高通量可视化全密闭分体式lamp-lfd检测芯片装置制造方法【技术领域】，属于核酸等温扩增技术和横向侧析技术的多项技术集成生物芯片【技术领域】，具体是一种高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置。。[0002]近年来随着社会发展，政府、社会、民众对自身和环境安全的要求越来越高。，每年进行的各种生物检测的样本的数量都在以惊人的速度增加。同时，对于现场快检的需求也越来越迫切。[0003]LAMP技术最早由日本科学家Notomi等(2000)建立，通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件下(60-65°C )高效(0.5-lh)扩增目标DNA。与目前广泛流行的PCR核酸扩增技术相比，该技术具有不依赖温度循环仪(PCR)等昂贵仪器，且灵敏度高，特异性好，反应速度快等优点。因此，已作为一种新兴技术用于临床疾病诊断、流行性细菌或病毒的现场快速检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。在病毒检测领域，目前已依托LAMP技术开发出用于快速诊断检测包括乙肝肝炎病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、单纯疱疹病毒在内的多种流行病毒的方法。在细菌检测领域，该技术也广泛应用于结核分支杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌的快速检测。基于Y染色体上特异序列的差异，Hirayama等利用LAMP技术开展了对牛早期胚胎性别的快速检测，将LAMP技术应用到了一个全新的领域。近年来一些科学工作者尝试将其与核酸横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)检测技术相结合(LAMP-LFD)以实现LAMP现场检测可视化。使得整个检测过程中操作者不依赖任务专门的仪器设备，只需将LAMP的扩增产物和试纸条浸入缓冲液即可实现目标产物的检测，整个操作过程简便、安全。LAMP-LFD技术一经问世，便得到众多科学工作者的亲睐。尤其在水产养殖病害检测领域，目前已经被成功用于桃拉病毒(Tarurasyndrome virus, TSV)、对奸白斑病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonercrosis virus, IMNV)等病毒病原的检测。随着该技术的日益发展，两个阻碍其在基层的应用推广的瓶颈问题也逐渐凸显出来。首先是LAMP的灵敏性带来的气溶胶污染问题。由于LAMP方法对于靶序列的扩展灵敏且扩增量大，同时在进行LFD检测过程中常要涉及到开盖取样等过程，因此在实际应用过程中极易造成气溶胶污染，进而造成检测结果假阳性的产物。为应对这一问题，对于LAMP技术目前在实际应用过程中一般要求“要严格分区，规范操作”。即，根据LAMP操作流程将实验区分为“样品处理区，溶液配制区，模板添加区，检测区”，而且在操作过程中要严格按照模板最后加入，先阴性、后阳性，从低到高的浓度进行操作。对于这样严格苛刻的要求，在实际基层使用过程中很难做到，从而使得该技术在基层现场检测中难于推广。其次是高通量，多靶点问题。目前的技术方法只能对样本进行逐个的，单靶点的检测。而在实际使用过程中，用户常常要面对是几十甚至上百个样本的不同靶点的同时检测。现有的LAMP技术就显得无能为力了。因此，如何合理的避免实际检测过程中的气溶胶污染，同时又能解决LAMP技术的高通量，多靶点的问题，成为能否推动LAMP技术在检测领域的快速发展并最终真正服务于基层检测单位的一个绕不开，也躲不过的问题。实用新型内容[0004]本实用新型所要解决的技术问题是提供高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置，具有结构简单合理、高通量、多重性、多靶点、操作灵活方便快捷的特点。[0005]本实用新型解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置，其特征在于:该检测芯片系统装置是由与离心机相连接实现均匀混料的混均收样池、分体可拆装的芯片反应盒以及可视化的LFD反应盒三部分组成，
[0006]混均收样池为圆盘形，其上端面设有用于加样的第一毛细管道，混均收样池内设有多层混合均匀槽，混均收样池的外侧周向分布有多个用于连接芯片反应盒的分配口 ；
[0007]芯片反应盒的前端设有与混均收样池的分配口相连接的接口，芯片反应盒内依次设有与接口相连通的第二毛细管道及反应扩增池，反应扩增池内设有与待检目标物对应的探针，并通过后端的LFD密封盖进行密封；
[0008]LFD反应盒包括一中空的壳体，壳体的前部内置有一用于刺入LFD密封盖中的双管道针头，壳体的后部分成二个上下密闭的腔体，其中第一腔体内配置有用于LAMP反应后的核酸可视化试验验证的LFD核酸试纸条，第二腔内密闭存有缓冲液试剂，第二腔体的前部设有单向阀，双管道针头的第二针管与与第二腔体的单向阀相连通，第一针管与第一腔体的LFD核酸试纸条相连通，当双管道针头的针头刺破反应扩增池的LFD密封盖后，打开单向阀，缓冲液试剂沿第二针管流入反应扩增池，并被第一针管利用虹吸原理吸入到LFD核酸试纸条上实现LAMP-LFD快速可视化反应。
[0009]作为改进，所述混均收样池是由圆盘形的上盖和圆盘形的底座对合而成，第一毛细管道设置在上盖上，第一毛细管道的一端与混合均匀槽相连通，另一端与加样装置相连，混合均匀槽设置在底座上，混合均匀槽是由若干层同心的分割圆环组成，在分割圆环上设有供料液从内槽流向外槽的缺口，分配口呈放射状均匀设置在最外层的分割圆环上。
[0010]作为改进，所述分割圆环为三层，缺口为3?4个弧形缺口，弧形缺口呈同方向弯曲地均匀间隔设置在分割圆环上，分配口内侧的最外层的分割圆环的内壁上设有抛物线形状的收纳槽，收纳槽的底部设有细孔，细孔通过分配口与芯片反应盒的接口相连通。
[0011]作为改进，所述芯片反应盒包括一两端开口的盒体，盒体的一端可拆卸地密封套设有一内设有第二毛细管道的接管，接口设置在接管的端部，反应扩增池可拆卸地密封套设在盒体的另一端，反应扩增池的前端设有与第二毛细管道相连接的毛细管道接口，在盒体内还设有与反应扩增池相连通的用于多余空气回流的缓冲卸压池。
[0012]再改进，所述反应扩增池包括圆柱形外壳，圆柱形外壳底部向内凹陷成圆柱形空腔，毛细管道接口设置在壳体前端与圆柱形空腔相连通，探针设置在圆柱形空腔内，LFD密封盖为密闭薄型材料，LFD密封盖的上端设有可将LFD反应盒的双管道针头插入后密封连接的卡槽。
[0013]进一步改进，所述缓冲卸压池的下端与反应扩增池的毛细管道接口相连通，缓冲卸压池的上端设有一弹性的密封盖，该密封盖在非密闭加样时呈现下凹状态。
[0014]再进一步改进，所述LFD反应盒的壳体上对应于第二腔体的上部或侧面设有单向阀开关。
[0015]再进一步改进，所述分配口为均匀间隔的12个，所述芯片反应盒为对应的12个。
[0016]与现有技术相比，本实用新型的优点在于:利用芯片上扩增池空间位置不同实现高通量多重性多靶点可视化全密闭可拆装分体式微量LAMP-LFD的检测芯片系统装置判别信号的有效区分，结果直观，效果明显，不需要借助其他昂贵仪器，生产制作全部采用工业化的生产，并配套设备、试剂耗材，全部采用现有常规用实验设备和耗材，应用方便，适合各类试剂检测反应，特别适合现场以及野外检测的配套需要，微剂量试剂检测技术，为检测产品低成本运行提供了有效保证，非常有利于LAMP-LFD方法在基层的推广和应用；可以根据需要实现扩增池在芯片上任意的空间排列；结构模式理论上具有无限的可扩展性，可以根据实际需求完成任意多重的LAMP-LFD有效扩增，从而满足多种核酸分子靶点的有效快速诊断；从加样到结果判定不超过lh，且操作非常简单方便，非专业人员通过简单示范就可以操作；由于采用LFD技术，可以使样品的含量低至只要含有少量核酸分子即可发现，防止出现漏检现象，有利于初筛；由于采用生物信息学原理的生物芯片技术，采取的样品不用专门分离，可以提取后直接加入高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置中，而由特异探针反应而加以验证和检测，有利于现场和野外快速检测，适应基层的推广和应用。



[0017]图1是本实用新型的检测芯片装置的结构示意图；
[0018]图2是本实用新型的混均收样池的结构示意图，其中a是上盖的结构示意图，b是底座的结构不意图；
[0019]图3是本实用新型的分体可拆装的芯片反应盒的结构示意图；
[0020]图4是本实用新型的可视化LFD反应盒的结构示意图；
[0021]图5是本实用新型实施例中对十种重要食源性致病菌进行快速分析检测的实验结果图。

[0022]以下结合附图实施例对本实用新型作进一步详细描述。
[0023]如图1-4所示，本实施例的高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置，该检测芯片系统装置是由与离心机相连接实现均匀混料的混均收样池1、分体可拆装的芯片反应盒2以及可视化的LFD反应盒3三部分组成，混合均匀器I为圆盘形，是由圆盘形的上盖11和圆盘形的底座12对合而成，其中上盖11上设有内螺纹，底座12上设有对应的外螺纹，上盖11与底座12通过螺纹连接固定，并在上盖11与底座12之间衬有密封圈；
[0024]上盖11上设有用于加样的第一毛细管道111，第一毛细管道111的一端与混合均匀槽122相连通，另一端与加样装置相连，用于加注核酸、酶等试剂及缓冲液；底座12内设有三层同心的分割圆环123，底座12上通过分割圆环123形成三个混合分割槽122，底座12的外侧周面上分布有12个用于连接芯片反应盒2的分配口 121，分配口 121呈放射状均匀间隔地设置在底座12的最外层的分割圆环123上，分配口 121上设有贯通的细孔125，分配口 121内侧的最外层的分割圆环123内壁上设有抛物线形状的收纳槽126，细孔125设置在收纳槽126的底部，在内侧和中间的分割圆环123上开有3?4个弧形的缺口 124，弧形缺口 124呈同方向弯曲地均匀间隔设置在分割圆环123上，使得料液混合后从内槽流向外槽；芯片反应盒2包括一两端开口的盒体，盒体的一端可拆卸地密封套设有一内设有第二毛细管道21的接管26，盒体的另一端设有反应扩增池22，接管26的端部设有与分配口 121相连接的接口 27，反应扩增池22可拆卸地密封套设在盒体的另一端，反应扩增池22的前端设有与第二毛细管道21相连接的毛细管道接口 25，在盒体内还设有与反应扩增池22相连通的用于多余空气回流的缓冲卸压池23，第二毛细管道21是采用内直径0.1?0.9mm的管道组成，并呈现多回路S型，反应扩增池22包括圆柱形外壳，圆柱形外壳底部呈圆弧形球面，球面与柱面呈圆滑过渡，圆柱形外壳底部向内凹陷成圆柱形空腔，毛细管道接口 25设置在圆柱形壳体前端与圆柱形空腔相连通，在圆柱形空腔内设有与待检目标物对应的探针，探针是通过生物芯片点样仪用注入-蒸发法包被在反应扩增池内，并通过后端的LFD密封盖24进行密封，LFD密封盖24为密闭薄型材料，LFD密封盖24的上端设有可将LFD反应盒3插入后密封连接的卡槽28，缓冲卸压池23的下端与反应扩增池22的毛细管道接口 25相连通，缓冲卸压池23的上端设有一弹性的密封盖，该密封盖在非密闭加样时呈现下凹状态，当密闭加样后，多余空气回流至缓冲卸压池23时候，密封盖鼓起以卸压并保证多余空气不被向外泄露；
[0025]LFD反应盒3包括一中空的壳体，壳体的前部呈锥形缩径部31，内置有一用于刺入LFD密封盖24中的双管道针头6，壳体的后部分成二个上下密闭的腔体，其中第一腔体33内配置有用于LAMP反应后的核酸可视化试验验证的LFD核酸试纸条5，第二腔内32密闭存有缓冲液试剂，第二腔体32的前部设有单向阀4，壳体上对应于第二腔体32的侧部设有单向阀开关41，双管道针头6的第二针管62与第二腔体32的单向阀4相连通，第一针管61与第一腔体33的LFD核酸试纸条5相连通，当双管道针头6的针头刺破反应扩增池22的LFD密封盖24后，打开单向阀4，缓冲液试剂沿第二针管62流入反应扩增池22，并被第一针管61利用虹吸原理吸入到LFD核酸试纸条5上实现LAMP-LFD快速可视化反应。
[0026]下面利用本实用新型的检测芯片装置对十种重要食源性致病菌进行快速分析检测以检验本实用新型的使用有效性。基本操作步骤如下:
[0027]I)包埋探针:在高通量可视化全密闭分体式LAMP-LFD检测芯片装置中反应扩增池内预包埋探针。首先在第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的反应扩增池中，用博奥生物公司生产的晶芯PersonalArrayerl6个人点样仪个人点样仪(型号:ADV_10006ADV)包被上针对(霍乱弧菌、单核李斯特菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、出血性大肠杆菌、创伤弧菌、耶尔森氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、沙门氏菌十种目标物的适用于LAMP扩增的引物，并在加环引物上标记用于后续LFD检测的荧光素。在第11扩增池中包被标准核酸阳性探针，第12扩增池中不包被核酸探针。
[0028]2)密封加样:用密闭加样装置系统将待测样本、酶、和LAMP反应缓冲液混匀加注至混均收样池I后，再通过离心机均匀离心到各个芯片反应盒2的反应扩增池22中，完成LAMP反应体系的密闭加样过程。
[0029]3)恒温扩增:将本实用新型的检测芯片系统装置放置在于恒温水浴锅中，60-65 °C 下恒温鮮育 40-60min。
[0030]4)结果判断:将可视化LFD反应盒3的双管道针头6刺破插入芯片反应盒2中的反应扩增池22LFD密封盖24里面，打开缓冲液上的单向阀开关41，缓冲液沿双管道针头的第二针管62流入反应扩增池22，LAMP等温扩增反应后的反应物与LFD试剂盒反应，并被第一针管61上的试纸条利用虹吸原理吸入到LFD核酸试纸条5上反应，杂交液浸入核酸横向流动试纸条(LFD)，显色检测，判断LAMP扩增结果，完成LAMP-LFD快速可视化反应。
[0031]实验结果如图5所示，在包被有目标物探针的反应扩增池22中反应物与LFD作用反应；LFD检测线上出现特征性反应带，而在没有包被核酸探针的扩增池对应的LFD没有出现反应带。