专利名称：氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的制备方法及应用的制作方法微生物种类繁多，包括原核微生物(如细菌)、真核微生物(如真菌、藻类和原虫)和无细胞生物(如病毒)三大类，它们个体微小，却与人类生活、生产、生存息息相关，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。其中，病原性微生物尤其是细菌的感染给养殖业和人类健康带来了极大的危害，造成了巨大的经济损失。因此，有关抗菌方面的研究和实际应用历来受到广泛关注。传统意义上的抗菌试剂包括抗生素和化学消毒剂(如游离氯，氯胺，臭氧等)。抗生素自问世以来就以其高效快速的杀菌效果在医药卫生行业得到大量应用，在保护人类健康方面发挥了极其重要的作用。然而由于抗生素的滥用，细菌抗药性问题变得日趋严重和突出，如研究发现对青霉素G耐药的金黄色葡萄球菌高达85%以上。化学消毒剂可实现大批量生产，但其毒性问题限制了其在临床中的应用。基于以上问题，研究出一种新型安全高效的抗菌材料具有极其重要的实际意义和应用价值。近年来，纳米科学技术的飞速发展对各个领域都产生了深远影响，纳米材料凭借其独特的性质在诸多领域如工业、生物医学领域等显示出极大的应用前景。研究发现一些纳米材料具有良好的抗菌活性且不易产生耐药性，如金纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、铜及其氧化物纳米颗粒等。其中，银自古以来就被公认为具有抗菌性能，银纳米颗粒则显示出更加理想的抗菌活性，同时具有良好的生物安全性，因此银纳米颗粒在食品包装、水质净化和医疗卫生系统等领域具有广阔的应用前景。此外，研究发现以单/多壁碳纳米管、活性炭、石墨烯等纳 米材料作为基底和支持物来生长其他纳米颗粒，不仅可以解决纳米颗粒的溶解性和稳定性问题，还可以使得两者的机能协同作用，这样得到的纳米复合物在许多方面被大量研究应用。目前，相对于其他纳米抗菌材料，氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物(GO-Ag)由于其特殊性质和显著增强的抗菌活性被广泛研究。氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的制备原理是将银离子还原成为银纳米颗粒，从而生长在氧化石墨烯基底上，具体方法包括一步还原法，苯-水两步反应法和银镜反应法等，所涉及的还原剂包括甲醛，氢氧化钾，PVP，对苯二酚，硼氢酸钠等。鉴于已有制备方法大多使用的还原剂为化学有机试剂，毒性较大，危害人类健康和生态环境，本发明旨在提供一种氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的新型制备方法。
为克服现有技术中的不足，本发明提供氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的制备方法及应用，是一种高效安全的抗菌材料。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的制备方法，包括以下步骤: 步骤I)用改进的Hummers方法制备氧化石墨烯水溶液: 将Ig膨胀石墨和约30倍重量的氯化钠固体研磨至无明显可见颗粒状物，加水抽滤，洗去氯化钠，将研细的石墨烘干备用； 在烧瓶中加入约30mL浓度为98.3%的浓硫酸，放入已烘干的研细石墨，室温下搅拌8小时，然后将混合物置于冰浴中，加入约3g高锰酸钾，缓慢升温至115°C，缓慢加入约150mL水，之后加入约10mL30%过氧化氢并搅拌，离心除去上层水溶液，反复水洗至溶液不再出现沉淀为止； 将5mL浓度为3mg/mL的氧化石墨烯悬池液超声30min得到澄清的氧化石墨烯水溶胶，然后按终浓度0.12 g/mL加入NaOH固体并在50°C水浴中搅拌4小时，之后加入浓盐酸调整溶液PH值接近I，不再加氢氧根离子，用蒸馏水反复进行冲洗和离心纯化，得到水溶性良好的未碱化的氧化石墨烯水溶液； 步骤2)在所述氧化石墨烯溶液中加入硝酸银固体粉末，煮沸；
步骤3)加入柠檬酸三钠作为还原剂和稳定剂，接着再100°C煮沸lh，超滤管洗脱三次，去除未结合的银颗粒及其他中间产物，即可得到氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物。进一步的，所述氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物在抗菌方面的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1、本发明的方法反应简单，条件温和，制备快速；· 2、本发明中所使用的还原剂属于绿色环保型，毒性低，无污染；
3、本发明生成的氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物稳定性高，水溶性好，安全性强，并且无需后续表面功能化修饰，即产即用；
4、氧化石墨烯/银颗粒复合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌都具有显著的抗菌活性，对大肠杆菌的抗菌作用较强于金黄色葡萄球菌。


图1为银颗粒与氧化石墨烯摩尔比值为0.65的GO-Ag纳米复合物的透射电镜图(TEM)；
图2为银颗粒与氧化石墨烯摩尔比值为I的GO-Ag纳米复合物的透射电镜图(TEM)； 图3为银颗粒与氧化石墨烯摩尔比值为2的GO-Ag纳米复合物的透射电镜图(TEM)； 图4为三种不同比值的GO-Ag对大肠杆菌生长活性的影响；
图5为三种不同比值的GO-Ag对金黄色葡萄球菌生长活性的影响；
图6为不同浓度GO-Ag下大肠杆菌菌落数的变化；
图7为不同浓度的GO-Ag下金黄色葡萄球菌菌落数的变化；
图8为GO-Ag纳米复合物在终浓度为2.5，5，10ug/ml时对Hela细胞生长活性的影响。

制备抗菌材料氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物(GO-Ag)。
用Ig膨胀石墨做最初始的原料，加入约30倍重量的氯化钠固体研磨至无明显可见颗粒状物，加水抽滤，洗去氯化钠，将研细的石墨烘干备用。在烧瓶中加入约30mL浓硫酸(98.3%)，放入已烘干的研细石墨，室温下搅拌8小时，然后将混合物置于冰浴中，加入约3g高锰酸钾，缓慢升温至115°C，缓慢加入约150mL水，之后加入约10mL30%过氧化氢并搅拌，离心除去上层水溶液,反复水洗至溶液不再出现沉淀为止。将5mL浓度为3mg/mL的氧化石墨烯悬浊液超声30min得到澄清的氧化石墨烯水溶胶，然后按终浓度0.12 g/mL加入NaOH固体并在50°C水浴中搅拌4小时，之后加入浓盐酸调整溶液pH值接近I，不再加氢氧根离子，用蒸馏水反复进行冲洗和离心纯化，得到水溶性良好的未碱化的氧化石墨烯水溶液。加入硝酸银固体粉末(分别18mg, 36mg, 54mg)至氧化石墨烯水溶液(浓度为0.5mg/ml)中，添加超纯水至总体积为100ml,混勻煮沸，再加入朽1檬酸三钠固体(分别20mg, 40mg,60mg)作为还原剂和稳定剂，100°C煮沸lh，然后通过IOkDa的超滤柱水洗脱三次，去除未结合的银颗粒及其他中间产物，即可得到氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物。通过络合滴定法计算出三种不同硝酸银投料所得的复合物中银颗粒与氧化石墨烯的摩尔比值分别为0.65，1，2。对上述氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物进行透射电镜分析，从图1、图2、图3可知:结合在氧化石墨烯片层上的银纳米颗粒为球形，不同比值情况下结合的银颗粒数量不同，但尺寸均介于IOnnTlOOnm左右。实施例2
研究实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物(GO-Ag)对细菌生长活性的影响。将实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物与细菌悬浊液混合培养，2.5h后通过MTT法测定细菌活性。具体方法为:将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别培养于LB液体培养基，在恒温摇窗中培养至指数生长期(0D_为0.5左右)时取200 μ I重新接种于2ml新培养基，加入不同体积的GO-Ag纳米复合物，使得三种不同比值的复合物终浓度分别为
2.5,5,10 μ g/ml，放入恒温摇床中继续培养2.5h，取该悬浊液以每孔100 μ I加入96孔板，再加入20μ1 ΜΤΤ，将96孔板置于37°C恒温培养箱中4h，吸除上清，再加入150μ I 二甲基亚砜充分溶解结晶，酶标仪在在570nm波长处测其光吸收值。参见图4、图5所示:细菌的生长活性呈现出浓度依赖性，材料浓度越高，细菌活性越低；比较三种不同比值的复合物，比值为I的复合物表现出最强的抗菌性能，当其浓度为10 μ g/ml时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性百分数只有20%和30%左右，比值为2的复合物抗菌性能居中而比值为0.65的复合物几乎不具备显著抗菌性能。因此，上述比值为I的氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物可用作高效的抗菌材料。实施例3
研究实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物(GO-Ag)对细菌数目的影响。将实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物与细菌悬浊液混合培养，2.5h后均匀涂于固体LB琼脂平板上，通过统计所得菌落数目(CFU)分析材料的抗菌活性。具体方法为:将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别培养于LB液体培养基,在恒温摇窗中培养至指数生长期(OD6tltl为0.5左右)时取200 μ I重新接种于2ml新培养基，加入比值为I的GO-Ag纳米复合物，使其终浓度分别为2.5,5,10 μ g/ml，放入恒温摇床中继续培养2.5h，梯度浓度稀释之后均匀涂于固 体LB琼脂平板上，置于37°C恒温培养箱培养14h，然后记录各个平板表面的菌落数目，统计作图分析。
结果如图6、图7所示:与实验组相比，材料处理过的平板长出的菌落数明显减少，说明该复合物能显著抑制细菌的生长。再比较大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，发现当复合物浓度为10 μ g/ml时，大肠杆菌几乎全部死亡，平板上并未有明显菌落形成，而金黄色葡萄球菌则有少量但明显可见的菌落形成，表明该氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制效果优于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。实施例4
研究实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物对细胞活性的影响。将实施例1所得氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物与Hela细胞混合培养，24h后通过MTT法检测细胞活性。具体方法为:在96孔板中每孔加入100微升的细胞培养液(3*104个/毫升)，培养12小时。再加入25微升不同浓度的三种氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物，培养24小时。然后根据MTT法检测细胞活性。参见图8所示:相对于比值为0.65的复合物对细胞活性无任何影响，比值为I和2的该复合物对细胞有一定影响，当材料浓度为10ug/ml时，仍然有60%左右的细胞保持其生长活性，与其高效的抗菌效果比较，可以认为该复合物对细胞活性基本无显著影响，说明上述方法制备的氧化 石墨烯/银颗粒纳米复合物生物安全性较高。


本发明提供一种氧化石墨烯/银颗粒纳米复合物的制备方法及应用，用改进的Hummers方法制备氧化石墨烯水溶液，加入硝酸银固体粉末煮沸，再加入柠檬酸三钠作为还原剂和稳定剂，继续煮沸1h，超滤管洗脱三次。与现有技术相比，本发明提供的制备方法简单快速，所制备的纳米复合物结构稳定，水溶性好，具有良好的抗菌活性，可用做高效安全的抗菌材料。