核酸等温扩增产物的可视化检测方法[0002]随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸等温扩增技术，尤其是核酸环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP),由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快的特点,在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导扩增的主要原理基于对靶序列的6个区域设计2对特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在65°C左右的等温条件下保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟。用于LAMP扩增的3对引物对应于靶基因的8个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。[0003]目前，环介导等温扩增产物的检测手段主要有电泳法、浊度法、荧光染料法、免疫侧向层析试纸以及浊度仪。电泳法需要用高致癌性的荧光染料如溴化乙锭，既危害操作人员的健康，又可产生交叉污染；由于扩增反应产生的浑浊度不明显，浊度法检测容易受检测人员主观因素的影响；荧光染料法主要是基于扩增产物DNA进行检测，而LAMP反应需要多对引物，引物二聚体的产生是不可避免的，也就无法排除假阳性问题；免疫侧向层析试纸需要扩增反应后开盖上样层析，不能克服气溶胶污染问题；实时浊度仪的市场价格超过40万，远高于PCR仪的价格，限制了该技术在基础检测部门、医疗部门的推广应用。因此，设计简便易行的不开盖检测方法，可在基层部门快速推广应用LAMP技术。
[0004]本发明的目的是:提供两种核酸等温扩增产物的可视化检测方法。[0005]本发明的技术方案是:暂略。[0006]本发明的有益的积极效果: 核酸等温扩增产物的可视化检测方法可广泛用于下列领域有关生物的特异基因的快速检测。可用于人致病性病原体的检测，包括牙銀B卜啉单胞菌O0OrjDAjTOffiOftasgingivalis, Pg)、福赛坦氏菌(ra/wereJJa forsythia, Tf〕、齿垢密螺旋体(denticola, Td)、|^肠球菌iEnterococcus /aecaJis)、伴放线放线杆菌iActinobacillusactinomycetemcomi tans, Aa)、变形链球菌{Streptococcus mu tans) ^ 远缘链球菌{Streptococcus sobrinus)^i Aggre`gatibacter ( Actinobaci 11 us)
actinomycetemcomitans)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、卩齿蚀艾肯菌iEikenellacorrodens),具核梭杆菌iFusobacterium nucleatum)、解肝素普氏菌^Prevotelintermedia) -口 P誉沫 P誉 IftI 杆 M (Aggrega ti bac ter actinomycetemcomi tans)、ifx 结核耶尔森氏鬼 Hrsinia pseudotuberculosis)^ 由结核分枝杆舊{Mycobacteriatuberculosis)^ 牛分枝杆菌{Mycobacterium bovis、、非洲分枝杆据{Mycobacteriumafricanum )和田鼠分枝杆菌iMycobac terium micro ti )组成的结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)、鸟结核分枝杆菌應沒Ki應)、胞内分支杆菌{Mycobac teri umin tracellulare )、堪萨斯分支杆菌{Mycobac teri umkansasi i )、戈登分支杆 HMycobacteriumgastr1、、军团菌 HLegionella species)、志贺氏菌{Shigella、、侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli )、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)和大肠杆菌普通株(commonstrains of Escherichia coli )、月市炎链球菌{Streptococcus pneumoniae)、艰难梭菌{Clostridium difficile, C.(6/)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )Λ 幽门螺旋杆菌 ihelicobacter pylori, H.pylori 或Hp) (Minami et al, 2006)、流感嗜血杆菌(故請<9/7力/7^5*和副流感嗜血杆菌
{Haemophilus parainfluenzae)Λvero 毒素大肠杆菌(toxin-producing Escherichiacoli )、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和产肠毒素金黄色葡萄球菌(enterotoxigenic Staphylococcus aureus )、产毒素霍乱弧菌(cholera toxin-producing Vibrio cholerae)、豚鼠气单胞菌{Aeromonas类鼻疽伯克霍尔德氏菌(及pseudomalIe1、、！孤鹤曲
杆菌(Campylobac ter jeJuni )、结肠弯曲杆菌(Campylobac ter coli)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter /fetes)、沙门氏菌09(fe7彻09)、布鲁氏菌(份spp)、创伤弧菌(KzT?_ri(9西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、人类疱疫病毒 6 型(human
herpesvirus)、急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(severe acute respiratory syndrome(SARS) coronavirus)、水痘-带状疱疫病毒(varicella-zoster virus, VZV)、流感病毒 A 型(human influenza A viruses)和流感病毒 B 型(human influenza B viruses)、月思腺炎病毒(mumps virus)、登革热病毒(dengue virus)、麻疫病毒(measles virus)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)、流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)、诺如病毒(norovirus, NV)、风疫病毒(rubella virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、腺病毒(adenovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)、人细小病毒 B19 型(human parvovirus B19)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)、猴痘病毒(Monkeypox Virus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeciency virus type 1，HIV-1)、兽棚病毒(flock housevirus, FHV)和导致肾移植患者发生多瘤病的病毒(BK virus)、非洲锥体虫trypanosomes )、布氏网比亚维虫(Trypanosoma brucei gambi ense )、布氏罗得西亚维^ (Trypanosoma brucei rhodesiense)^ 恶性症原虫{Plasmodium falciparum)、月市抱子虫{Pneumocystis pneumonia)、恙虫东方体tsutsugamushi)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii )等。
[0007]可用于鱼贝类致病性病原体的检测，包括对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus, WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus)和、斑节对奸的黄头病毒(Yellow head virus)、鱼虹彩病毒(fish iridovirus)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGVO、大隻赞 iScopktkalmus maximus)红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRBIV)、传染性造血器官坏死症病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)、锦鲤疱疫病毒(Koi herpesvirus,KHV)、皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus, IHHNV)、罗氏沼奸诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirusj MrNV)、小病毒颗粒(extravsmall virus, XSV)、锦鲤疱疫病毒(Koi herpesvirus, KHV)、鲤春血症病毒(spring viraemia of carp virus, SVCV)、诺如病毒(norovirus)、迟纯爱德华氏菌 iEdwardsiella tarda )、叉尾鮰爱德华菌{Edwardsiella ic talari )、柱状黄杆菌 iFla vo bac teri um columnare )、脚鱼诺卡氏菌(M)Cardia seri olae )、鲁克氏耶尔森氏菌{Yersinia ruckeri )、鲑鱼肾杆菌{Reni bac teri um salmoninarum ) Λ 黑美人弧菌(Vibriο nigripulchri tudo )、微抱子虫(Microspori)、粘抱子虫(Tfe tracapsuloidesbryosalmonae )和脑粘体虫cerebral is)等。
[0008]可用于农牧养殖业中病原体的检测，包括猪水泡病病毒(Swine VesicularDisease Virus, SVDV)Λ 猪圆环病毒(porcine circovirus type 2， PCV2)、猪痕(classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪细小病毒(porcineparvovirus, PPV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、H5N1 禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus)、H9 禽流感病毒(H9 avian influenza virus)、鸭痕病毒(duck plagues virus, DPV)犬痕热病毒(Canine Distemper Virus)、犬细小病毒(canine parvovirus)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus, BLV)羊传染性脓疱病毒(orf virus)、锥体虫(trypanosomes)、犬吉氏巴贝斯电XBabesiagibsoni )、马泰勒电XTheileria equi )、驽巴贝斯虫iBabesia cabalIi )、环形泰勒焦^iTheileria annul at a)、吕氏泰勒虫luwenshuni, UTRlu8)、尤氏泰勒虫{Theileria uilenbergi, UTRu6)、牛巴贝西虫属寄生虫(bovine Babesia parasites)、隐抱子电SCryptosporidiunf)、绦虫(Taenia)、副结核分枝杆寬 Ufycobacteriumpara tuberculosis )、(Lep tospira )等。
[0009]可用于植物病源微生物的检测，包括番煎黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus, TYLCV)、番煎斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)、病毒马铃薯病毒Y型(Potato virus Y，PVY)、李树和桃树的李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、柑橘青果病细菌(Citrus Greening Organism)、柑橘黄龙病病原类细菌(Liberibacter SpeciesAssociated with Citrus Huanglongbing)、JH科雷尔氏菌solanacearum)Λ^枯菌應)及疫霉属的栎树粹死病菌raffior應)等。
[0010]可用于食品中病源微生物的检测，包括沙门氏菌(Salmonella)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ) Λ 錯状芽抱杆菌{Bacillus cereus ) Λ 创伤弧菌(Vibriovulnificus、、小肠结肠炎耶尔森氏菌enterocolitica )Λ弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)金黄色葡萄球菌iStaphylococcus aureus)Λ 单增李斯特菌{Listeria monocytogenes)、志取氏UShigella.Spp)和大肠杆菌 O157 = H7 {Escherichiacoli O157=H7)等。[0011]核酸等温扩增产物的可视化检测方法具有下列各项优点:
克服了气溶胶污染问题，由于试剂I或试剂2是提前加入到反应体系中，实现了不开盖检测。
[0012]不存在引物二聚体引起的假阳性问题，原因是试剂I或试剂2检测是核酸等温扩增的副产物而不是扩增产物DNA。
[0013]检测结果形象，直观准确。反应结束后，反应体系由红色变为蓝色，或由橘红色变为黄色，为阳性，颜色保持不变为阴性，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
[0014]核酸等温扩增产物的可视化检测方法，既克服了气溶胶污染，又解决了引物二聚体引起的假阳性问题，广泛适用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、基层卫生医疗部门、食品质量监督部门和食品企业等各层次的需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
[0015](四)


图1:1-(1-羟基-2-萘偶氮)-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸钠或其衍生物检测结果示意图。
[0016]图2:4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐或其衍生物检测结果示意图。
[0017](五)具体实施例
核酸等温扩增产物的 可视化检测方法可广泛用于可用于人致病性病原体的检测、鱼贝类致病性病原体的检测、农牧养殖业中病原体的检测、植物病源微生物的检测以及食品中病源微生物的检测。
[0018]核酸等温扩增产物的可视化检测方法的实施方法
将1-(1-羟基-2-萘偶氮)-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸钠或其衍生物(以下简称试剂I)或4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐或其衍生物(以下简称试剂2)可直接加入LAMP反应体系中，59-65°C扩增20-60分钟。
[0019]核酸等温扩增产物的可视化检测方法的实施检测反应原理
环介导等温扩增反应开始时，试剂I与镁离子结合成为红色络合物，随着反应的进行，环介导等温扩增副产物焦磷酸根大量产生，与镁离子形成沉淀，试剂I失去镁离子后，由红色变为蓝色，参见图1 ;环介导等温扩增反应开始时，试剂2与镁离子结合成为橘红色络合物，随着反应的进行，环介导等温扩增副产物焦磷酸根大量产生，与镁离子形成沉淀，试剂2失去镁离子后，由橘红色变为黄色，参见图1和图2。
[0020]实施例1:
人致病性结核分支杆菌特异性基因IS6110的扩增检测 引物设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出志贺氏菌特异性基因IS6110的812位一1045位核酸序列，针对该片段的八个位点(这八个位点分别:812 -831bp、847 - 865 bp、872 - 889 bp,904 - 925 bp,946 - 965 bp,967 - 986,996-1015 bp 和 1029 - 1045 bp)设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物；引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成。
[0021]正向外引物F3 — IS6110 AGACCTCACCTATGTGTCGA 反向外引物 B3—IS6110 TCGCTGAACCGGATCGA
正向内引物 FIP — IS6110 ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAGTTTTCCTACGTGGCCTTTGTCAC反向内引物 BIP — IS6110 AAGCCATCTGGACCCGCCAATTTTCCCCTATCCGTATGGTGGAT 正向环引物 LF — IS6110 AGGATCCTGCGAGCGTAG 反向环引物 LB — IS6110 AAGAAGGCGTACTCGACCTG 反应体系(反应总体积为25μ1 )