或聚氧乙烯脱水山梨糖醇
尤其为脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span
)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween
)。糖脂佐剂溶液通过将适量糖基酰胺储备溶液引入“适当的缓冲液”中制备。本文所述的稳定的糖脂佐剂溶液的最终pH值应介于约6与约8之间。较佳的最终pH值介于约6与约7之间。描述了介于约6.3与约6.4之间的最终pH值。应避免超过30mM的NaCI高盐浓度的糖脂佐剂。
以下更详细的举例说明这两种溶液: 糖基酰胺储备溶液为包含下列各物质的组合物: a)式I的糖脂， 其中式I为
其中: R1为氢或具有至多20个碳原子的饱和烷基； X为-CH2-、-O-或-NH-； R2为氢或具有至多20个碳原子的饱和烷基； R3、R4和R5独立地为氢、-SO42-、-PO42-、-COC1-10烷基； R6为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺酰基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟丙基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或它们的D-异构体； 该糖脂为盐的形式，其中该盐的形式衍生自弱酸； b)醇，其中该醇为HO-C1-3烷基； c)弱酸，其中1)该弱酸相对于糖脂含量为摩尔过量的；且2)为使用标准表或标准值pKa值介于约1.0与约9.5之间的任何酸；和 d)非离子表面活性剂，其中该非离子表面活性剂为降低使其溶解的材料的表面张力的试剂且具有一种疏水性组分和另一种亲水性组分。
糖脂佐剂溶液为含有下列各物质的组合物: a)糖基酰胺储备溶液；和 b)合适的缓冲液，其中该缓冲液适于兽医或医疗用途且可在水溶液中维持约6.0与约8.0之间的相对恒定的pH值。
发明详述 除另外说明的之外，该说明书和权利要求中所使用的下列术语具有如下含义: 术语“醇”指下式化合物:HO-C1-3烷基。其可为甲醇、乙醇或任何形式的丙醇，如正丙醇或异丙醇。优选乙醇。
术语“烷基”指直链和支链的饱和烃部分。
术语“糖脂”指下式I的化合物。这些化合物描述于美国专利6,290,971和1989年8月8日颁布的美国专利4,855,283中。美国专利6,290,971与美国专利4,855,283均全文引用在此作为参考。本文特定描述的糖脂在呈乙酸盐形式时具有的商标名为Bay
和化学名为“N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸盐”。此化合物的酰胺形式具有的商标名为Bay15-
和化学名为“N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺”。
式I的糖脂为:
式I 其中 R1为氢或具有至多20个碳原子的饱和烷基； X为-CH2-、-O-或-NH-； R2为氢或具有至多20个碳原子的饱和烷基； R3、R4和R5独立地为氢、-SO42-、-PO42-、-COC1-10烷基； R6为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺酰基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟丙基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或它们的D-异构体； 或其药学上可接受的盐。
另一特定实施方案描述了式1的糖脂，其中: R1为氢或饱和C12-18烷基； R2为氢或饱和C7-11烷基； X为-CH2； R4和R5独立地为氢； R6选自L-亮氨酰基； 式I的变量是分开的且独立的，且所有变量的组合均于此描述并要求保护。
在另一实施方案中，糖脂为式II(a)所述的糖脂:
式II(a) 在另一实施方案中，糖脂为式II(b)所述的糖脂:
式II(b) 在另一实施方案中，糖脂具有式III的结构:
式III 式III化合物可以酰胺形式或乙酸盐形式存在。此化合物的酰胺形式具有商标名Bay 15-
乙酸盐形式具有商标名Bay
式I的糖脂可使用下列选自美国专利4,855,283的步骤制备。
正如从式1看到的那样，本发明的化合物是基于经取代的2-氨基-2-脱氧己糖。这些糖总是经由异头碳原子C-1将N-糖苷键与酰胺基、脲基或烷氧羰基胺基结合
其中R1、R2和X具有上述含义。
在本发明的式I化合物中，氨基糖的2-氨基经酰胺键与α-氨基酸或α-氨基酸衍生物结合。
氨基酸为天然L-氨基酸，例如甘氨酸、肌氨酸、马尿酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸和组氨酸。还描述了D-氨基酸例如D-丙氨酸，或氨基羧酸如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基己酸或α-氨基庚酸，其呈D-和L-形式，作为氨基糖的取代基。
还提供用于制备式I化合物的方法。此方法需要从氨基受保护的2-氨基-2-脱氧吡喃葡萄糖衍生物(式IV)开始，
其中R10表示用于保护氨基的保护基，其由肽合成可知，且能在适当的时候选择性消除。
合适的保护基的实例为酰基(例如三氟乙酰基或三氯乙酰基、邻硝苯次磺酰基、2，4-二硝苯次磺酰基)或随意取代的低级烷氧羰基(例如甲氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基或2，2，2-三氯乙氧羰基)。合适的N-保护氨基己糖衍生物为已知的。例如，M.Bergmann和L.Zervas，Ber.64，975(1931)；D.Horton，J.Org.Chem.29，1776(1964)；P.H.Gross和R.W.Jeanloz，J.Org.Chem.32，2759(1967)；M.L.Wolfrom和H.B.Bhat，J.Org.Chem.32，1821(1967)；概要:J.F.W.McOmie(编者)。Prot.Groups.Org.Chem.，PlenumPress(1973)；Geiger，＂The Peptides＂，第3卷，第1-99页，(1981)Academic Press；及其中所引用的文献。用于制备式I化合物的优选的氨基保护基为BOC基(叔丁氧羰基)或Z基(苄氧羰基)。
在第一反应步骤中，使被封端氨基糖衍生物(IV)与胺(式V)反应 H2N-R1 (V) 其中R1具有上述含义，以生成糖基胺(式VI)
此类型糖基胺的制备原则上是已知的(ELLIS，Advances inCarbohydrate Chemistry 10，95(1955))，且明确地描述于DE-OS(德国公开说明书)第3,213,650号中。
在第二反应步骤中，使糖基胺(VI)与任一合适的羧酸衍生物(式VII)，例如羧基卤化物或羧酸酐反应， R11-CO-CH2-R4 (VII) R2具有上述含义，且R11表示卤素(例如氯)或表示-O-CO-R2(R2具有上述含义)或表示-O-CO-O-低级烷基。以此方式获得糖基酰胺(式VIII)
其中R1和R2具有上述含义，且R10与R6相同，且X表示-CH2-。此类N-酰化的条件于DE-OS(德国公开说明书)第3,213,650号中指出。
在优选实施方案中，在有机助剂碱的存在下，通过文献已知的方法，使式VI糖基胺与1至2当量碳酰氯(式VII)反应或与1至2当量的通过相关羧酸R2-CH2-CO2H与氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得的混合酸酐反应，生成具X＝-CH2-的式VIII的糖基酰胺。
此反应是在有机或水-有机溶剂中0℃与50℃之间，有机碱或无机碱适当存在下进行的。适合的稀释剂为醇例如甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇，或醚例如乙醚、四氢呋喃或1，4-二氧杂环己烷，或卤化烃例如二氯甲烷、三氯甲烷或1，2-二氯乙烷或N，N-二甲基甲酰胺。
当第一步骤中获得的糖基胺(VI)与卤代甲酸酯(IX)反应时， R12-CO-O-R2 (IX) R12表示卤素(例如氯或溴)，并且R2具有上述含义，然后得到糖基氨基甲酸酯(VIII)，式VIII中的X表示氧。
在一实施方案中，将式VIII糖基胺与1至2当量氯代碳酸酯IX反应以生成糖基氨基甲酸酯。优选的是在有机或水性-有机溶剂中，温度介于0℃与50℃之间，但更优选的是在室温下进行此反应。合适的溶剂如上文所述的醇、醚、卤代烃或二甲基甲酰胺。
当第一步骤中获得的糖基胺(VI)与1至2当量有机异氰酸酯(式X)反应时， R2-NCO(X) 其中R2具有上述含义，获得式VIII糖基脲且X为-NH-。与上述反应类似，此酰化反应优选在有机溶剂中进行，反应温度介于-20℃与60℃之间，优选介于0℃与25℃之间。适宜的溶剂为上述醇、醚、卤代烃或二甲基甲酰胺。
通过此方法获得的糖基酰胺(式VIII，X＝-CH2-)、糖基氨基甲酸酯(式VIII，X＝-O-)或糖基脲(式VIII，X＝-NH-)通过各自已知的过程分离为晶状的或无定形的形式，如必要可通过标准程序例如重结晶、色谱、萃取等进行纯化。
在许多实例中，与上述纯化步骤类似或替代上述步骤进行化学衍生作用也是有利的，其生成式VIII的具有良好结晶性质的糖基酰胺、糖基氨基甲酸酯和糖基脲衍生物。本发明所述的糖基酰胺、糖基氨基甲酸酯和糖基脲的实例中，此类型的化学衍生化为例如糖残基羟基上的酯化反应。合适的酯基的实例为乙酰基、苯甲酰基或对硝基苯甲酰基。
为制备糖基酰胺、糖基脲或糖基氨基甲酸酯的三-O-酰基衍生物，使相应的三醇(式VIII)在无机或有机助剂碱存在下与酰化剂反应。合适酰化剂为酸氯化物诸如乙酰氯、苯甲酰氯或对硝基苯甲基氯，或酸酐诸如乙酸酐。此反应结果生成式XI的酯，
其中R1、R2、R10和X具有上述含义，且 R13表示乙酰基、苯甲酰基或对硝基苯甲酰基。
O-酰化反应优选在惰性有机溶剂中进行。可使用的溶剂为卤代烃(如二氯甲烷、三氯甲烷或1，2-二氯乙烷)、醚(如四氢呋喃或1，4-二氧杂环己烷)、酯(如乙酸乙酯)和酰胺(如二甲基甲酰胺)。
也可能为单独的有机碱(诸如三乙胺或吡啶)作为合适溶剂。可使用的碱为用于O-酰化有机化学中的所有碱。优选使用三乙胺、吡啶或吡啶/4-二甲基氨基吡啶的混合物。三酯(式XI)易从有机溶剂中结晶。结晶优选极性溶剂，如短链醇，也就是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。其它适用于三酯(式XI)结晶的溶剂为有机溶剂与极性无机溶剂或有机溶剂的混合物，例如四氢呋喃-甲醇、四氢呋喃-水、乙醇-水和异丙醇-水。通过单独的或适当的多次重结晶纯化的三酯(式XI)通过三O-乙酰基水解或酯基转移被还原为三醇(式VIII)。已知有机化学中多种类型的酯裂解。有关从三酯(式XI)制备三醇(式VIII)可通过有机化学中已知的ZEMPLEN水解，在甲醇和催化量的甲醇钠存在下进行酯基转移。
有关本发明式I化合物制备的第三个反应步骤包括选择性裂解式VIII化合物中糖上2-氨基的保护基。在此反应中，需特别注意式VIII化合物中糖上的1-酰氨基或1-胺甲酰氨基或1-(烷氧羰基酰氨基)不同时消除。
在氢解条件下，优选使用的苄氧羰基在氨基己烷C-2上能定量地且选择性裂解，保留1-酰氨基、1-胺甲酰氨基或1-烷氧羰基酰氨基。此氢解提供了具有以下结构式(XII)的在糖上具有游离2-氨基的糖基酰胺、糖基脲或糖基氨基甲酸酯，
其中R1、R2和X具有上述含义。
氢解合适的催化剂的实例为吸附于活性炭上的贵金属，诸如铂或钯。优选使用钯/炭(5％或10％)。氢解可在大气压或高压下，适当的压力容器中进行。适于氢化的为惰性溶剂，诸如醇(甲醇、乙醇或丙醇)、醚(诸如四氢呋喃或1，4-二氧杂环己烷)或羧酸(诸如乙酸)或其混合物。适当时溶剂与水或稀酸(诸如氢氯酸或硫酸)混合。当然，当添加这些酸时，式XII的2-氨基-2-脱氧-糖基酰胺、-氨基甲酸酯和-脲作为这些酸的铵盐获得。叔丁氧羰基保护基同样较适用于式VIII化合物，其可通过文献已知的方法使用无机酸(如氢氯酸或硫酸)裂解。其中同样，式XII的2-氨基-2-脱氧-糖基酰胺、-氨基甲酸酯和-脲作为用于裂解的酸的铵盐而被选择性地获得。
有关本发明式I化合物的第四反应步骤，其包括使式XII的氨基糖基酰胺、酰胺、-氨基甲酸酯或-脲或其盐与合适的氨基酸衍生物键合。合适的氨基酸衍生物为N-封端氨基酸(式XIII)
其中R7具有上述含义， R8表示氢或甲基，且 R14表示通常用于肽合成且可再次选择性去除而保留肽键的保护基。
优选使用的式XIII中氨基的保护基为上述保护基，且苄氧羰基或叔丁氧羰基为尤其优选的。式XII的2-氨基-2-脱氧-糖基酰胺、-氨基甲酸酯或-脲与式XIII氨基酸衍生物的键合可通过肽合成的常规方法进行(E.Wunsch等:Synthese von Peptiden(Synthesis ofpeptides):Methoden der Org.Chemie(Methods of org.chemistry)(Houben-Weyl)(E.Muller，Editor)，第XV/I卷和第XV/2卷，第4版，由Thieme，Stuttgart出版(1974))。
常规方法的实例为式XII化合物的氨基与式XIII氨基酸衍生物在脱水剂(例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺)存在下缩合。
式XII化合物与式XIII化合物的缩合也可在羧基活化时进行。可能被活化的羧基为例如酸酐，优选为混合酸酐，诸如酸的乙酸盐或酸的酰胺，诸如咪唑；或活化酯。活化酯的实例为氰基甲基酯、五氯苯基酯和N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯。活化酯也可在脱水剂如碳二亚胺的存在下从酸(式XIII)和N-羟基丁二酰亚胺或1-羟基苯并噻唑获得。氨基酸的衍生物为已知的且可以已知方式制备。式XII的氨基化合物与选择性被活化的式XIII羧基化合物缩合制备式XIV的肽糖脂。
其中R1、R2、R7、R8、R14和X具有上述含义。
在制备有关式I化合物的最终过程的步骤中，式XIV化合物中的保护基R14被消除了。在此步骤中需注意的是，存在于式XIV化合物中的其它酰氨基、氨基甲酸酯基或脲基不被裂解。优选用于XIV化合物中的保护基R14、N-苄氧羰基和N-叔丁氧羰基可被消除，而保留酰氨基、氨基甲酸酯基或脲基。苄氧羰基在贵金属如钯炭的存在下，在合适的溶剂中(如乙醇、甲醇、冰乙酸或四氢呋喃)通过氢解选择性去除苄氧羰基。该溶剂可以纯溶剂、或相互混合、或与水混合使用。该反应可在大气压或高压下进行。式XIV化合物中的叔丁氧羰基R14可通过酸解过程消除。合适条件的实例为在室温下在合适溶剂中(诸如冰乙酸、乙醚、二氧杂环己烷或乙酸乙酯)使用氯化钠。此类裂解氨基甲酸叔丁酯的方法原则上是已知的。以此方式获得的式I的肽糖基酰胺、-氨基甲酸酯和-脲以本来已知的方法分离为结晶或无定形固体的形式，并且如果必要，通过标准方法(如重结晶、色谱、萃取等)进行纯化。
本发明所述式I的化合物还能通过获得同样好结果的第二合成途径制备。此第二合成途径与上述第一合成途径不同，其中合成元氨基糖氨基酸、胺R1-NH2和羧酸R2-CH2-CO2-H或碳酸衍生物R2-O-CO-卤素或R2-NCO(其中R1和R2具有上述含义)的键合次序不同。在此第二途径中，合适的式XV的2-N-(氨基酰基)氨基糖用作起始组分，
其中R7和R8具有上述含义，且其中R14表示肽化学中已知的氨基保护基，较佳为苄氧羰基或叔丁氧羰基。然后，如此获得的式XV化合物与式III的氨基化合物缩合以生成通式XVI的糖基胺，
其中R1、R7、R8和R14具有与式I和R6的定义一致的含义。
上述所有用于制备通式VI化合物的方法均可用于制备通式XVI的化合物。然后，式XVI化合物与上述羧酸衍生物(式VII)或卤代甲酸酯(式IX)或有机异氰酸酯(式X)反应以生成式XIV的2-(氨基酰基)-氨基糖基酰胺(X＝-CH2-)或式XIV的-氨基甲酸酯(X＝-O-)或式XIV的-脲(X＝-NH-)。这些酰化反应通常可通过上文所述的糖基胺与羧酸或碳酸衍生物的反应步骤进行。
通过这种方法获得的中间体式XIV可以由上述物理纯化方法来纯化。然而，优选通过由上述O-酰化方法将式XIV化合物转化成通式XVII的三-O-乙酸酯或三-O-苯甲酸酯，
其中变量的含义与式1一致。
这些化合物容易结晶，尤其是从有机溶剂例如甲醇或乙醇中，并因此而得以纯化。然后通过广泛用于糖化学的上述酯水解方法，将式XVII的纯化结晶衍生物转化成式XIV的三醇。式XIV化合物中氨基酸的保护基的最终去除以制备式I化合物已在上文中述及。本发明还涉及式I化合物的盐。这些盐主要为通常可用于药剂学的无毒盐，例如式I化合物的氯化物、乙酸盐和乳酸盐或惰性盐。
术语“弱酸”是指使用标准表或标准值的pKa值(Ka的-log)介于约1.0与约9.5之间的任何酸。以名称、化学式和近似pKa值描述下列弱酸实例，而并非欲限制本发明。乙酸，H(C2H3O2)(pKa 4.76)；抗坏血酸(1)，H2(C6H6O6)(pKa 4.10)；乙酰水杨酸，H8(C9O4)，(pKa3.5)；丁酸H(C4H7O2)(pKa 4.83)；碳酸，H2CO3，(pKa 4.83形式1)；铬酸，HCrO4-，(pKa 6.49形式2)；柠檬酸，H3(C6H5O7)，(pKa3.14形式1)；柠檬酸，H2C6H5O7-，(pKa 4.77形式2)；柠檬酸，(HC6H5O7)＝，(pKa 6.39形式3)；甲酸，H(CHO2)，(pKa 3.75)；反丁烯二酸，H4(C4O4)(pKa 3.03)；庚酸，H(C7H13O2)，(pKa 4.89)；己酸，H(C6H11O2)，(pKa 4.84)；氢氟酸(hyrofluoric acid)，HF，(pKa3.20)；异柠檬酸(isocitrate)，H8(C6O7)，(pKa 3.29)；乳酸，H(C3H5O3)，(pKa 3.08)；顺丁烯二酸，H4(C4O4)(pKa 1.83)；烟酸，H5(C6NO2)(pK3.39)；草酸，H2(C2O4)，(pKa 1.23形式1)；草酸，(HC2O4)-，(pKa4.19形式2)；戊酸，H(C5H9O2)，(pKa 4.84)；磷酸，H3PO4，(pKa 2.16形式1)；丙酸，H(C3H5O2)，(pKa 4.86)；丙酮酸，H4(C3O3)，(pKa 2.39)；丁二酸H6(C4O4)(pKa 4.19)和三氯乙酸，H(C2C13O2)，(pKa 0.70)。这些酸的任何组合也被列举。
优选乙酸。乙酰水杨酸、柠檬酸、甲酸、反丁烯二酸、氢氟酸、异柠檬酸、顺丁烯二酸、烟酸、磷酸、丙酮酸、丁二酸和三氯乙酸为更常用的弱酸，这些弱酸各自地、组合并作为一个集合收录。
术语“非离子表面活性剂”是指一种表面活性剂，该物质降低使其溶解的材料的表面张力，且非离子是指具有不带电的极性基团。术语两亲表面活性剂是指表面活性剂分子一部分为疏水性的而一部分为亲水性的一种表面活性剂。合适的表面活性剂将为非离子性的和两亲性的，且适于兽医或医疗用途。特定非离子表面活性剂是否适于医疗或兽医用途可通过本领域普通技术人员很容易确定。许多合适的非离子表面活性剂可用于本发明且下文给出多个实例。
本文收录两种熟知类型的非离子表面活性剂。它们被称为脱水山梨糖醇(通常以
商标出售)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇(通常以
商标出售)，本文特别地收录以下各物: 脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇单油酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇三油酸酯(Span
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(Tween 85)。这些描述意味着包括这些表面活性剂供应目录所列出的商标名成份或等效成份。表面活性剂可单独地或任意组合使用。
特别地描述脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween
脱水山梨糖醇单油酸酯(Span
)、脱水山梨糖醇三油酸酯(Span
)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(Tween 85)。
术语“合适的缓冲液”是指一种缓冲液，其适用于兽医或医疗用途且可在水溶液中维持介于约6与约8之间的相对恒定的pH值。磷酸盐缓冲液为本文所述的一个实施方案。可藉助于以不同比例混合的磷酸钠和/或磷酸钾的二氢盐和一氢盐而制得宽范围的具有特定pH值的磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知各种钠缓冲液和钾缓冲液的制备和用途。
缓冲液的其它实例如下: 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(也称为MES)； 3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(也称为MOPS)； n-[三(羟甲基)]-2-氨基乙烷磺酸(也称为TES)； 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(也称为HEPES)； [三(羟甲基)甲基]甘氨酸(也称为TRIS)。
第I部分:溶液的制备 本文所公开的新的制剂为1)糖基酰胺储备溶液和2)糖脂佐剂溶液。
1)糖基酰胺储备溶液是通过将糖脂溶于醇中且混合适量弱酸制备的。将弱酸加入糖脂醇溶液中，弱酸相对于糖脂为摩尔过量的。将非离子表面活性剂添加至糖脂醇酸混合物中制得糖基酰胺储备溶液。示例的糖脂为N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸盐。示例醇为乙醇。示例弱酸为乙酸。非离子表面活性剂为如上所述的。
糖基酰胺储备溶液的制备。将弱酸加入含有糖脂的醇溶液中。加入的弱酸相对于糖脂含量为摩尔过量的。添加的弱酸组分应为与糖脂摩尔当量的1.25至5倍。在特定的实施方案中，推荐酸的以下相对量。弱酸应为糖脂摩尔数的2.0倍、2.5倍、2.7倍、3.0倍和5.0倍，且最佳为2.7倍。
在添加弱酸之前或之后，将非离子表面活性剂添加至上述的醇糖脂混合物中以获得最终的糖基酰胺储备溶液。
在弱酸存在下，将糖基酰胺转化成糖脂的乙酸盐形式。当仅直接引入缓冲水溶液中时，式I的糖脂不能充分溶解。从溶解式I糖脂的缓冲溶液获得的溶液典型地为乳状混合物。早期研究者已试图借助于超声处理该乳状溶液从而使这些混合物溶液均匀。然而，超声波处理却不能确保溶液在储存期间保持均匀。使这些化合物悬浮的化学方法可使水性缓冲糖脂溶液在适当pH值完全溶解、接近光学澄清。当加入的弱酸相对于糖脂摩尔过量时，确保所有糖脂均转化成可溶形式，并防止其回复为不可溶形式。
弱酸使糖脂转化成药学上可接受的盐。优选的盐为无毒盐，其通常用于医药和生物制剂。例如，本文所述与弱酸获得的式I化合物的氯化物、乙酸盐、乳酸盐和惰性盐。
用于溶解糖脂的醇可为甲醇、乙醇、任何异构体形式的丙醇、或其任何组合。所得糖脂醇溶液将为光学上澄清的。任何可将糖脂的乙酸盐形式转回非乙酸盐形式的化学反应均将导致糖脂在水溶液中絮凝。当糖脂絮凝出现时，糖脂分子呈薄片状从溶液中析出，沉降在容器底部。糖脂和醇的糖基酰胺储备溶液中弱酸的最初浓度决定了是否将存在任何糖脂的絮凝。弱酸相对于糖脂应摩尔过量以避免絮凝。
2)糖脂佐剂溶液是通过将适量糖基酰胺储备溶液引入“合适的缓冲液”中制备的。本文所述的最终稳定的糖脂佐剂溶液的pH值应介于约6与约8之间。优选最终pH值介于约6与约7之间。描述了介于约6.3与约6.4之间的最终pH值。
由于糖基酰胺储备溶液含有过量酸，因此其具有缓冲性，可用作佐剂。例如，可通过将不同比例磷酸钠或磷酸钾的二氢盐和一氢盐混合而制得具有宽范围的特定pH值的磷酸盐缓冲液。若使用磷酸盐缓冲液，则可以用约20mM将其制得，且其pH值约为7.8。当将糖基酰胺储备溶液添加至缓冲液中时，缓冲液的pH值降低。pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液产生pH值约为6.4的最终糖脂佐剂溶液。最终的pH值可以调节，但其通常并不必要。
含有弱酸和糖脂的糖基酰胺储备溶液的pH值极低。可有必要将pH值提高至可接受的水平。为此目的应避免强碱，因为强碱的加入可将糖脂的盐形式转化回非盐形式，引起非盐形式在水性环境中沉淀(絮凝)。然而，若需要强碱，则应仅使用少量。例如，推荐使用最多100mM的NaOH，而最佳为4.0mM或更小。
缓冲溶液可选择性地包括一些NaCl，但并不必需。NaCl浓度可介于约1与约50mM之间。较少量的NaCl优于较多量。本文的实例没有NaCl或15mM NaCl。由于会出现絮凝，因此100mM的NaCl并不合适。15mM或更低的NaCl浓度预期不会产生絮凝。30mM或更低的NaCl浓度预期不会产生絮凝。50mM或更低的NaCl浓度预期不会产生絮凝。
第II部分:糖脂佐剂溶液的鉴定 储存期间糖脂佐剂溶液的稳定性可通过简单目测或通过使用适当分析仪器监视。当在水溶液中时，糖脂分子形成胶束且能使用激光衍射仪精确地测定胶束的尺寸。该测量可用于确定是否存在糖脂分子的絮凝。
实时稳定性测量的替代方法为进行加速稳定性试验。加速稳定性试验使佐剂溶液经受约37℃的温度持续约7天，然后在约4℃下培育约2天，并不断振摇。在约37℃下培育约7天表示在约4℃下储存约1年的时期。在约4℃于不断振摇下培育约2天表示在运输期间糖脂佐剂溶液能面对的应力条件。
为确定糖脂佐剂溶液是否与细胞质等张，可测定渗透压。可添加不同浓度的氯化钠且使用渗透压计测定所得溶液的渗透压。除增加渗透压外，增加氯化钠的浓度也倾向于使溶液更加浑浊。浑浊度被认为是由胶束聚集成较大粒子而导致的。使用0.2μm过滤器难以或无法过滤的溶液通常不适于商用，因为末期过滤通常用于确保商业规模制备的佐剂溶液无菌。电子显微分析可用于确定是否由于过多的盐而导致胶束聚集。
另外的非糖脂佐剂也可与上述物质组合用于糖脂佐剂溶液中。在本发明的另一实施方案中，可将另外的免疫刺激性分子添加至糖脂佐剂溶液中。免疫刺激性分子在此技术中是熟知的，且它们包括皂素、Quil A、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)和聚羧乙烯(Carbopol)。
Quil A为从南美石碱木(Quillaja saponaria)的树皮提取纯化得到。Quil A诱导体液性反应与细胞介导的反应。Quil A通常与胆固醇共同使用，因为胆固醇加入适当比例时会消除较为不良的副作用。胆固醇与Quil A形成不溶性复合物，当胆固醇与Quil A结合时，这些复合物形成类似螺旋状结构，因此暴露分子的糖单元，从而有助于刺激免疫反应。
二甲基双十八烷基溴化铵DDA为具有18碳烷基链的阳离子表面活性剂。其为两亲的四元胺。由于DDA在油/水界面上通过与抗原直接结合而作为抗原的载体，因此需要使DDA直接与抗原相互作用以获得最佳免疫反应。其刺激体液性免疫反应与细胞介导的免疫反应。
聚羧乙烯为可用于本发明的另一有用的免疫刺激性分子。其为与聚烯基醚交联的丙烯酸均聚物。
第III部分:糖脂佐剂溶液的用途 可将药学上可接受的盐形式的糖脂佐剂溶液与抗原混合。适合的抗原包括:微生物病原体蛋白、糖蛋白、脂蛋白、肽、糖肽、脂肽、类毒素、碳水化合物和肿瘤特异性抗原。抗原可从多种来源衍生。来自微生物病原体的抗原包括致病细菌、病毒和寄生生物体。可使用两种或多种抗原的混合物。抗原可为经杀死、自然减毒、修饰的活抗原，或为蛋白提取物、重组产生的蛋白、化学合成肽或刺激免疫应答的任何其它物质。肽抗原可作为游离肽而存在或与糖脂共轭或与其它已知B细胞或T细胞抗原决定簇共轭。
稳定的糖脂佐剂溶液可与其它佐剂或已知具有佐剂性质的组分组合。可与糖脂佐剂溶液组合的另外的佐剂包括聚合物、粗制的或部分纯化形式的天然存在的萜类化合物、两亲四元胺、细菌细胞壁材料的衍生物和细菌细胞壁或DNA组分的合成类似物。糖脂佐剂溶液可与一种或多种试剂(诸如抗生素或不同抗原)共同使用或组合。细菌或病毒抗原可为经杀死的或修饰的活抗原。通过使病毒在组织培养物中生长且经由化学处理使病毒灭活而制备经杀死的病毒抗原。某些病毒可在受孕卵中生长。被杀死的病毒抗原可加至含有糖脂佐剂溶液的溶液中，且所得溶液可用于动物接种疫苗以实现免受病毒感染的保护。
在本发明的一个实施方案中，糖脂佐剂溶液可用作修饰的活病毒抗原的稀释剂。可通过使病毒病原体的数个世代经过组织培养物或通过病毒基因组的特殊处理而使病毒病原体毒性减弱。这些减毒病毒株可在组织培养物中变成非常高的效价且可用作疫苗抗原。减毒病毒株被称为修饰的活病毒抗原。尽管这些病毒株毒性较小，但当用作疫苗中的抗原时，其仍为高度免疫原性的且提供免受毒性病毒株感染的保护。若糖脂佐剂溶液用作修饰的活病毒抗原的稀释剂，则糖脂佐剂溶液应经测试以确保其对有关的特定病毒不具有任何杀病毒作用。
可在体外实验中测定糖脂佐剂溶液对修饰的活病毒抗原的杀病毒性质。用糖脂佐剂溶液或水使经冷冻干燥的病毒抗原再水合。将所得病毒溶液涂于允许细胞的单层上。病毒抗原的效价通过对单细胞层上形成的菌斑计数而确定。在用水再水合的样本与用糖脂佐剂溶液再水合的样本之中，所获得的病毒效价的差别可用于确定是否存在任何糖脂佐剂溶液对任何活病毒具有杀病毒作用。
修饰的活病毒抗原可为冷冻干燥的，且在商业疫苗制剂中作为经冷冻干燥的饼状物而提供。一般地，这些修饰的活病毒抗原的经冷冻干燥的饼状物与稀释剂溶液再水合，并用于非经肠给药的疫苗。稀释剂的实例包括含有磷酸盐缓冲盐的水溶液。如果稀释剂溶液含有已知免疫刺激性分子，会改善带有修饰的活病毒抗原的疫苗的功效。在本发明的一个实施方案中，将糖脂佐剂溶液用作稀释剂溶液。
实施例 实施例1.以等浓度的Bay
与乙酸制备不溶性糖基酰胺组合物。
表1.不适用于商业用途的组合物
Bay
由Bayer公司注册，其商品名为N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺。当该化合物用于制造表1所述化合物使用的佐剂溶液时，其中乙酸以与糖脂等摩尔浓度使用且糖脂呈其游离碱的形式，该糖脂不可溶且絮凝。
实施例2.可溶性糖基酰胺储备溶液 使用与实施例1相同的组分但乙酸浓度相对于糖脂浓度有所增加，生成可溶性糖基酰胺储备溶液。
表2.糖基酰胺储备溶液的组成
此处使用60％乙醇(v/v)，且乙酸与糖脂的摩尔比为2.0。以60％乙醇水代替实施例1的200-标准(proof)乙醇。所得糖基酰胺储备溶液为光学上澄清的且在容器底部无沉降。将此糖基酰胺储备溶液添加至各种缓冲液中以制备以下实施例3中的糖脂佐剂溶液。
实施例3.制备糖脂佐剂溶液 制备不同pH值的磷酸盐缓冲溶液。通过将138克NaH2PO4·H2O盐溶解于烧杯中的250mL去离子水中且使最终体积为500mL，制得2M磷酸二氢钠储备溶液。同样地，通过将142克NaH2PO4溶解于烧杯中的300mL去离子水中且使最终体积为500mL，制得2M磷酸氢二钠储备溶液。两种储备溶液均使用0.2微米滤器无菌过滤。
表3.不同pH值的磷酸钠缓冲溶液的1M储备溶液的组成 制备表3中所示的不同体积的2M磷酸二氢钠储备溶液和磷酸氢二钠储备溶液，然后获得不同pH值的磷酸钠缓冲溶液的1M储备溶液。然后，以50×稀释1M磷酸盐缓冲溶液以得到20mM磷酸盐缓冲液。
糖脂佐剂溶液是使用这些储备缓冲液和来自实施例2的糖基酰胺储备溶液制备的。
向这些20mM磷酸盐溶液的每96mL中添加如实施例2中所制备的5mL糖基酰胺储备溶液。所得糖脂佐剂溶液含有12.5mM乙酸和6.33mM糖脂。糖脂此时为乙酸盐形式。
实施例4.糖脂佐剂溶液的最终pH值的重要性。
在另一组实验中，测试各种溶液的最终pH值的重要性以评价pH值如何影响絮凝。制备20mM磷酸盐缓冲液，初始pH值为7.8。表4所示糖脂佐剂是使用如实施例1中所制备的糖基酰胺制备的，其中以等摩尔浓度使用糖脂和乙酸。注意，最终pH值下降的并不多(表4)，显示出缓冲液的效应。NaCl浓度是变化的。将表4中600nm处的光学密度读数(O.D.)与表5中的相似读数相比较，表5的糖脂佐剂溶液是用如实施例2中所制备的含有糖脂两倍摩尔比的乙酸的糖基酰胺储备溶液制备的。使用较高浓度或较大量的乙酸会产生最少的絮凝。未经过滤样品的絮凝多于经过滤的样品。另外，随着NaCI浓度增加，絮凝增加甚至出现沉淀。以初始pH值为8.0的磷酸盐缓冲液制备表5中所述的糖脂佐剂溶液，糖脂佐剂溶液的最终pH值介于6.8与7.0之间。糖脂佐剂溶液的最终pH值的进一步降低可导致具有较低浑浊度且无絮凝的糖脂佐剂溶液。
表4.制备含有等摩尔量的乙酸与糖脂的糖基酰胺组合物(参见实施例1) 表5.使用含有糖脂摩尔量两倍的乙酸的糖基酰胺储备溶液制备糖脂佐剂溶液(参见实施例2) 光学密度小于0.1(O.D.)表示半透明溶液。光学密度介于0.1与0.5之间为均匀且略微浑浊，光学密度0.5至1.0具有些许浑浊，光学密度1.0至1.5被认定浑浊。光学密度高于1.5的为浑浊且不可能使用0.2微米滤器过滤。一般认为后者不适用于商业。
实施例5.以乙酸滴定糖脂佐剂显示出絮凝可以逆转。
为确定向显示絮凝的糖脂佐剂中加入增加量的乙酸是否将逆转絮凝，制备如实施例1中所述的糖脂佐剂。甚至在无任何NaCl存在下，此糖脂佐剂也出现絮凝。向此絮凝糖脂佐剂混合物中添加增加浓度的乙酸。以水稀释乙酸16.6倍以得到1摩尔浓度的工作溶液浓度。然后，将15μl此1M溶液添加至15ml糖脂佐剂混合物中以使乙酸浓度增加至1mM。随着乙酸浓度增加，糖脂佐剂的pH值降低且絮凝溶解。但糖脂佐剂仍有几分浑浊。此观察结果证实增加的乙酸浓度使Bay 15-5381的游离碱转化成乙酸盐形式，该盐形式在水溶液中更能够溶解。
表7.以乙酸滴定糖脂佐剂 实施例6.制备含NaCl和不含NaCl的第二稳定糖脂佐剂溶液 在确立乙酸量的增加在维持糖脂溶液稳定性中的重要性之后，决定使用表8中所示的组合物首先制备糖基酰胺储备溶液，并且然后使用此溶液制备另一种含NaCl和不含NaCl的糖脂佐剂溶液。此糖基酰胺储备溶液与实施例2中的溶液相似，总体积为其4倍且具有相对较大量的乙酸和吐温20。
表8.糖基酰胺储备溶液的组成 使用实施例3的磷酸盐缓冲液和如表8中制备的糖基酰胺储备溶液制备3种具有不同NaCl浓度的不同糖脂佐剂溶液。
如同实施例4、表5中的制剂，制得含有0mM、15mM和100mM的NaCl的糖脂佐剂溶液。可经由0.2微米滤器过滤0mM和15mMNaCl溶液。含有100mM的NaCl的糖脂佐剂溶液不可通过0.2微米滤器过滤。
表9.含NaCl和不含NaCl的稳定糖脂佐剂溶液的制备 将20mL各糖脂佐剂溶液置于30ml玻璃瓶中并在室温和4℃下培育。在规定间隔进行目测。最初，具有0mM的NaCl的糖脂佐剂溶液为光学上澄清的。含有15mM的NaCl的糖脂佐剂溶液略微浑浊且在600nm的O.D.为0.073。含有100mM的NaCl的糖脂佐剂溶液浑浊且在600nm的O.D.为0.439(表9)。在室温和4℃，这些糖脂佐剂溶液均未显示任何絮凝的征兆。对这些糖脂佐剂溶液观察一年期，其外观无变化。
实施例7:以NaOH滴定稳定糖脂佐剂溶液。
初始，获得不含NaOH的光学上澄清且稳定的糖脂佐剂溶液。为确立除去或使用最少量NaOH对防止絮凝是必要的，有必要显示逐渐添加NaOH于不添加NaOH的稳定糖脂混合物中会诱导絮凝。将适当体积的1N的NaOH添加至15mL如下表10中所制备不添加任何NaCl的糖脂佐剂溶液中。逐渐将NaOH从1mM增加至12mM(表10)。使用实施例6中所述的糖基酰胺储备溶液制备用于此实验中的糖脂佐剂溶液。随着糖脂佐剂溶液中的NaOH浓度逐渐增加，制剂的pH逐渐增高，同时出现絮凝。
表10.以NaOH滴定稳定的糖脂佐剂溶液 实施例8.使用HPLC对糖脂组分定量。
将下列方法学用于Bay
的HPLC分析。使用表11中所述的HPLC参数。
表11.用于量化Bay 15-5381的HPLC方法中所用参数的概要 表12.Bay
的对照品 制备0.10至1.03mM范围内的对照品并注入HPLC中。这些对照品的概要如表12所示。将样品温至室温并在使用之前倒置5次。在10ml容量瓶中将1ml样品添加至6ml甲醇中。然后将样品超声波处理10分钟，将其稀释至刻度并混合。以峰面积对浓度作图，将对照品进行线性回归分析。根据标准曲线计算样品量。
实施例9:三十(30)升规模制备。
制备一批具有如实施例6中所述组成的30升糖脂佐剂溶液。此批溶液含有15mM的NaCl。
使用该30L制剂，以增加浓度的NaOH制备5种不同的子溶液。NaOH浓度自0mM增加至1mM、2mM、4mM、8mM和12mM。将各NaOH浓度的样品等分用于pH值测量和目测。随着NaOH量的增加，糖脂佐剂的pH值也增加，伴随絮凝增加。在室温下絮凝在2mM浓度的NaOH中开始出现，且在4℃下絮凝在4mM的NaOH中开始出现。
表13.随着NaOH浓度的增加30L批次糖脂佐剂的特性 使用实施例8中所述的HPLC方法来量化表13中所示的所有6个样品中Bay 15-5381的量。具有不同pH值的样品显示相同浓度的Bay 15-5381，这说明佐剂组分随着NaOH加入pH值增加并伴有絮凝期间没有降解。
实施例10:使用加速应力试验进行稳定性评价。
此实施例描述糖脂佐剂溶液的加速应力试验的方法和结果。以500L规模制备3批如实施例6中所述的糖脂佐剂溶液。所有3个批次均具有15mM的NaCl且不含NaOH。将来自这3个的500L批次的糖脂佐剂溶液使用加速稳定性试验，用于研究糖脂的稳定性。
对于加速应力试验而言，该糖脂佐剂溶液在37℃下振摇7天，然后在4℃下振摇2天。在37℃下振摇7天表示在4℃下放置1年。在4℃下振摇2天表示运输期间的应力。
一组糖脂佐剂溶液在37℃下保持静态持续7天，而后在4℃下于100rpm下另外振摇2天。在4个时间点，即T＝0、3、7和9天，记录观察结果和照片。然后在2个时间点，亦即T＝0和9天，进行折射率和粒度分析。
使第二组糖脂佐剂溶液在37℃下于100rpm下振摇7天；然后在4℃下于100rpm下另外振摇2天。在4个时间点，亦即T＝0、3、7和9天，记录观察结果和照片。然后在2个时间点，亦即T＝0和9天，进行折射率和粒度分析。
使第三组糖脂佐剂溶液在4℃下保持静态持续9天，以作为对照。在4个时间点，亦即T＝0、3、7和9天，记录观察结果和照片。然后在2个时间点，亦即T＝0和9天，进行折射率和粒度分析。
并未由于应力试验而导致粒度变化。在样品制备之后立即观察样品，所有样品均维持亚微米粒度。另外，在保持于4℃下或在37℃经受应力的样品中Bay
组分的HPLC测量未显示Bay
量的任何变化。
表15.在应力测试的后Bay
的量化。
在表15中，使对照品在4℃下保持7天，而将测试样品在37℃下振摇7天。在37℃下振摇7天的样品与在4℃下储存的样品具有相似浓度。
实施例11:糖脂佐剂溶液的杀病毒试验。
对以上实施例9所述的以30L规模制备的糖脂佐剂溶液进行杀病毒试验。此糖脂佐剂溶液含有15mM的NaCl且不含NaOH。
测试糖脂佐剂用作修饰的活病毒的稀释剂的适应性。将修饰的活病毒抗原制备为经冷冻干燥的物料。在用合适糖脂佐剂溶液使这些物料再水合时，证实所用的糖脂佐剂溶液并不杀死修饰的活病毒。试验糖脂佐剂溶液对抗3种牛病毒抗原:牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流行性感冒病毒3(PI3)和牛传染性鼻气管炎(IBR)病毒。
使用糖脂佐剂溶液，使病毒物料再水合。在室温(RT)下培育1小时之后，将样品涂于连续稀释的单层容许细胞株上。通过对出现在单层上的病毒填料计数而获得用无菌水或糖脂佐剂溶液再水合的各病毒抗原的每毫升50％组织培养感染剂量(TCID50/ml)值。在此测定中，测试的糖脂佐剂溶液再水合后效价降低0.7视为杀病毒。
结果见表16。糖脂佐剂溶液对这3种牛病毒并未显示任何杀病毒作用。
表16.糖脂佐剂溶液的杀病毒测定 此实施例显示糖脂佐剂溶液可用于动物健康疫苗的商业化制剂中。
含有利用3种修饰的活病毒抗原的三种不同的牛病毒病。这些牛病毒抗原是修饰的活牛疱疹病毒、修饰的活牛呼吸道合胞病毒和修饰的活副流感病毒3。将这些病毒抗原制成经冷冻干燥的饼状物，且本发明制备的糖脂佐剂溶液可用作这些抗原的稀释剂溶液。所用的糖脂为N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺乙酸盐。提供这些实施例以说明本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言，本发明的许多改变、变化、改进及其它用途和应用将是显而易见的。
本发明涉及含有糖脂类、弱酸、醇、非离子表面活性剂和缓冲液的稳定的佐剂稀释剂储备溶液和最终的佐剂溶液的组合物及其制备方法。
