作为对照组的聚(L-赖氨酸)结果如圆所示。在MTT测定和锥虫蓝测定中当PMAA-Na的最高浓度为2,000μg/ml时，对MDMs仍然是没有毒性的。
附图3b显示的是当人腹膜细胞在包含浓度为0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介质中培养所得到的结果。将细胞培养71小时，然后加入MTT。使用PMAA-Na的结果如闭合方块所示，使用作为对照组的聚(L-赖氨酸)结果如圆所示。PMAA-Na在浓度高达500μg/ml时对腹膜巨噬细胞仍然是没有毒性的。在浓度为500μg/ml到2,000μg/ml之间时在MTT测定和锥虫蓝测定中观察到较小的毒性。
附图4附图4显示的是在不含内毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β从人腹膜巨噬细胞中释放。
来自3个供体(A、B和C)的人腹膜巨噬细胞在不含内毒素的PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的MIP-1β。所有试剂和PMAA-Na包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml(EU/ml)。附图4a显示供体A的结果，附图4b显示供体B，附图4c显示供体C。在PMAA-Na存在的条件下，MIP-1β具有显著的释放。
附图5附图5显示的是在不含内毒素的PMAA-Na作用下TNF-α从人腹膜巨噬细胞中释放。
来自2个供体(A和B，分别为附图5a和5b)在不含内毒素的PMAA-Na(500μg/ml和2,000μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的TNF-α。在两种浓度的PMAA-Na存在的条件下，TNF-α具有显著的释放。
附图6附图6显示的是在用介质对照组或PMAA-Na培养的单一供体人腹膜巨噬细胞中趋化因子和细胞因子释放。
人腹膜巨噬细胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培养，36小时后收集培养的上清液，分析其中的促炎症反应趋化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8以及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。图中所示为取自3个不同的人类供体(A、B和C)细胞的结果。介质对照组的结果用空白方块表示，PMAA-Na的结果用黑方块表示。MIP-1α的释放如附图6a所示，TNF-α由附图6b表示，MIP-1β由附图6c表示，IL-8和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β如附图6d所示，IL-8如附图6e所示，IL-6如附图6f所示。所述趋化因子和细胞因子从组织抗原呈递细胞中的释放达到某一水平，该水平可以促进人体的药理学Th1应答，而没有高到导致人体有显著的有害不良作用。
附图7附图7显示的在不含内毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β从来源于单核细胞的巨噬细胞中释放。
来源于单核细胞的巨噬细胞在浓度为100μg/ml、500μg/ml和2,000μg/ml的PMAA-Na中培养。来自3个不同人供体A、B和C的细胞的结果分别如附图7a、7b和7c所示。并未观察到MIP-1β的释放。因此与源自基于组织体区室中巨噬细胞源的细胞相比，PMAA-Na对于来源于血单核细胞的细胞具有不同的免疫调节效果。
附图8附图8显示的是在PMAA-Na而不是市售的PMAA-Na作用下MIP-1β从人腹膜巨噬细胞中释放。
人腹膜巨噬细胞分别在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制备的PMAA-Na中培养。市售的PMAA-Na中的一个具有与实施例A1-A4制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(即附图中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每种情况下都是500μg/ml。36小时后收集培养的上清液。结果显示没有MIP-1β的释放。附图8a和8b分别显示了两个人供体A和B的结果。
附图9附图9显示的是在PMAA-Na但不是市售的PMAA-Na作用下TNF-α从人腹膜巨噬细胞中释放。
人腹膜巨噬细胞分别在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制备的PMAA-Na中培养。市售的PMAA-Na中的一个具有与我们合成制备的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(附图中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每种情况下都是500μg/ml。36小时后收集培养的上清液。结果显示没有TNF-α的释放。附图9a和9b分别显示了两个人类供体A和B的结果。
附图10，11和12附图10，11和12显示的是在用两性霉素B或两性霉素B-PMAA-Na复合物培养后红细胞的溶解。
方法如附图1所述。该对比是在临床级两性霉素B(ampho B，结果如空白方块所示)和由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物(amphoB-PMAA-Na，结果如空白圆所示)之间做出的。用于测试化合物的母液在MGM中制备。在培养1小时(附图10)、6小时(附图11)和24小时(附图12)后测定人红细胞的溶解。每种情况下都使用来自3个不同供体(A、B和C)的细胞。每条线代表一个人供体的结果。
附图10a、10b和10c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养1小时后的结果。附图11a、11b和11c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养6小时后的结果。附图12a、12b和12c分别显示了供体A、B和C的细胞在培养24小时后的结果。
在培养1小时后，没有观察到两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性。在培养6小时后，两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性远远小于临床级两性霉素B的毒性。当培养时间增加到24小时后，临床级两性霉素B的毒性增加到100％，但两性霉素B-PMAA-Na制剂的毒性没有进一步的增加。
附图13附图13显示的是在两性霉素B-PMAA-Na复合物培养后单个供体的红细胞溶解。
方法如附图11所述，两性霉素B-PMAA-Na复合物如实施例C中所述制备。在浓度高至1,000μg/ml的各浓度两性霉素B-PMAA-Na复合物(“药物”)下培养1小时和24小时后测定红细胞溶解的程度。培养1小时后所得到的结果如空白方块所示，培养24小时后的结果如黑圆圈所示。
附图14附图14显示的是在培养PBMN细胞1、2和6天后两性霉素B-PMAA-Na复合物毒性的缺失。
RPMI介质中的PBMCs在包含两性霉素B-PMAA-Na复合物的培养基中培养，其中两性霉素B-PMAA-Na复合物(“药物”)如实施例3中所述制备且浓度为0-70μg/ml。在加入MTT(5mg/ml)之前，该细胞培养1天或2天或6天。在培养1天、2天或6天后，当化合物浓度最高70μg/ml时，其在MTT测定和锥虫蓝测定中对PBMcs仍然没有毒性。附图14显示的分别是3个代表性人供体的结果。每条线表示一个供体。附图14a、14b和14c分别显示在培养1天、2天和6天后的结果。
附图15附图5显示的是在培养来源于单核细胞的巨噬细胞2和3天后两性霉素B-PMAA-Na复合物的毒性。
来源于单核细胞的巨噬细胞(MDM)在包含浓度为0-125μg/ml的化合物(“药物”)的培养基中培养。在加入MTT前，将细胞培养2天或3天。使用两性霉素B得到的结果如空白圆所示，使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的结果如空白方块所示。附图15a显示培养2天后的结果，附图15b显示培养2天后的结果。在培养2天或3天后，当浓度都高达125μg/ml时，该化合物在MTT测定和锥虫蓝测定中其毒性都小于临床级两性霉素B。
附图16附图16显示的是在用两性霉素或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理后墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的存活率。
用于实验的墨西哥利什曼原虫前鞭毛体保存在Schneider′s Drosophila生长介质(Invitrogen)中，该介质中加入15％胎牛血清(在56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.14μg/ml(附图16d)。临床级两性霉素B对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.49μg/ml(附图16d)。使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的三个实验的结果如附图16a、16b和16c所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.10至0.19μg/ml(附图16a、16b和16c)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.02至1.49μg/ml(附图16a、16b和16c)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对墨西哥利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
附图17附图17显示的是在用两性霉素或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理后杜氏利什曼原虫前鞭毛体的存活率。
用于实验的杜氏利什曼原虫前鞭毛体保存在Schneider′s生长介质199中，该介质中加入15％胎牛血清(在56℃下加热灭活1小时)和庆大霉素(1mg/100ml)。临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.08μg/ml(附图17d)。临床级两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是1.91μg/ml(附图17d)。使用如实施例C中所描述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的三个实验结果如附图17a、17b和17c所示。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的半数致死量(LD50)是0.10至0.17μg/ml(附图17a、17b和17c)。两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体的90％致死量(LD90)是0.98至1.28μg/ml(附图17a、17b和17c)。基于重量/重量，两性霉素B-PMAA-Na制剂对杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有与临床级两性霉素B类似的活性。
附图18&19附图18显示的是在来源于人单核细胞的巨噬细胞中两性霉素B-PMAA-Na复合物对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长的抑制作用。附图19显示了当使用临床级两性霉素B或AmBiosome(脂质体两性霉素B，Gilead Sciences，Great Abingdon，Cambridge，UK)时相应的抑制作用。
用墨西哥利什曼原虫无鞭毛体感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的来源于人单核细胞的巨噬细胞，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。用寄生物/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。使用如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的四个实验结果如附图18a-18d所示。临床级两性霉素B的抑制作用如19a所示，AmBiosome(Gliead Sciences)如19b所示。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.18至0.32μg/ml(附图18a至18d)，而临床级两性霉素B为0.14μg/ml(附图19a)或Ambisome为0.45μg/ml(附图19b)。对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为1.18至1.55μg/ml(附图18a至18d)，而临床级两性霉素B为0.95μg/ml(附图19a)或Ambisome为3.89μg/ml(附图19b)。
附图20附图20显示的是两性霉素B-PMAA-Na复合物和AmBiosome对人巨噬细胞中细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体生长抑制作用的比较。
附图20显示了如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物(如空白方块所示；IC50＝0.3μg/ml)和AmBisome(脂质体两性霉素B，Gilead Sciences，GreatAbingdon，Cambridge，UK)(如黑圆圈所示；IC50＝1.7μg/ml)对细胞内墨西哥利什曼原虫无鞭毛体的相对活性的斜度对比。可以看出，两性霉素B-PMAA-Na制剂的杀灭曲线比AmBisome的杀灭曲线更陡。
附图21&22附图21和22显示的是在来源于人单核细胞的巨噬细胞中，两性霉素B-PMAA-Na复合物(4个实验，如附图21a-21d所示)、临床级两性霉素B(附图22a)和AmBiosome(Gilead Sciences，同上)(附图22b)对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长的抑制作用。
用杜氏利什曼原虫无鞭毛体感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的来源于人单核细胞的巨噬细胞，该介质中加入10％人血清(在56℃下加热灭活1小时)和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的链霉素。用寄生虫数/细胞的平均数乘以受感染细胞的百分比作为感染指数。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有50％抑制作用时，由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为0.30至0.71μg/ml(附图21a至21d)，而临床级两性霉素B为0.54μg/ml(附图22a)或Ambisome为1.96μg/ml(附图22b)。对细胞内杜氏利什曼原虫无鞭毛体生长具有90％抑制作用时，由如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na制剂的剂量为2.18至3.18μg/ml(附图21a-21d)，而临床级两性霉素B为2.31μg/ml(附图22a)或Ambisome为＞8μg/ml(附图22b)。
附图23附图23显示的是用不同的化合物培养24小时后，干扰素-γ从人腹膜巨噬细胞中释放。
在巨噬细胞生长培养基中培养人腹膜细胞，其中该培养基包含所示浓度的各个化合物。所用的化合物是如实施例C中所述制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物、临床级两性霉素B、市售的PMAA-Na及如实施例A1-A4中所述制备的PMAA-Na。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。24小时后收集培养的上清液。用EIA(R&D系统)测定干扰素-γ。在两性霉素B-PMAA-Na制剂(100μg/ml)存在下Th1促进细胞因子、干扰素-γ从腹膜巨噬细胞中的释放显著地高于仅有细胞的对照组、临床级两性霉素B、市售的PMAA-Na或PMAA-Na。
附图24附图24显示的是在用结核菌素PMAA-Na复合物培养后细胞中PMBC的增殖。
PBMCs再悬浮于加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链霉素的RPMI1640中。结核菌素PMAA-Na复合物(也称为结核菌素PPD-PMAA-Na)如实施例L2中所述制备。由鲎变形细胞溶解物测定法(Pyrotell，Associates of CapeCod，US)测定所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。
将细胞(105个细胞/孔)和各个化合物(如所示浓度的结核菌素PPD和结核菌素-PMAA-Na)按一式两份混合并在37℃/5％CO2下培养4天。按照1μCi/孔加入[3H]-胸苷(特定活性20-30Ci/mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培养18小时。然后收集细胞并用液体闪烁计数器测定其增殖。结果用平均数/分(cpm)±sem表示。
附图24a显示的是供体A的细胞在用结核菌素-PMAA-Na制剂培养6天后PBMC增殖的结果。附图24显示了当用1μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖显著提高。甚至当用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养时，T淋巴细胞的增殖会进一步提高(P＝0.001)。
附图24b显示的是供体B的细胞在用结核菌素-PPD和结核菌素-PMAA-Na制剂培养5天后PBMC增殖的结果。与用10μg/ml的结核菌素抗原相比，用10μg/ml的结核菌素-PMAA-Na制剂培养的T淋巴细胞增殖显著提高(P＝0.002)。这表明与结核菌素抗原对其本身的作用相比，结核菌素-PMAA-Na更能显著提高T淋巴细胞的增殖(P＝0.001)。
附图25附图25显示的是用供体A的抗原刺激人PMBCs24小时IFN-γ的产生。
分离人PBMCs并在加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的链霉素的RPMI中调节为2×105个细胞/孔。所有试剂和化合物包含的内毒素＜0.06内毒素单位/ml。PBMCs和所述化合物(结核菌素和结核菌素-PMAA-Na复合物，也称为结核菌素PPD-PMAA-Na，如实施例L2中所述制备，浓度如图所示)在由人干扰素-γ单克隆抗体(R&DSystems，UK)包被的ELISpot PVDF-backed微量培养板的孔中混合。用未受激的细胞作为阴性对照组，用重组人干扰素-γ作为阳性对照组。该培养板在37℃/5％CO2下培养24小时。然后根据厂商的说明书使微量培养板显像并得到阳性斑的数目以计算干扰素-γ的量。每个斑代表一个干扰素-γ分泌细胞。
附图25显示了产生IFN-γ细胞数目。附图25表明与单独使用结核菌素抗原相比，结核菌素PPD-PMAA-Na制剂刺激人原代T淋巴细胞释放干扰素的效果更加显著。当使用50μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂和100μg/ml结核菌素PPD-PMAA-Na制剂时，观察到干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中释放增加。
附图26附图26显示的是用临床级两性霉素B、AmBisome或两性霉素B-PMAA-Na静脉注射处理后和未处理的对照物和空白脂质体对照组中，杜氏利什曼原虫无鞭毛体在小鼠肝巨噬细胞中的存活率。
使用如附图26中所示浓度的不同化合物。无鞭毛体/500肝细胞的数目用显微镜来计数，结果用未治疗对照物的百分比来表示。相对于对照组，如实施例C中所述制备的1mg/kg两性霉素B-PMAA-Na对杜氏利什曼原虫无鞭毛体具有显著的杀灭活性(P＜0.0001)。该结果表明，两性霉素B-PMAA-Na制剂在内脏利什曼原虫病的动物模型中是有效的。
附图27用MTT测定法测定的不同分子量的PMAA-Na构造物对于红细胞的毒性。
附图27a-27c表明，如实施例N中所述制备的具有不同分子量的PMAA-Na构造物对于单个供体的红细胞的毒性的缺失。对于每种情况，PMAA-Na构造物的浓度以μg/ml给出，而红细胞的溶解以百分比形式给出。方块表示PMAA-Na构造物的分子量为19kDa时的结果，三角形表示28kDa的PMAA-Na构造物的结果，倒三角形表示37kDa的PMAA-Na构造物的结果(n＝3)。附图27a显示了在PMAA-Na构造物培养1小时后红细胞(RBCs)的溶解，附图27b显示了5小时后RBCs的溶解，附图27c显示了24小时后RBCs的溶解。在培养1小时、5小时和24小时后，2mg/ml的PMAA-Na构造物都不会导致红细胞溶解。而且该结果不受PMAA-Na构造物分子量的影响。
附图28用MTT测定法测定不同分子量的PMAA-Na构造物对外周血单核细胞(PMBCs)的毒性。
在附图28a和28b中，用如实施例N中所述制备的PMAA-Na构造物的浓度对PMBCs的百分比来作图。方块表示PMAA-Na构造物的分子量为19kDa时的结果，三角形表示28kDa的PMAA-Na构造物的结果，圆表示37kDa的PMAA-Na构造物的结果(n＝3)。附图28a显示了用PMAA-Na构造物培养1天后PMBCs的存活率，附图28b显示了用该构造物培养2天后PMBCs的存活率。在培养1天和2天后，浓度为2mg/ml的该构造物对外周血单核细胞并没有毒性。结果没有收到所制PMAA-Na构造物的分子量的影响。
附图29附图29显示的是在不同条件下贮存，两性霉素B-PMAA-Na复合物对红细胞毒性的效果。
附图29a显示的是如实施例C中所述制备并以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后的PMAA-Na复合物对红细胞(RBCs)的毒性的缺失。将不同浓度的该复合物与RBCs培养1小时，测定RBCs的溶解百分比。附图29a表明，两性霉素B-PMAA-Na复合物在以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后对红细胞没有毒性。
附图29显示的是如实施例C中所述制备并在4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物与RBCs培养1小时后的结果。溶解率用百分比表示。用新制备的临床级两性霉素B为参照物作对比。培养进行了1小时和6小时；培养1小时的结果如图所示。附图29表明，两性霉素B-PMAA-Na复合物在4℃下的5％葡萄糖中贮存7个月后对红细胞没有毒性。
附图30附图30显示的是在不同条件下贮存后两性霉素B-PMAA-Na复合物对利什曼原虫无鞭毛体和前鞭毛体的抑制作用。
附图30a显示的是根据实施例C制备并以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物对墨西哥利什曼原虫细胞内无鞭毛体生长的抑制作用。用感染指数对复合物的浓度作图。LD50为0.21μg/ml。
附图30b显示的是用根据实施例C制备并在4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后的两性霉素B-PMAA-Na复合物在MDMs中培养细胞内无鞭毛体2小时后，墨西哥利什曼原虫无鞭毛体的存活率。
用存活率百分数对复合物的浓度作图。用新制备的、临床级两性霉素B为参照物作对比。该复合物的LD50为0.4μg/ml，两性霉素B的LD50为0.3μg/ml。该复合物的结果如实心方块所示，两性霉素B的结果如空白圆所示。
两性霉素B-PMAA-Na的活性在以冻干粉末形式在4℃下贮存4个月后或4℃下在5％葡萄糖中贮存7个月后没有受到影响。
附图31附图31显示的是不同菌株的新型隐球菌(Cryptococcus neoforman)的抑制作用，其中该新型隐球菌感染了来源于人单核细胞的巨噬细胞。
在使用如实施例C中所述制备的不同浓度的两性霉素B-PMAA-Na复合物(实心方块)三天后，并用两性霉素B为参照物(空白圆)作对比，测定其抑制作用。计算受感染和未感染的巨噬细胞的数目及革兰氏阳性酵母CFU的数目。用CFU的平均数/受感染细胞的百分比，其结果为感染指数。由此也可以确定LD50值。
附图31a显示的是新型隐球菌新型变种(C.neoformans var neoformans)临床分离物1的抑制作用，附图31b显示的是新型隐球菌新型变种NCPF3003的抑制作用，附图31c显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的抑制作用，附图31d显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的抑制作用。两性霉素B的LD50(0.9-1.4μg/ml)和两性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.7μg/ml)相似。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗隐球菌的活性。
附图32附图32显示的是不同的新型隐球菌菌株的存活率，其中该菌株感染了来源于人单核细胞的巨噬细胞。
在使用如实施例C中所述制备的不同浓度的两性霉素B-PMAA-Na复合物(实心方块)三天后，用两性霉素B为参照物(空白圆)作对比，测定其存活率。
用所述生物感染来源于人单核细胞的巨噬细胞，附图32a显示的是新型隐球菌新型变种NCPF 3003的结果，附图32b显示的是新型隐球菌新型变种临床分离物的结果，附图32c显示的是新型隐球菌gattii变种NCPF 3216的结果，附图32d显示的是新型隐球菌gattii变种临床分离物的结果。两性霉素B和两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50在4个实验中都是相似的，也类似于附图31a-31d所示的4个实验。对于新型隐球菌新型变种，两性霉素B的LD50是0.9-1.4μg/ml，两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50与之相似，为1.6-2.7μg/ml。对于新型隐球菌gattii变种，两性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50与之相似，为0.1-0.5μg/ml。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗隐球菌的活性。
附图33在用不同浓度的两性霉素B(参照物)或两性霉素B-PMAA-Na复合物处理1天后，附图33a显示的是白色念珠菌ATCC 90028的存活率，附图33b显示的是光滑念珠菌ATCC 90030的存活率。
存活率用百分比来表示。用分光光度计(490nm)测定浊度以确定存活率。将对照组孔中未经处理的酵母的光密度作为100％存活率。
对于白色念珠菌，两性霉素的LD50(0.9-1.8μg/ml)和实施例C制备的两性霉素B-PMAA-Na复合物的LD50(1.6-2.3μg/ml)相似(附图33a)，而附图33b显示的是光滑念珠菌的结果。因此，该复合物和单独使用两性霉素B一样，都具有对抗念珠菌的活性。

如上所述，本发明涉及包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物的各种用途，用于治疗病原生物感染、治疗癌症、和/或作为免疫增强佐剂，还涉及一种复合物，包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物药理活性的物质或(ii)具有抗癌药理活性的物质或(iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
本发明基于我们如下的观察包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物可以诱导β-趋化因子MIP-1α和MIP-1β的释放和干扰素-γ从人原代组织巨噬细胞即抗原呈递细胞中释放，而不诱导释放中毒量的促炎细胞因子。该聚合物在高浓度下对人细胞也是无毒的。根据本发明所述的方法制备上述供试聚合物。不与任何理论相联系，我们认为上述观察表明，包含衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物可以作为Th1免疫增强佐剂，其刺激包含类Toll受体在内的细胞表面受体，即，作为增强抗原免疫刺激性质的物质。
我们在实验中已经证明，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物确实可以作为Th1免疫增强佐剂。所述复合物包含一种抗原(即结核菌素纯蛋白衍生物BP)和如本文所述生产的甲基丙烯酸钠盐均聚物(PMAA-Na)，与比结核菌素抗原对其本身的作用相比，该复合物能导致T淋巴细胞的更多地增殖，而且与单独使用结核菌素抗原相比，它也能增加干扰素-γ分泌物从T淋巴细胞中分泌。
因此，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以作为免疫增强佐剂与在常规疫苗中使用的抗原和/或免疫原联合使用，例如，所需要的抗原和免疫原直接或间接来源于治疗性和/或预防性疫苗所对抗的生物。这些抗原和抗体是例如来自天然源即直接来自相关生物的抗原和/或免疫原、亚单位抗原和免疫原和间接来自相关生物的由重组DNA技术和/或化学合成制备的抗原和免疫原。该聚合物可以和适当的抗原和/或免疫体配制成疫苗组合物。可以与递送系统佐剂一样，加入载体和赋形剂。所述聚合物和抗原和/或免疫原以本发明复合物的形式使用，或联合使用，见下文。
用于上述疫苗中的疫苗、抗原和免疫原的例子包括但不限于，直接对抗白喉(diptheria)、破伤风、伤寒、百日咳、麻疹、风疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、H.流行性感冒eg b型、髓膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、霍乱、狂犬病、脑炎(各种类型)、黄热病和流行性感冒的疫苗，抗原和免疫原用于和适合用于这些疫苗。可以根据本发明使用这些抗原和免疫原。
但是，包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物不仅在与抗原和免疫原联用时具有免疫增强的作用，而且即使不与抗原和免疫原联用，它也能促进对于病原生物的保护性Th1免疫应答，例如该病原生物主要但不仅是细胞内生物，特别是对于存在并主要保持在巨噬细胞源的细胞和/或包括树突细胞在内的其他抗原呈递细胞的生物的保护性Th1免疫应答。可以通过施用本发明该聚合物和具有抗病原生物的药理活性的物质(这里称做“药物”)来完成，例如，该病原生物主要但不仅是细胞内生物，特别是存在并主要保持在巨噬细胞源的细胞和/或包括树突细胞在内的其他抗原呈递细胞的生物，该物质尤其可以杀灭或以其他方式分裂上述的生物。生物的杀灭或分裂导致抗原物质的释放。该聚合物的存在能够加强对该抗原的免疫应答，因为进入到该已发生变化的细胞环境中的树突细胞能吸收并处理释放的抗原。然后树突细胞引发CD4+T细胞激活，促进产生效应子细胞毒性T细胞应答。上述效应中的某些能直接治疗性抵抗在残余的慢性受感染细胞中的任何生物和在这些细胞环境中的生物。对于未来再感染，其他效应子细胞毒性T细胞应答也能提供基于疫苗的保护性应答。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
因此，本发明也涉及包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物，用于和具有抗病原生物的药理活性的物质联用，治疗病原生物感染和/或诱导对于病原生物的免疫应答。本发明也涉及一种在需要这种治疗的对象中治疗病原生物感染和/或诱导对于病原生物的免疫应答的方法，包括向对象施用包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物的药理活性的物质。
该聚合物和药理活性物质优选是本发明复合物的形式，或者可选择地，它们可以联用，见下文。
诱导免疫应答的病原体主要是在细胞内复制和/或存留的那些，特别是在基于组织的巨噬细胞和其他抗原呈递细胞内复制和/或存留的那些，例如树突细胞。这些生物和由这些生物导致的疾病和病症如下列所示a)导致下列疾病和病症的生物浅部真菌病，包括癣菌病；癣；鹅口疮；马拉色菌感染，包括变色糠疹、马拉色菌毛囊炎、脂溢性(seborrhoeic)皮炎和柱顶孢霉感染(Scytalidium infection)；耳真菌病；和角膜真菌病。
b)导致侵入性和慢性真菌感染的念珠菌物种，包括白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌；曲霉物种，包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉；新型隐球菌；毛霉菌病，例如，由犁头霉、根霉和根毛霉物种所导致；镰刀菌类；毛孢子菌物种；芽生菌病；孢子丝菌物种；侧孢霉物种；组织胞浆菌病，例如由荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasmacapsulatum var.capsulatum)所导致；非洲组织胞浆菌病，例如由荚膜组织胞浆菌杜氏变种所导致；芽生菌病，例如由皮炎芽生菌所导致；球孢子菌病，例如由粗球孢子菌所导致；类球孢子菌病，例如由巴西类球孢子菌所导致；和由马内菲青霉导致的感染。
c)导致分枝杆菌病的生物，例如，由诸如结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌的分枝杆菌科成员导致的肺结核和麻风病。
d)可导致血吸虫病的血吸虫科成员，例如埃及血吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、间插血吸虫及湄公血吸虫。
e)导致伤寒和副伤寒的生物，例如A、B、C和D血清型沙门菌科成员。
f)导致弓形体病的生物，例如鼠弓形体。
g)导致人非洲锥虫病的生物，例如布氏冈比亚锥虫或布氏冈比亚锥虫。
h)导致美洲锥虫病的生物，例如，克氏锥虫。
i)导致疟疾的生物，例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。
j)导致HIV和HTLV感染的生物，例如HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-II。
k)导致卡氏肺囊虫感染的生物。
l)导致利什曼原虫病的生物，例如内脏型的，如黑热病(kala azar)，或者表皮型的，如杜氏利什曼原虫病和墨西哥利什曼原虫病。
用于治疗这些疾病和病症的药理活性物质(药物)是本领域众所周知的，例如参见Principles and Practice of Infectious Diseases，Mandell G.L，Bennett J.E.，&Dolin R著，第5版，Churchill Livingstone.(2000)，Manson′s Tropical Diseases，Cook&Zumla著，第21版，Saunders.(2003)，及其他已经开发出来的药物。
这些具有对抗病原生物的药理活性的物质的例子包括但不限于克霉唑、5-氟胞嘧啶、氟康唑、灰黄霉素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、吡嗪酰氨、环丙沙星、利福平、氨硫脲、环丝氨酸、氯法齐明、氨苯砜、rothionamide、美曲磷脂、羟氨喹、吡喹酮、联用型复方新诺明、乙氨嘧啶、磺氨多辛、螺旋霉素、美拉胂醇、硝呋替莫、氨酚喹、氯奎甲氟喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍、奎宁、叠氮胸苷、依法韦伦、印地那韦、病毒唑、阿糖腺苷、左旋咪唑及阿昔洛韦。
根据本发明的一个方面的用途，治疗不需要是完全成功的，即对生物产生免疫应答来治疗对象或完全清除该生物，可以提供有效的“第二线”防御。效应子细胞毒性T淋巴细胞应答的产生可以清除所有残留的生物，因为它们将直接治疗留在慢性受感染细胞中的生物。必须要杀灭一些生物，因此可以释放出抗原。本发明的一个优点在于即使该治疗不能完全清除这些生物，但对于未来再感染，效应子细胞毒性T淋巴细胞的诱导作用仍可以提供基于保护性疫苗的应答。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
相同的考虑也适用于癌症。本发明涉及复合物的用途，该复合物包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌药理活性的物质，尤其是可以杀灭或部分杀灭或以其他方式分裂变异的、即癌变的细胞的细胞毒素剂。细胞的杀灭或分裂导致抗原性物质的释放，抗原性物质中的一些可以被巨噬细胞和抗原呈递细胞当作非自身抗原“观察”到。该聚合物的存在能够增强对于该抗原的免疫应答，这是因为进入到已发生变化的细胞环境中的树突细胞能吸收并处理释放的抗原。然后树突细胞一氟CD4+细胞激活，该激活能促进效应子细胞毒性T淋巴细胞应答的产生。上述应答中的某一些能直接治疗其他癌细胞并以此对于癌复发和任何其他的残留癌肿微小转移的生长提供基于保护性疫苗的应答。这些应答在具有大量巨噬细胞和抗原呈递细胞的癌症中达到最大化。尤其是在淋巴瘤和白血病中。由此可以实现药理学治疗、治疗性接种和保护性接种。
具有抗癌药理活性的物质是本领域众所周知的，而且新的活性剂正在开发中，见例如CancerPrinciples and practice of oncology.V.T.DeVita，S Hellman&S.A.Rosenburg，Lippincott Williams&Wilkins出版，第6版，2001。抗癌剂的例子包括但不限于阿柔比星、放线菌素D、安吖啶、氮胞苷、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、氮烯唑氨、柔红霉素、羟基脲、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、tresulfan、长春碱、长春新碱、crisantaspase。
如上所述，通常优选的是，上述聚合物、具有抗病原生物的药理活性的物质或具有抗癌药理活性的物质(两者都称为“药物”)以本发明的复合物形式施用。经抗原呈递细胞吸收后该复合物比单独使用上述药物更为有效，而且可以确定的是，上述药物和聚合物同时存在于相同的细胞中，这样，当上述药物杀灭生物并释放出抗原时，该聚合物可以在原处等待以产生能够加强Th1免疫应答的微环境。但是，该聚合物和药物也可以是在相同的药物制剂中、或在独立的制剂中联合使用。在后者中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但一般优选两种制剂基本上同时施用。
一般优选地，该聚合物和抗原和/或免疫原以本发明的复合物的形式施用。但是，该聚合物和抗原和/或免疫原也可以在在相同的药物制剂中、或在独立的制剂中联合使用。在后者中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但一般优选两种制剂基本上同时施用。
本发明的一种复合物包含包括衍生自丙烯酸或其盐的单元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物的药理活性的物质，或(ii)具有抗癌药理活性的物质，或(iii)一种或多种选自抗原和免疫原的试剂。
病原生物、具有对抗病原生物的药理活性的物质、具有抗癌药理活性的物质、抗原和免疫原可以是例如如上所述的物质。
本发明的复合物或包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以是药物制剂的形式，其中所述制剂包含上述复合物和药学上适宜的载体。该制剂可以是或视为常规的药物制剂或疫苗，或两者都是，这取决于它的组分，特别是物质(i)、(ii)和(iii)的性质。如果试图用于诱导免疫应答，作为递送系统佐剂，也可以含有例如明矾。
如果包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物与如上所述的物质(i)、(ii)和(iii)联用，而不是以所述物质的复合物的形式施用，那么该聚合物与物质(i)、(ii)和(iii)可以制备在相同的药物制剂中或制备成独立的制剂，在每种情况下都要加入药学上适宜的载体。如果在独立的制剂中，一个制剂可以在另一个制剂之前施用，但优选两种制剂基本上同时施用。
如上所述，本发明包括对于病原生物导致的疾病、病症和癌症的常规药物治疗和诱导对上述疾病、病症和癌症免疫应答。可以理解的是，在需要治疗的对象中诱导的免疫应答，优选是治疗性和/或预防性的免疫应答。治疗性免疫应答可以帮助治疗疾病或病症。该应答可以是短期的应答。预防性免疫应答提供长期的保护，例如可以防止疾病或病症复发、或继发性感染或再感染、或癌症微小转移的产生和发展。这些应答通常称作治疗性和预防性“接种”。
包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物和具有对抗病原生物的药理活性的物质的用途已经在利什曼病的情况中举例说明，所述用途包括治疗由病原生物导致的疾病以及可同时诱导免疫应答。利什曼病中的感染可以是内脏型的，如黑热病，或者表皮型的。内脏利什曼病是一种传播性的原虫感染。许多年来，常规治疗包括将5价锑每天一次静脉或肌肉注射，共28天。但是，自1990年以来，在印度大规模锑治疗的失败导致引入了两性霉素B脱氧胆酸盐(AmB)作为有效的抗利什曼病药物。通过两性霉素B静脉给药，按照0.75-1mg/kg/天的剂量每天1次或更典型地为隔日给药，共注入15-20次，获得了97％长期治愈率。上述治疗的疗程很长，往往伴随着较高的医疗负担和大量的花费。结果，由于经常伴随不利事件的发生，常常导致患者不配合治疗或放弃治疗。
脂质的两性霉素B复合物在基于组织的巨噬细胞中蓄积。它们对于对抗大量在人巨噬细胞中生长的酵母和真菌是非常有效的。据显示，两性霉素B的脂质制剂对内脏利什曼病具有较高水平的效力，当给药5-10天时，其治愈率大于90％。Sundar等已经表明，短程治疗，即用脂质体两性霉素B(AmBisome；Gilead Sciences)按照1.5mg/kg/天的剂量每天1次给药5天，可以治愈93％的患者。在另一个重复的实验中，个体输注总剂量5mg/kg的脂质体两性霉素B治愈了91％的患者。而它只有很少的不良反应。(Sundar，S et al.Treatment of Indian visceral leishmaniasis with singleor daily infusion of low dose liposomal amphotericin Ba randomised trial.Brit.Med.J.2001，323419-422.Sundar，S.等.Single-dose liposomal amphoteri cin B inthe treatment of visceral leishmaniasis in Indiaamulticenter study.Clin.Inf.Dis.200337；800-804)。因此在印度，人们认为单剂量脂质体两性霉素B疗法对于治疗内脏利什曼病是安全和有效的。然而，即使是单剂量，该疗法也是很昂贵的，而且其在实践中的一个缺点是，脂质的两性霉素B在长期的贮存中是不稳定的，特别是在热带的高温下，而许多的内脏利什曼病都发生在热带。
在利什曼病中促进痊愈和清除寄生虫的免疫应答是由干扰素γ介导的Th-1应答控制的。虽然巨噬细胞可以有效地吸收利什曼原虫，但它们不会被生物的吸收激活；因此并没有释放出促炎趋化因子、促炎细胞因子和干扰素γ。与巨噬细胞相反，树突细胞可以吸收利什曼寄生虫并使其发育成熟，然后促进细胞免疫应答的发展。在动物模型中已经显示，如果可以激活受感染的巨噬细胞，那么接着就可以杀灭寄生虫。因此，两个不同的过程，即抗原加工和细胞成熟/激活必须联合用于有效的细胞疫苗应答中。如微生物所表明的那样，具有抗原性组分和树突细胞激活/成熟组分的物质可以促进树突细胞发生Th1介导的应答。而脂质的两性霉素B制剂不具有免疫调节或佐剂的活性。
如实施例中具体所述制备根据本发明的两性霉素B和聚(甲基丙烯酸，钠盐)(PMAA-Na)的复合物并进行试验。该复合物显示出具有如下独特的性质a)在静脉注射给药后，它能把两性霉素B递送到有效器官—肝、脾和淋巴结。这些是动物和人被利什曼原虫感染的主要器官。
b)当静脉注射给药时，它能有效地用细胞内递送把两性霉素B递送至利什曼原虫感染的巨噬细胞。
c)两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)复合物在细胞内利什曼原虫无鞭毛体存活、繁殖和存留的胞内细胞器中蓄积，可以增强利什曼原虫无鞭毛体的细胞内杀灭。
d)内脏利什曼原虫动物模型的体内研究表明，临床级两性霉素B、市售的脂质体两性霉素B制剂AmBisome、及两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)制剂彼此之间的抗利什曼病活性并没有显著的不同。在内脏利什曼病的动物模型中，两性霉素B-聚(甲基丙烯酸，钠盐)和市售的脂质体两性霉素B制剂AmBisome都是同样有效的。
e)在组织巨噬细胞中，聚(甲基丙烯酸，钠盐)从两性霉素B中释放出来，然后它可以促进P-趋化因子和干扰素γ释放。这会产生局部的Th1辅助性应答。
f)趋化因子和细胞因子表达的局部诱导作用可以促进遗传免疫系统细胞的复原和激活到其位置。其包含未成熟的树突细胞和CD+4T淋巴细胞。上述淋巴细胞刺激巨噬细胞，产生更多的TNF-α、IL-10和IL-6。
g)遗传免疫系统的激活可以诱导树突细胞成熟并从组织转移到包含新释放抗原的局部淋巴结中。这会诱导并产生CD+4T细胞应答和效应子CD8+T细胞应答。
h)因此，在抗原呈递细胞内杀灭利什曼原虫和Th1促进佐剂直接邻近的利什曼原虫抗原的继发有效性，能够将受感染的巨噬细胞转变为细胞疫苗。
i)由于抗原呈递细胞近似封闭，两性霉素B的杀灭活性会导致利什曼原虫抗原的释放，并同时对适宜的和局部的Th1趋化因子/细胞因子环境有促进作用，因此细胞免疫应答得到显著的增强。
j)同时治愈疾病和产生治疗性效应子细胞免疫应答，即对于受感染个体中的生物，接种产生了长期保护性免疫。
k)因此可以同时完成疾病的治愈和治疗性接种，而不需要其他的佐剂或其他来源的利什曼原虫抗原。
l)单剂量治疗是有效的，而不像两性霉素B，后者一般需要15-20剂量。
m)与市售的脂质体两性霉素B制剂相比，该制剂更为稳定，特别是在热带环境温度较高的情况下。
n)当使用该制剂时，人静脉给药常见的游离两性霉素B毒性减少到了最小。
o)两性霉素B和PMAA-Na形成复合物，可以避免药物的化学衍生作用。因此，两性霉素B对于利什曼原虫sp.的效能并没有改变或减弱。特别是对于两性霉素B糖基部分的氨基，因为该基团在诱导药物的药理活性方面是很重要的。由于具有反应性，其糖基部分的氨基可以作为一个共轭点(Conover C.D.et al.Utility of poly(ethyleneglycol)conjugation to create prodrugs of amphotericin B.Bioconjugate Chem.2003；14661-666)。
如上所述，本发明提供一种药物制剂，包含本发明的复合物，或与药学上适宜的载体混合或结合的包括衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物。
本发明的药物制剂的给药形式可以是适于静脉、动脉、进入淋巴循环、进入淋巴结、口服、腹膜、局部、向颊、直肠、皮肤表面、经皮、皮下、肌内、进入关节空腔、鼻内、玻璃体内、或肺、直接到器官、器官周围、注射到器官、或直接注入到器官给药。本发明包括将根据本发明聚合物的复合物以任何的途径给药。本发明的药物制剂可以是贮库型或储库型(depot or reservoir)制剂，或是一种气雾剂的形式。如上述或其他给药途径的适宜制剂是众所周知的，参见例如E.W.Martin著的Remington′s Pharmaceutical Sciences，也可参见Wang，Y.J.and Hanson，M.A.，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Supp.422S，1988。
本发明的复合物或包含衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物可以是“结合微粒”。这些微粒可以用本领域已知的乳化、匀化和喷雾干燥的方法制备出来。对于这些制剂的讨论，可参见例如Hanes J，Cleland JL&Langer R，AdancedDrug Delivery Reviews 28(1997)97-119。包含本发明的结合微粒复合物的药物组合物可以通过鼻或肺途径粘膜给药、吸入给药、非粘膜胃肠外途径给药，特别是皮下或肌内给药。
在液体形式的本发明的药物制剂中，聚合物的浓度可以是例如0.1-2,500μg/ml，例如1至500μg/ml。其他制剂可以包含类似量的聚合物，例如以液体制剂为基础来计算。
本发明涉及包括衍生自丙烯酸或其盐单元的窄分子量分布的聚合物，涉及包含上述聚合物和抗原或免疫原或具有抗病原生物或癌的药理活性的物质的复合物。该聚合物可以是包含衍生自丙烯酸或其盐单元的同聚物或共聚物，例如包含衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸的同聚物或共聚物。一些包含衍生自丙烯酸的单元的聚合物是已知的。如上所述，该聚合物一般应具有窄分子量分布。其多分散性为例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地说，多分散性越小越好。因此，通常优选多分散性小于1.2。因此，通常优选多分散性小于1.2。
聚合物通常具有一定的分子量，使得其在血液中时，在通过肾期间或之后聚合物基本都保留在循环血液中，没有或只有少量聚合物经过肾小球器官的过滤。肾过滤(也称为肾小球过滤)大分子是其一项功能，尤其是根据分子的大小和形状进行过滤，而部分也根据分子量过滤。一般地，对于任意特定的聚合物，存在阈分子量或窄范围的分子量，低于该分子量则发生肾过滤，高于该分子量则不发生或很少发生肾过滤。任意特定聚合物的阈分子量可以通过标准试验，例如用放射标记聚合物来确定。
作为一般性的指导，该聚合物的分子量一般为例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。该聚合物的分子量一般为例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。该聚合物可具有上面给出的较大分子量和较小分子量的组合范围内的分子量。例如，该范围包括但不限于80,000-4,000、75,000-5,000、65,000-10,000、55,000-10,000、及45,000-10,000。进一步的实例包括50,000-4,000的范围，例如40,000-25,000。一般优选分子量范围为45,000-10,000。
一般通常需要该聚合物或复合物在循环血中保留比较适当的时间。如本领域技术人员所知道的那样，该适当的时间取决于很多因素，在复合物的情况下，包括结合到聚合物上的物质的性质。例如，聚合物或复合物可以在循环中保留几个小时，例如高达24小时，例如约4-6小时乃至约24小时。
包括衍生自丙烯酸或其盐单元的聚合物可以是包含单元(I)的聚合物 其中R选自氢和C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基、或任一在碳主链上由杂原子取代或连接有杂原子的C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰