一种纳米金复合物及其制备和应用的制作方法[0002]纳米金复合物是一种常用的生物纳米材料，它由功能分子通过一定的方式联接在纳米金颗粒上，在生物诊断等方面有广泛的应用。[0003]DNA-纳米金复合物是一种常见的纳米金复合物形式。通常，这种DNA-纳米金复合物是由巯基修饰的DNA通过金硫键在金表面自组装作用得到的。应用这种方法制备DNA-纳米金复合物，需要将DNA进行化学修饰，操作过程十分复杂，而且成本很高，操作过程中还可能形成不需要的双硫键，或存在样品污染等问题。该方法常见的缺点是未完全功能化的纳米金颗粒纳米金由于表面非特异性吸附，DNA吸附在纳米金表面呈现倒伏状态；此外，这种方法虽然携带的DNA密度很高，但是在高度功能化的纳米金颗粒上，DNA的高密度使得目标检测分子不易接近，影响检测效率。[0004]使用竞争性的小分子，如巯基己醇(MCH)，可以通过取代掉吸附在金表面的DNA并迫使DNA序列保持直立状态来提高杂交效率，但是该方法中使用的竞争性小分子数量和反应的控制非常复杂，并且竞争性小分子的引入会降低纳米金颗粒的稳定性。[0005]因此，本领域迫切需要开发一种新型的制备纳米金复合物的方法，能通过一种简单有效的方法将功能分子连接到纳米金颗粒上，并能有效调控纳米金粒子表面固定的功能分子的密度、方向以及构型，从而提高纳米金纳米金复合物的检测效率。
[0006]本发明的目的就是提供一种新的纳米金-复合物及其制备和应用。[0007]在本发明的第一方面，提供了一种纳米金复合物，所述复合物包括纳米金颗粒和功能分子，并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面。
[0008]在另一优选例中，所述的功能分子具有式1-式III任一所示结构:
[0009]B-L-RI ；
[0010]R-L-B-L-R11 ；
[0011 ] (B-L-R-L-B)m III ；
[0012] 式中，
[0013]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区；
[0014]R表示功能区；
[0015]L表示位于B和R之间的任选的过渡区；
[0016]m为选自1-20的整数。
[0017]在另一优选例中，所述的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
[0018](i)结合区的长度为5-100个碱基，较佳地5-40个碱基，更佳地10_30个碱基；
[0019](ii)结合区含有一个或多个poly (A)η区段，其中η为选自1_100的整数，较佳地η为选自2-30的整数，更佳地η为选自3_20的整数；
[0020](iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或为100% ；
[0021](iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
(0%。
[0022]在另一优选例中，poly (A)η区段的个数为1_3个。
[0023]在另一优选例中，所述的结合区包括DNA、RNA、和/或PNA构成的单链。
[0024]在另一优选 例中，所述的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。
[0025]在另一优选例中，所述的过渡区是长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的
寡核苷酸。
[0026]在另一优选例中，所述的碱基为T或U，较佳地为Τ。
[0027]在另一优选例中，所述的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
[0028]在另一优选例中，所述的小分子为胆固醇。
[0029]在另一优选例中，所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。
[0030]在另一优选例中，所述的荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
[0031]在另一优选例中，所述的纳米金颗粒具有选自下组的一个或多个特征:
[0032](I)纳米金颗粒的平均粒径为l-150nm，较佳地为5-lOOnm，更佳地5_20nm ；
[0033](2)在纳米金颗粒中，80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在l_150nm范围内，较佳地在5-100nm范围内。
[0034]在另一优选例中，所述纳米金颗粒的表面上功能分子的结合密度为IX IO5—5 X IO13 个 /cm2,较佳地为 I X IO7-2 X IO13 个 /cm2,更佳佳地为 I X IO9-2 X IO13 个 /cm2,更佳地为 I X IO11-2 X IO13 个 /cm2，最佳地为 I X IO12— 2 X IO13 个 /cm2。
[0035]在本发明的第二方面，提供了一种功能分子，所述的功能分子可通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面，并且所述的功能分子具有式1-式III任一所示结构:
[0036]B-L-RI ；
[0037]R-L-B-L-R 11 ；
[0038](B-L-R-L-B)m III ；
[0039]式中，
[0040]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区；
[0041]R表示功能区；
[0042]L表示位于B和R之间的任选的过渡区；[0043]m为选自1-20的整数。
[0044]在另一优选例中，所述功能分子的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
[0045](i)结合区的长度为5-100个碱基，较佳地5-40个碱基，更佳地10_30个碱基；
[0046](ii)结合区含有一个或多个poly (A)η区段，其中η为选自1_100的整数，较佳地η为选自2-30的整数，更佳地η为选自3_20的整数；
[0047](iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或为100% ；
[0048](iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
≤0%。
[0049]在另一优选例中，poly (A)η区段的个数为1-3个。
[0050]在另一优选例中，所述的结合区包括DNA、RNA、和/或PNA构成的单链。
[0051]在另一优选例中，所述功能分子的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。
[0052]在另一优选例中，所述的过渡区是长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的
寡核苷酸。
[0053]在另一优选例中，所述的碱基为T或U，较佳地为Τ。
[0054]在另一优选例中，所述功能分子的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
[0055]在另一优选例中，所述的小分子为胆固醇。
[0056]在另一优选例中，所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。
[0057]在另一优选例中，所述的荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
[0058]在本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有药学上可接受的载体或检测学上可接受的载体，以及本发明第一方面所述的纳米金复合物。
[0059]在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的纳米金复合物的制备方法，包括步骤:将功能分子与纳米金颗粒接触，使得功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面，从而形成纳米金复合物。
[0060]在另一优选例中，所述方法包括步骤:
[0061](a)将功能分子与纳米金颗粒混合，获得功能分子与纳米金颗粒的混合溶液；
[0062](b)向步骤(a)的混合溶液中加入老化剂，促进富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面的连接，获得含有第一方面所述的纳米金复合物的溶液体系；和
[0063](C)从步骤(b)的溶液中分离所述的纳米金复合物。
[0064]在另一优选例中，所述方法还包括步骤(d):对纳米金复合物进行洗涤和/或性能验证。
[0065]在另一优选例中，(b)中所述的老化剂选自下组:氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液、或其组合。[0066]在本发明的第五方面，提供了第一方面所述的纳米金复合物的用途，它被用于制备检测试剂或用于制备调控基因表达或调节蛋白活性的药物组合物。
[0067]在本发明的第六方面，提供了一种检测产品，所述的产品含有第一方面所述的纳米金复合物，所述复合物作为检测剂。
[0068]在另一优选例中，所述的检测产品包括测试片、测试条、侧流片等。
[0069]在本发明的第七方面，提供了一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括第一方面所述的纳米金复合物或第六方面所述的检测产品。 [0070]在本发明的第八方面，提供了一种检测方法，包括步骤:将第一方面所述的纳米金复合物用作检测剂，进行检测。
[0071]在另一优选例中，在检测时观察/检测所述检测剂与待测物形成的复合物。
[0072]在另一优选例中，在检测时观察/检测因所述检测剂与待测物的相互作用所导致的变化，所述变化包括:颜色变化或荧光变化。
[0073]在另一优选例中，在本发明第一方面所述的纳米金复合物中，功能分子的功能区为核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、凝集素、胆固醇。
[0074]在另一优选例中，所述方法用于检测核酸、小分子(如ATP)、金属离子(如铅、汞、铜、银等)、蛋白、多肽、多糖等。
[0075]在另一优选例中，纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸，用于检测序列与功能区核酸互补的目标多核苷酸。
[0076]在另一优选例中，2种或2种以上的纳米金复合物同时与目标多核苷酸结合。
[0077]在另一优选例中，所述的目标多核苷酸为DNA或RNA。
[0078]在另一优选例中，纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸适配体，用于检测核酸适配体的底物。
[0079]在另一优选例中，所述的核酸适配体还包括核酸适配体的活性片段或其互补序列。
[0080]在另一优选例中，纳米金复合物的功能分子的功能区为核酶，用于检测金属离子。
[0081]在另一优选例中，所述的核酶为DNAzyme或RNAzyme。
[0082]在另一优选例中，所述的核酶还包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互补序列。
[0083]在另一优选例中，纳米金复合物的功能分子的功能区为抗体，用于检测抗原。
[0084]在本方面的第九方面，提供了一种检测溶液中待测物的方法，包括步骤:将第一方面所述的纳米金复合物加入所述的溶液，使得所述纳米金复合物上的功能分子与待测物结合或作用，并检测溶液的变化。
[0085]在另一优选例中，所述的溶液的变化为颜色变化或荧光变化。
[0086]在另一优选例中，所述的待测物质选自下组:核酸、多肽、ATP，金属离子(如铅、汞、铜、银等)。
[0087]在本方面的第十方面，提供了一种体外非治疗性的基因调控方法，包括步骤:在培养体系中加入第一方面所述的纳米金复合物，并且所述的功能分子具有调控目标基因表达的核苷酸序列。
[0088]在另一优选例中，所述的调控目标基因表达的核苷酸序列为MiCT0RNA、干扰RNA、反义RNA等。[0089]在另一优选例中，所述的功能分子还可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0090]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0091]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0092]图1显示了本发明一种优选的纳米金复合物的示意图；结合于纳米金表面的功能分子包括三部分:结合区、过渡区和功能区；结合区利用腺嘌呤与金之间的亲和作用力固定到纳米金表面，并且能通过改变结合区调控探针之间的距离；过渡区位于结合区和功能区之间，起连接过渡作用；功能区为实现具体功能所需的功能分子。
[0093]图2显示不同体系的DNA-纳米金在不同离子强度下的电解质溶液中的稳定性，图2a右侧为该体系在不同离子强度的电解质溶液中所呈现的颜色，红色说明该纳米金在溶液中分散良好，紫色或蓝色说明纳米金发生聚合，结果显示该体系的耐盐度很低，在NaCl浓度仅为50mM时溶液颜色即变紫，离子强度更高时颜色即变为蓝色，该体系在高离子强度的电解质溶液中稳定性较差。图2b显示在含多聚腺嘌呤核苷酸结合区的DNA与金纳米粒子的体系中，PolyA能够将寡聚核苷酸结合在纳米金上，寡聚核苷酸表面的负电荷使纳米金在高离子强度的电解质溶液中仍然能够良好地分散，在离子浓度高达0.3M的NaCl电解质溶液中仍十分稳定。图2c显示巯基修饰的寡聚核苷酸与金纳米粒子结合的体系中在高离子强度的电解质溶液中也有很好的稳定性。
[0094]图3显示三种纳米金寡聚核苷酸-纳米金样品溶液的紫外可见吸收光谱图；图3a显示DNA中不含多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区polyA与金纳米粒子的体系在不同NaCl浓度下的紫外可见吸收光谱，说明该体系在无盐时分散性良好，在体系中含有300mMNaCl时纳米金即发生聚合；图3b和图3c分别显示含有多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区的DNApolyA与金纳米粒子的体系和巯基修饰的寡聚核苷酸与金纳米粒子结合的体系在无盐和300mM NaCl时体系的紫外可见吸收光谱图。
[0095]图4显示含有多聚腺嘌呤核苷酸结合区的DNA-纳米金复合体系对其互补富T链的杂交解析作用具有良好的抵抗力；所使用的含有多聚腺苷寡聚核苷酸一端标记有荧光基团FAM，另一端为包含不同数目的腺嘌呤碱基的polyA，分别含有10个腺嘌呤核苷酸(polyAlO,图4a)，15个腺嘌呤核苷酸(polyA15,图4b)，20个腺嘌呤核苷酸(polyA20,图4c) ,30个腺嘌呤核苷酸(polyA30,图4d);各图中blank线为不经处理的寡聚核苷酸-纳米金体系的荧光光谱图，各图中(polyTIO或polyT15或polyT20或polyT30)线为用同样长度的多聚胸腺嘧啶核苷酸与纳米金复合体系杂交处理后体系的荧光光谱图，各图中MCH线表示用巯基己醇(MCH)取代处理后的纳米金复合体系的荧光光谱图。
[0096]图5显示通过改变polyA结合区的长度可以调控纳米金上DNA的组装密度；图5a为随着寡聚核苷酸中PolyA结合区长度的增加，金纳米粒子表面所结合的DNA的密度逐渐降低的理论示意图；图5b为通过荧光光谱的检测和计算得到含有不同长度polyA(从左到右依次含有polyA5、polyA10、polyA15、polyA20、polyA30)的DNA在纳米金上的组装密度，纵坐标为纳米金粒子上连接的寡聚核苷酸的密度，结果显示随着polyA长度的增加，纳米金粒子上组装的寡聚核苷酸密度逐渐降低，与理论示意图5a—致；图5c显示为通过计算得到的纳米金粒子表面所吸附的脱氧腺嘌呤核苷酸的密度。
[0097]图6显示为含有不同长度polyA结合区的DNA-纳米金复合物纳米金流体动力学直径的动态光散射检测图。图中，从上到下依次为含有polyA5、pOlyA10、pOlyA15、pOlyA20、polyA30的复合体系的流体动力学直径。
[0098]图7显示含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的功能区部分采取了一种延伸且直立的构型；图中由上到下分别为巯基修饰的寡聚核苷酸-纳米金复合物、含有Po I yA结合区的DNA-纳米金复合物的流体动力学直径的动态光散射检测结果。
[0099]图8显示通过polyA结合区组装的DNA-纳米金复合物的热动力学性质；图8a为通过polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金与完全互补的目标杂交物的的热解曲线，显示温度转折点在70°C左右；图8b为通过polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金复合结构在一系列温度循环中的循环等离子振动变化；当温度有序地在熔链点(约70°C )上(80°C )下(60°C )循环时，颜色会重复地在红色(说明颗粒是分散的)和蓝色(说明颗粒是聚集的)之间可逆变化。[0100]图9显示基于POlyA组装的寡聚核苷酸_纳米金体系具有非常快的杂交动力学，图9a显示将两种通过polyA组装的DNA-纳米金纳米金复合物与互补DNA链混合后Omin (a曲线)，Imin (b曲线)，IOmin (c曲线)，20min (d曲线)9,40min (e曲线)反应过程的紫外可见吸收光谱图；图9b显示将两种通过巯基组装的DNA-纳米金与互补DNA链混合后Omin (a曲线)，Imin (b曲线)，IOmin (c曲线)，20min(d曲线)，40min(e曲线)时体系的紫外可见吸收光谱图。上述结果显示基于polyA组装的体系紫外可见吸收峰在40min内红移了 80nm,而巯基组装的体系在40min内仅移动了 13nm，表明基于polyA组装的体系由于杂交作用，纳米金较快发生了较大程度的聚集，基于PolyA组装的寡聚核苷酸-纳米金体系比基于巯基的体系杂交动力学更快。
[0101]图10显示基于polyA结合和基于巯基组装的寡聚核苷酸-纳米金体系纳米金的杂交动力学对比；图1Oa显示通过计算两种体系的与反应时间和聚合反应几何学有关的特征时间τ和与聚合生长的物理过程有关的Avrami指数η比较两种体系的反应动力学；图1Ob显示为两种纳米结合体系在IOmin内检测不同浓度(0.5，1，2，4，6，8，IOnM)物的目标DNA的Α650/Α520快速(IOmin内)比值色检测的剂量反应曲线和相对应的体系颜色变化。
[0102]图11显示基于含有polyA结合区的DNA-纳米金复合探针可以通过荧光检测，实现对目标DNA的定量分析。
[0103]图12显示含有polyA结合区的DNA-纳米金复合探针可以实现对目标DNA的定量分析；图中的待测DNA浓度分别为0.5nM, InM, 2ηΜ, 4ηΜ, 6ηΜ, 8ηΜ, ΙΟηΜ。Α650/Α520为各待测DNA浓度下紫外可见吸收光谱图中650nm和520nm处吸光度信号强度的比值。
[0104]图13显示含有polyA结合区的核酸适配体-纳米金复合探针可以实现对ATP分子的定量分析；图中目标ATP的浓度依次分别为0.1mM, 0.5mM, 1.5mM, ImM, 2mM ；A520为各待测ATP浓度下紫外可见吸收光谱图中520nm处吸光度信号强度。
[0105]图14显示含有polyA结合区的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可以实现对铅离子的定量分析；图中显示铅离子浓度与紫外光谱信号的对应关系图。其中铅离子浓度依次分别为2μΜ，4μΜ，6μΜ，8μΜ，10μΜ。Α520为各待测铅离子浓度下紫外可见吸收光谱图中520nm处吸光度信号强度。
[0106]图15是显示含有polyA结合区的抗体-纳米金复合探针可以实现对蛋白质TNF-a的定量分析；图中显示蛋白质TNF-a浓度与紫外光谱信号的对应关系图。其中，图中的TNF_a 浓度依次分别为 Ing/mL, 2ng/mL, 4ng/mL, 6ng/mL。A650/A520 为各待测 TNF_a 浓度下紫外可见吸收光谱图中650nm和520nm处吸光度信号强度的比值。
[0107]图16显示通过poly A结合于金表面的siRNA-纳米金复合物对对细胞内目标基因表达抑制效果图。

[0108]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，功能分子可以通过富含腺嘌呤核苷酸(A)或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面结合，从而形成纳米金复合物；所述功能分子包括富含A的寡核苷酸结合区、功能区和位于结合区和功能区之间过渡区。本发明的纳米金复合物可实现纳米金表面上功能分子密度的自我调控；在纳米尺度上可以精确控制功能分子之间的距离，充分保证功能区的识别活性，促进功能区对目标分子的检测能力。在此基础上完成了本发明。
[0109]术语
[0110]纳米金
[0111]如本文所用，术语“纳米金”或“纳米金颗粒”可以互换使用，都是指一种微小的，其平均粒径为l-150nm。纳米金颗粒具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物分子结合，且不影响其生物活性。
[0112]在本发明中，优选的纳米金颗粒为5-100nm,更佳地为5-20nm。在纳米金颗粒的群体中，80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在l_150nm范围内，优选在5-100nm范围内。
[0113]本领域的普通技术人员可以商业购买途径(如向Sigma-Aldrich公司购买)或常规方法制备获得。
[0114]功能分子
[0115]本申请提供了一种新的功能分子，该功能分子可通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面。
[0116]本发明的的功能分子具有式1-式III任一所示结构:
[0117]B-L-RI ；
[0118]R-L-B-L-R 11 ；
[0119](B-L-R-L-B)m III ；
[0120]式中，B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区；R表示功能区山表示位于B和R之间的任选的过渡区；m为选自1-20的整数。
[0121]在本发明中，富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:(i)结合区的长度为5-100个碱基，较佳地5-40个碱基，更佳地10-30个碱基；(ii)结合区含有一个或多个poly (A) η区段，其中η为选自1-100的整数，较佳地η为选自2-30的整数，更佳地η为选自3-20的整数；(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或为100% ； (iv)结合区中T碱基和U碱基的总量(20%，较佳地< 10%，更佳地< 5%，最佳地< 0%。本发明优选poly(A)n区段的个数为1_3个。更优选地，结合区包括DNA、RNAjP /或PNA构成的单链。
[0122]在本发明中，过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。过渡区优选为长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的寡核苷酸；所述的碱基为T或U，较佳地为T。
[0123]在本发明中，功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。所述的小分子也可以为胆固醇。所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
[0124]如本文所用，术语“核酸适配体”或“Apatmer ”可以互换使用，都是指一段DNA或RNA序列，该序列能够与多种目标物质高特异性高敏感性高选择性的结合，当核酸适配体与特定的目标物质发生结合时，核酸适配体自身的结构发生变化，这种变化可以进行检测。本领域的普通技术人员使用常规方法(如体外筛选技术等)可以对核酸适配体的序列进行选择；使用全人工化学方法制备所述的核酸适配体。此外，所述的核酸适配体还包括核酸适配体的活性片段或其互补序列。
[0125]如本文所用，术语“核酶”是指具有催化活性的核酸序列，其化学本质虽然是核酸，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是分子中的特定部位。核酶包括DNAzyme或RNAzyme等,所述的核酶还包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互补序列。一种优选的DNAzyme底物链(substrate strand)序列如下:
[0126]5，-ACTCATCTGTGAACTCACTAT @ GGAAGAGATGTGTCAACTCGTG-3，
[0127]其中，rA代表组成RNA的腺嘌呤核糖核苷酸，其他的都代表组成DNA的脱氧核糖核苷酸，形成了切割位点(cleavage site)。
[0128]纳米金复合物
[0129]如本文所用，术语“纳米金复合物”、“纳米金复合”、“纳米金-功能分子复合物”或“纳米金-功能分子复合体”可以互换使用，所述复合物或复合体包括纳米金颗粒和功能分子，并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面。
[0130]本发明纳米金复合物的表面上具有适宜的功能分子的结合密度，所述密度为I X IO5— 5 X IO13 个 /cm2，较佳地为 I X IO7— 2 X IO13 个 /cm2,更佳地为 I X IO9— 2 X IO13 个 /cm2，更佳地为 I X IO11— 2 X IO13 个/cm2，最佳地为 I X 1012—2 X IO13 个/cm2。
[0131]本发明纳米金复合物的纳米金颗粒的平均粒径为l_150nm,较佳地为5-100nm,更佳地5-20nm。在纳米金颗粒中，80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在l_150nm范围内，较佳地在5-100nm范围内。
[0132]本发明还提供了纳米金复合物的制备方法:将功能分子与纳米金颗粒接触，使得功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面，从而形成纳米金复合物。[0133]在本发明的一个优选例中，包括步骤:将功能分子与纳米金颗粒混合，获得功能分子与纳米金颗粒的混合溶液；加入老化剂，促进富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面的连接，获得含有纳米金复合物的溶液体系；从溶液中分离纳米金复合物。优选地，还包括步骤:对纳米金复合物进行洗涤和/或性能验证。本领域的普通技术人员可以选用常规的老化剂，如氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液等。
[0134]本发明还提供了纳米金复合物的应用方法，它被用于制备检测试剂或用于制备调控基因表达或调节蛋白活性的药物组合物。
[0135]本发明提供了一种检测产品，它含有本发明的纳米金复合物，将其作为检测剂；该检测产品抗原包括测试片、测试条、侧流片等。 [0136]本发明还提供了一种检测试剂盒，它包括本发明的纳米金复合物或上述的检测产
品O
[0137]可以将本发明所述的纳米金复合物用作检测剂，进行检测；在检测中，优选观察/检测所述检测剂与待测物形成的复合物或观察/检测因所述检测剂与待测物的相互作用所导致的变化；所述变化可以包括:颜色变化或荧光变化。
[0138]本发明还提供了一种应用纳米金复合物进行体外非治疗性的基因调控方法:在培养体系中加入纳米金复合物，所述的功能分子具有调控目标基因表达的核苷酸序列。调控目标基因表达的核苷酸序列为优选MicroRNA、干扰RNA、反义RNA。的功能分子还可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0139]如本文所用，术语“TAT”或“TAT多肽”可以互换使用，将TAT与目标分子连接，TAT多肽可以帮助目标分子进入细胞(核)。一种优选的TAT多肽序列如SEQ ID NO:24所示。
[0140]本发明的主要优点在于:
[0141]1.本发明的纳米金复合物可实现纳米金表面上连接上的功能分子密度的自我调控，通过控制功能分子之间的距离，充分保证功能区的识别活性，促进功能区对目标分子的检测能力；
[0142]2.本发明的纳米金复合物，其功能分子通过富A结合区结合于纳米金颗粒的表面，使得功能分子中的功能区采用更加延伸且直立的构型，促进功能区与目标分子的识别效率；
[0143]3.本发明的制备纳米金复合物的方法简单，成本低廉，无需任何化学修饰和人工合成的部分。
[0144]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0145]部分实验材料
[0146]所有使用纳米金粒子均购自Sigma-Aldrich公司，所有的寡聚核苷酸由TaKaRa公司(Dalian，China)合成并纯化。实验中所用仪器:紫外-可见分光光度计(U-3010紫外可见光谱，日立，日本东京)；荧光光谱仪(F-4500，日立，日本东京)；DelsaTM纳米亚微米粒度和Zeta电位粒度仪，贝克曼库尔特公司；真彩色数码相机(尼康)。
[0147]实验方法[0148]纳米金复合物的组装[0149]首先将金纳米颗粒与含富A寡聚核苷酸结合区的功能分子以一定的比例(功能分子:纳米金=200:1)混合，轻轻吹打使混匀，室温孵育16小时后，加入IM PBS(1M NaCl/0.1MPB，ρΗ7.0)使其终浓度为0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次间隔)，室温下放置16h，12000r，4°C，20min 离心，吸弃上清，加入等量的 0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, ρΗ7.0)洗离三次，杂交溶液(0.3MNaCl/10mM PB, pH7.0)悬浮，4°C冰箱长期保存。
[0150]纳米金复合物表面DNA密度的定量检测
[0151]向含有组装好的DNA-纳米金复合体的溶液中加入巯基己醇(MCH)(终浓度为20mM)，在室温下震荡并过夜培育，巯基己醇可以将寡聚核苷酸从纳米金表面上取代下来；将被取代下来的DNA探针通过离心法进行分离，上清液在荧光分光光度计(F-4500，日立公司，东京，日本)下进行荧光检测；将该荧光值与通过标准曲线法得到的荧光线性曲线对应，得到DNA的浓度从而计算得出DNA的物质量。荧光标准曲线是在相同pH的缓冲中，同样的离子强度和巯基乙醇浓度下用已知浓度的荧光标记的寡聚核苷酸检测荧光得到的。纳米金的浓度由紫外可见吸收光谱(U-3100紫外可见吸收光谱，日立公司，东京，日本)测得，即根据纳米金在520nm处的吸收强度，代入摩尔吸光系数计算求得纳米金的浓度从而计算得出纳米金的物质量。纳米金表面组装的DNA密度等于DNA的物质量除以纳米金物质的量。
[0152]纳米金表面组装的功能序列的杂交效率检测方法
[0153]向200 μ 1，IOnM合成好的含富A结合区的DNA-纳米金复合物中加入3 μ M与其功能区核酸序列互补的有荧光标记的DNA链，在杂交条件(0.3Μ PBS, ρΗ7)下反应24h。用磷酸盐缓冲清洗混合物两次，通过离心除去未杂交的DNA ;通过加入氢氧化钠(终浓度大于50mM,pHll-12)反应2h，使杂交结合的荧光标记的DNA与DNA-纳米金复合物解离。通过离心分离出解离的荧光标记的DNA，加入IM HCl将pH调回中性，用荧光光度计检测其荧光强度，通过与标准曲线对比得到杂交在多聚腺苷寡聚核苷酸-纳米金复合物上的DNA浓度。
[0154]动力学实验方法
[0155]在自组装动力学的研究中，向50 μ L含有8nM DNA-纳米金复合物(两种DNA-纳米金复合物探针1:1混合)的0.3Μ PBS杂交缓冲溶液中加入2μ L适当的IOy M的DNAlinker，两种DNA-纳米金复合物中的DNA功能区分别与DNAlinker中的不同区段的序列互补。每两分钟进行紫外-可见光谱检测。
[0156]熔链分析方法
[0157]通过使用温度控制仪(PolyScience)在25_80°C之间调控温度,用紫外可见分光光度计记录不同温度下复合物的紫外可见吸收光谱。
[0158]动态光散射(DLS)检测方法
[0159]将1.5mL3nM的组装好的DNA-纳米金复合物加入到比色皿中，使用Delsa? NanoSubmicron Particle Size and Zeta potential Particle Analyzer (贝克曼库尔特公司)进行检测。
[0160]实施例1
[0161]纳米金复合物的组装
[0162]首先将金纳米颗粒与含富A寡聚核苷酸结合区的功能分子以一定的比例(DNA/纳米金为200:1)混合，轻轻吹打使混匀，室温孵育16小时后，加入IMPBSdM NaCl/0.1M PB，ρΗ7.0)使其终浓度为0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次间隔)，室温下放置16h，12000r,4°C，20min离心，吸弃上清，加入等量的0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, pH7.0)洗离三次，杂交溶液(0.3M NaCl/lOmMPB, pH7.0)悬浮，4°C冰箱长期保存。图1显示了功能分子和纳米金复合物的示意图。
[0163]实施例2
[0164] 含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物在电解质溶液中的稳定性
[0165]为了确定寡聚核苷酸DNA可以通过其结构中的polyA结合区稳定地连接到纳米金表面，本实施例取三种DNA样品:(a) DNA中无多聚腺嘌呤核苷酸(polyA)组成的结合区、(b) DNA中含有多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区A10、(c) DNA端部修饰巯基基团，上述DNA中过渡区为T5，功能区均为ATgAT gTTCg TTgTgo上述三种DNA分别和IOnm纳米金颗粒纳米金形成DNA-纳米金复合物，对其在不同离子强度的电解质溶液的稳定性进行比较。
[0166]实验原理:分散在溶液中的粒径为IOnm的纳米金呈红色，纳米金聚集后由于表面等离子共振效应会使其颜色发生蓝移，没有修饰DNA的纳米金在高离子强度环境中不稳定，容易发生聚集；修饰在纳米金表面上DNA可以使纳米金稳定存在于高离子强度环境中。
[0167]实验结果如图2和图3所示，含polyA结合区的DNA-纳米金复合物和巯基修饰的DNA-纳米金复合物在离子浓度高达0.3M的NaCl电解质溶液中仍然保持红色并且在520nm处有一个明显的特征吸收峰，表明polyA和巯基有相同的作用，可以使DNA连接到纳米金上，并可以使纳米金在高离子强度环境下保持很好的稳定性；与之相反，不含PolyA结合区的DNA-纳米金体系非常不稳定，在NaCl浓度仅为20mM时，溶液颜色就有所变化并且其紫外吸收峰发生蓝移，在离子强度变高后颜色即变为蓝色，这种颜色变化说明金胶已经发生聚合，证明不含polyA的DNA多聚腺苷寡聚核苷酸不能稳定结合到纳米金表面。
[0168]上述实验结果表明，功能分子可以通过与之连接的polyA结合区稳定地结合到纳米金表面。
[0169]实施例3
[0170]含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的热稳定性
[0171]DNA-纳米金复合物的热稳定性对其实际用途中有很重要的影响，为了证明含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物有很好的热稳定性，本实施例使用一条有荧光素标记的含PolyA的寡聚核苷酸，将其连接到纳米金上，并检测它们从纳米金上随着温度变化的解吸过程。
[0172]实验原理:纳米金具有猝灭荧光的能力，连接在纳米金表面上修饰了荧光分子的DNA表现出很低荧光值，如果修饰了荧光分子的DNA从金表面脱落下来，体系的荧光值就会升高。
[0173]实验结果表明，含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物高度耐热，即使在高温(900C )时，仍只有很少的DNA从纳米金表面脱离，这与巯基DNA-纳米金复合物的稳定性相当。
[0174]上述结果表明含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物具有良好的热稳定性。
[0175]实施例4
[0176]富T链对含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物不产生影响
[0177]由于本发明中DNA是通过一段polyA结合区和纳米金结合，这种DNA-纳米金复合物的稳定性可能会由于与结合区序列互补的DNA(富T序列)的杂交作用而变得比较低。本实施例将一系列修饰了突光分子的富A序列(polyA1(l, PolyA15, poIyA20, poIyA30)按照标准步骤组装到纳米金表面上，然后向这些体系中加入高浓度(2μΜ)的与其对应互补的富T链(polyT10, PolyT15, polyT20, polyT3(l)。纳米金具有粹灭突光的能力,连接在纳米金表面上修饰了荧光分子的PolyA序列表现出很低荧光值，如果修饰了荧光分子的polyA从表面取代下来，体系的荧光值就会升高。
[0178]结果如图4所示，由于纳米金对连接在DNA末端的荧光分子FAM有淬灭作用，因此复合体系的荧光值几乎为零，MCH可以将DNA从纳米金上取代下来，导致体系的荧光值升高；而同等长度的poly dT处理后的DNA-纳米金复合体系与未经处理时的荧光强度相当，表明只有极少量金纳米粒子上的PolyA被A-T互补杂交作用取代下来。
[0179]上述结果 表明，纳米金上所吸附的polyA非常稳定，可以抵抗富A-富T之间的杂交解吸作用。
[0180]实施例5
[0181]PolyA结合区的长度对功能分子在纳米金表面上组装密度的影响
[0182]本实施例试图通过改变polyA结合区的长度，从而实现从空间上调控组装在纳米金表面上功能分子密度的目的。
[0183]使用一系列结合区不同长度荧光基团标记的含多聚腺苷寡聚核苷酸，按照标准方法将其组装到纳米金表面，然后利用基于取代反应的荧光法定量金纳米粒子表面DNA的组装密度。如图5所示，随着polyA长度的增加，纳米金粒子上组装的寡聚核苷酸密度逐渐降低(图5a、图5b)。另外，发明人发现不论polyA结合区长度为多少，纳米金粒子表面所吸附的腺嘌呤核苷酸的数目没有显著的差别(图5c)，说明结合区所有腺嘌呤核苷酸都可以完全吸附在金纳米颗粒的弯曲表面，实现表面的完全覆盖。
[0184]上述结果表明可以通过调节含多聚腺苷结合区的长度来调控功能分子在纳米金表面上组装密度。
[0185]实施例6
[0186]含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率
[0187]DNA-纳米金复合物上的DNA杂交活性对其在生物检测和生物效应等实际应用中有重要的影响。传统利用巯基结合于纳米金的DNA-纳米金复合物，由于其纳米金表明的DNA形态和DNA密度的影响导致其功能区DNA探针杂交效率很低。含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物,理论上其polyA部分不仅可以使功能分子连接到纳米金表面上,还可能屏蔽纳米金表面上非特异性作用位点，使功能分子在纳米金表面呈垂直构型，保持高的生物活性。
[0188]在本实施例中，发明人研究了含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率。首先制备一系列含不同长度polyA结合区的DNA，其过渡区均为T5，功能区均为ATgAT gTTCg TTgTg，然后检测它们与互补DNA链的杂交效率。
[0189]实验结果如表1所示，含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率显著提高，比基于巯基修饰的DNA-纳米金复合物的杂交效率(约5%-10%)提高了一个数量级；而且随着polyA长度的增加，功能区DNA的杂交效率逐渐提高，含polyA5的DNA的杂交效率约为42%，含polyA30的DNA的杂交效率达到约90%。[0190]表1