技术领域
本发明涉及检测铜绿假单胞菌血清型特异性的方法，铜绿假单胞菌血清型特异性的试剂盒，以及在上述方法或试剂盒中所用的寡核苷酸本发明进一步涉及用于患有由特定的铜绿假单胞菌血清型导致的疾病的患者的铜绿假单胞菌感染的血清型特异性治疗的铜绿假单胞菌血清型特异性抗体发明背景铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种在水和土壤中发现的普遍存在的革兰氏阴性环境细菌它是一种典型的机会致病菌，通常不会对免疫活性宿主构成威胁， 免疫活性宿主通过调节抗体和吞噬作用清除它然而，囊胞性纤维症患者和免 疫功能低下的个体-包括烧伤患者、在重症监护病房的气管插管的患者，癌症和艾滋病患者以及接受器官移植的病人，感染医源性感染如感染铜绿假单胞菌的风险特别高这些患者中严重的感染能迅速致命，由铜绿假单胞菌感染造成的“呼吸机相关性肺炎”的死亡率达33-50%更重要的是，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性显著提高例如，抗第三代头孢菌素头孢他啶的铜绿假单胞菌菌株的比例已经从1995年的12%增加到2001年的29%再加上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)，铜绿假单胞菌在医源性感染中占 34%，该感染已经从1975年7. 2 / 1000患者日感染量增加到9. 8 / 1000患者日感染量 其中最常见的医源性感染形式为血流感染和肺炎在抗生素耐药性增加的背景下，用于被动免疫以抗铜绿假单胞菌感染的人类单克隆抗体的运用是一个新的可期待的途径已经证明，针对革兰氏阴性细菌表面的主要成分-O-抗原特异性碳水化合物的抗体在特异的防止由铜绿假单胞菌引起感染中，是重要的介质由于O-抗原外部碳水化合物层具有不同的血清型，因此需要有多种血清型特异性抗体，以提供广泛的防止铜绿假单胞菌感染的保护目前有很多用于区分不同铜绿假单胞菌血清型的方案通常可接受的国际抗原分型方案(IATS)是基于O-抗原特异性脂多糖(LPS)相关碳水化合物的血清学特性目前至少已经描述了 20种不同的O-抗原血清型已经证明大多数医源性铜绿假单胞菌感染与特定血清型相关虽然不同国家之间血清型发病率不同，但流行病学调查表明，血清型 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll 和血清组 2 (IATS-02，IATS-05, IATS-016)是最常见的，占铜绿假单胞菌临床分离株的70%为了采用O-抗原特异的以及类似的血清型特异性抗体治疗铜绿假单胞菌感染的患者，一个基本的要求是在抗体治疗之前确定感染的铜绿假单胞菌菌株的血清型为了检测铜绿假单胞菌感染，诊断培养被认为是黄金标准但是，用传统的细菌培养方法检测假单胞菌需要长达2天时间不幸的是，培养后的菌落的形状，大小和形态都不能进行血清型识别血清学方法对于清楚的血清型识别存在较高的错误率例如，玻片凝聚血清型测定方法不仅耗时，所得的结果在很大程度上依赖于操作者的经验和表述，并且还受到自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制市场上最可靠的血清分型试剂盒存在约30%的失败率，这些铜绿假单胞菌株由于自凝聚或非凝聚而被归为“不可分类”菌株这种标准的微生物分析方法在合理的时间范围内可靠识别铜绿假单胞菌以及相关血清型的能力很有限假如一个患者遭受了由耐抗生素型铜绿假单胞菌引起的感染，用于血清型鉴定的时间非常关键，因为随着持续感染，死亡率会急剧上升因此，医疗中迫切需要有快速的血清型鉴定方法，以减少诊断与血清型特异性抗体治疗之间的时间目前，通过生物芯片、微阵列或PCR技术的分子检测已经成为快速鉴定铜绿假单胞菌以及其他导致医源性感染的细菌种类的常规方法在这些方法的步骤中采用了包含独一无二的、种特异性的标记序列的基因迄今为止，许多PCR方法通过采用能与例如16S rRNA或23S rRNA的部分区域特异性退火的寡核苷酸序列来靶定系统发育基因和功能基因然而，采用这些种特异性分析进行特定血清型鉴定是不可能的US20080026370公开了寡核苷酸探针，其用于在一个生物芯片或微阵列上杂交分析铜绿假单胞菌的致病型和基因型，但未公开血清型分型方法W09741234公开了属于铜绿假单胞菌的LPS O-抗原基因簇的不同基因的特性提供的是一个通过PCR检测样品中的血清型01至020的方法，包括采用一个能够扩增包括编码PsbM(WbpM),或PsbN(WbpN)的核苷酸序列的核苷酸分子的探针来处理样品未公开用于可靠区分不同铜绿假单胞菌血清型的特异性寡核苷酸序列因此，现有技术中所知的用于鉴定特定铜绿假单胞菌血清型的方法具有严重的缺占-^ \ ·铜绿假单胞菌的微生物分析方法耗时而且受自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制已知的用于常规细菌菌株基因型或血清型分析的分子方法不能在细菌种内进行可靠的鉴定和区分尽管一些基因例如核糖体基因(16S rDNA, 23S rDNA)，在不同种之间具有同源性，但是利用代表这些基因的保守寡核苷酸序列进行一个细菌种内的这些血清型分型和鉴定也是不可能的因此，急需快速可靠的专用于细菌种类以及最常见的铜绿假单胞菌血清型的铜绿假单胞菌血清型检测方法为了区分细菌定殖(彡103_6cfu/ml)和感染(>106cfu/ml)，需要在至少六个数量级的范围内确定铜绿假单胞菌的细菌含量因此，还需要在一个宽的模板浓度范围内能进行可靠的铜绿假单胞菌的检测分析在单个反应中同时进行几种铜绿假单胞菌血清型(尤其是 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll和血清组2)的检测在技术上难度很高，由于每种血清型检测的引物对和探针对之间会相互影响，经常导致不能达到临床所需的检测精度令人惊喜的是，根据本发明已经发现的寡核苷酸，并利用该寡核苷酸的方法和试剂盒，采用血清型特异性引物能够可靠快速地进行铜绿假单胞菌的种及血清型鉴定发明内容因此，本发明的技术问题是提供一种快速的、准确的、灵敏的和可靠的特异性检测临床上最常见的铜绿假单胞菌血清型的方法该技术问题通过提供以下寡核苷酸，以及采用如下定义的寡核苷酸的检测方法和试剂盒来解决根据本发明，提供一种用于样本 铜绿假单胞菌血清型特异性检测的方法，包括如下步骤a)使至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物与样本的一个靶标核苷酸退火，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物选自由以下构成的组(i)含有SEQ ID No. I所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，(ii)含有SEQ ID No. 3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，(iii)含有SEQ ID No. 5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及(iv)含有SEQ ID No. 7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No. 8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，b)扩增靶标核苷酸，并且c)检测扩增的所述假单胞菌的靶核苷酸本文中所用的术语“铜绿假单胞菌血清型”指铜绿假单胞菌外层碳水化合物脂多糖(LPS)中存在的一种特异性O-抗原成分作为血清型特征在不同的铜绿假单胞菌之间，其外碳水化合物层，特别是O-抗原株明显不同基于O-抗原的差别，至少有20 种不同血清型被报道(Rivera et al.，1992)最常见的铜绿假单胞菌血清型是血清型 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll 和血清组 2 (IATS-02，IATS-05, IATS-016)本文中所用的术语“血清型特异性检测”指一个或多个上述最常见的铜绿假单胞菌血清型的检测和鉴定根据本发明，检测是通过扩增技术分析感兴趣的样品现有技术中描述过很多此类扩增技术，包括聚合酶链反应(PCR)技术或连接酶链反应(LCR)技术对于本领域技术人员而言，使用该类扩增技术是常规工作，并且在本文中表示与扩增有关的技术优选的基因扩增技术是PCR，更优选的是实时定量PCR(real-time PCR)，最优选的是多重实时定量PCR(real-time PCR)或基于LightCycle的实时定量(多重)PCR本文中所用的术语“引物”、“寡核苷酸引物”或“引物对”指用于前文提及的扩增技术以扩增DNA靶标序列的短寡核甘酸(典型的10-50bp，优选15-35bp)本发明的引物指SEQ ID Nos I 8任一所示的核苷酸序列的分子中至少10，11，12，13，14，15，16，17，18 ，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34 或 35 个连续核苷酸·本文所定义的引物或寡核苷酸引物采用现有技术合成而得，例如磷酸三酯法或磷酸二酯法(Gait et al.，1980)，或自动合成法(Conolly，1987)本文所用的术语“铜绿假单胞菌血清型特异性引物”指在被置于允许核苷酸序列扩增的条件时能够作为合成起始位点的引物，其与编码血清型特异性靶点(如O-抗原位点)的DNA对应或者互补允许引物延伸产物合成的条件包括存在核苷酸底物、聚合剂(如 DNA聚合酶)和适合的温度、pH优选的引物不会与引物的其它拷贝发生碱基配对，并且不会形成发卡结构的那些引物所述引物的长度约10-50个核苷酸，优选15 - 35个核苷酸本发明提供如上所述的一种方法，其中所述检测步骤还包括将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与所述至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤所述退火步骤选自本文定义的方法中的退火步骤a)杂交技术是现有技术，例如在 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. inMolecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989(Nolan C, Ed. ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.中有实例的描述根据一个优选实施例，所述“将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与所述至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤所述退火步骤选自本文定义的方法中的退火步骤a) ”中，所述杂交探针选自以下构成的组(i)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 9所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 10所示序列中至少10个连续核苷酸，(ii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 11所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 12所示序列中至少10个连续核苷酸，(iii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 13所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 14所示序列中至少10个连续核苷酸，以及 (iv)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 15所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No. 16所示序列中至少10个连续核苷酸本文中所用的术语“探针”，“寡核苷酸探针”，“杂交探针”指用于通过杂交检测扩增的靶标核苷酸序列的任何核苷酸序列本发明所述的探针指短寡核苷酸(典型的为 10-50bp,最好是15-35bp)此处所用的所述探针是具有SEQ ID Nos 9 16中任一所示的核苷酸序列中至少 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 ，30，31，32，33，34或35个连续核苷酸的分子所述探针或寡核苷酸探针可通过现有技术合成而得所述探针可以连接，最好是共价连接入至少一个用于检测扩增产物的检测标签 如果对一种血清型具有特异性，并且能够杂交到第一引物退火序列上，这样的“寡核苷酸探针”代表合适的杂交探针本文所用的术语“可检测标签”不存在任何特殊限制所述可检测标签可以选自包括放射性标记、发光标记、荧光染料、具有酶活性的化合物、磁性标签、抗原，以及与可检测标签具有高亲和力的化合物适合的放射性标记有P-32，S-35，1-125，和H_3 ; 适合的发光标记物有化学发光化合物、优选鲁米诺；适合的荧光标记物优选丹磺酰氯、 f luorcein-5-异硫氰酸酯 4-氟-7-硝基苯基-2-氮杂-1，3 二唑(4_f luor-7-nitrobenz -2-aza-l, 3diazole);适合的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、α -半乳糖苷酶、 乙酰胆碱酯酶或生物素“实时定量PCR”，涉及到一个适合自动设置和数据分析的单一步骤的密闭管方法， 根据本发明的一个优选的实施例，采用了基于LightCycler的实时定量PCR以实时定量 PCR为基础的程序可同时具有初步诊断和目标定量的能力在一个优选实施例中，用于扩增步骤的一套特定的寡核苷酸序列(“寡核苷酸引物”)与一套特定的寡核苷酸序列(“寡核苷酸探针”)联合使用，以进一步提高特异性在一个最优选的实施例中，所述引物对和所述探针对选自以下寡核苷酸引物对和探针对序列中的一个或多个(i)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO I和2所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO9和10所不的序列；(ii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO 3和4所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO 11和12所不的序列；(iii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO 5和6所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO 13和14所不的序列；和(iv)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO7和8所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO 15和16所不的序列.在本发明一个优选的实施例中，检测铜绿假单胞菌血清型的步骤按以下操作·定量分析，其中细菌含量通过与已知细菌浓度的标准曲线进行对比而得出；·监控扩增曲线，其中PCR产物的成功扩增可通过信号强度的增加而观察到；·和/或熔解曲线分析，其中PCR扩增而合成的每个产物具有各自的熔解温度本发明的杂交探针提供最高水平的特异性并且允许a)通过对比标准曲线对细菌含量进行定量；b)在线·观察血清型特异性扩增；或者c)通过分析熔解曲线鉴定血清型本发明的方法具有多种实际应用例如，所述方法可对任何疑似含有较宽拷贝数量范围的铜绿假单胞菌，如来自医疗的，兽医的或环境的样本单独或同时检测最常见的铜绿假单胞菌血清型 IATS-01, IATS-06, IATS-Oll 和血清组 2 (IATS-02，IATS-05, IATS-016) 对于感兴趣的样本中的一种血清型特异性的检测，采用两套寡核苷酸序列2个引物(正向的=fwd和反向的=rev)和2个探针在本发明的一个实施例中，提供一种检测方法, 其中可同时检测两个或更多铜绿假单胞菌血清型，也称为多价或多重检测对于例如上述提到的4种最常见的铜绿假单胞菌血清型的特异性检测，在一个检测(四价检测)中采用了 4对引物和4对探针优选地，检测的铜绿假单胞菌血清型是最常见的血清型 IATS-OI, IATS-06, IATS-Oll和血清组2，其中血清组2包含血清型IATS-02, IATS-05和 IATS-016引物(正向的=fwd，反向的=rev)和探针可同时用在一个步骤中，或连续用在两个单独步骤中最优选的是本文定义的寡核苷酸序列在“四价LightCycler检测(4-valent LightCycler assay) ”中的用途术语“四价LightCycler检测”指允许同时进行4种铜绿假单胞菌血清型检测的检测，尤其是允许平行检测四种最常见的血清型 IATS-OI, IATS-06, IATS-Oll和铜绿假单胞菌血清组2此方法在单个反应中显示出非常高的特异性和敏感性但是用四价LightCycler检测可以降低不可分类菌株的量，并且所述四价检测的效果已经通过直接测定来自临床支气管肺泡(broncho-alveolar lavage, BAL) 灌洗液的样本的菌株量得到了验证在基于LightCycler的实时PCR中，扩增和检测在一个封闭的玻璃毛细管中进行，避免扩增产物交叉污染所述LightCycler达到高速热循环是通过风扇驱动空气而不是用加热块传导方式这样，约一个小时内就可获得四价铜绿假单胞菌血清型测验的结果根据本发明的铜绿假单胞菌的检测方法，特别是采用上述四价血清分型测验可以用于分离的细菌DNA，或直接检测来自临床的样品如唾液、支气管肺泡灌洗液或气管内吸入物，通常用超纯水稀释后再检测样本优选从人(例如患肺疾病的人)的肺灌洗物中直接获得临床样本也可以包括取自人体的物质如血液、尿、组织等典型地，样本可取自伤口、 烧伤、肺和人或动物感染的泌尿道铜绿假单胞菌也可在食物、土壤或水样本中检测出在铜绿假单胞菌感染的肺炎患者中，用常规方法可检测到10cfu/ml 109cfu/ml的细菌含量在临床常规中，根据获得呼吸道分泌物的方法(如肺泡灌洗物、气管样本等)， 已经对铜绿假单胞菌寄定殖或急性感染的临界点的定义有不同的说明临界点规定为，小于等于103—6Cfu/ml是细菌定殖，大于106Cfu/ml是感染(比如是肺炎)，因此需要测定的细菌含量至少要超过6个数量级的范围所以需要提供一种诊断方法，可以可靠地鉴定较宽的模板浓度范围内的铜绿假单胞菌血清型出人意料地，根据本发明，可以在模板浓度宽范围的样本中进行铜绿假单胞菌血清型检测在本发明的一个实施例中，样本中的细菌含量在lOcfu/ml到109Cfu/ml范围内是可检测的，或在 102cfu/ml 到 108cfu/ml 的范围内，或 103cfu/ml 到 108cfu/ml，104cfu/ml 到 108cfu/mlo根据本发明另一实施例，所述检测是种特异性的除另外指出，本文所用的术语“种特异性”指铜绿假单胞菌种的特异性尤其是，“种特异性检测”指经常发生的微生物(细菌，真菌或病毒)，而不是铜绿假单胞菌时，例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，大肠埃希氏菌(Chlamydophila pneumonia),肺炎衣原体(Enterobacter aerogenes),产气肠杆菌(Enterobacter cloacae),阴沟肠杆菌(Escherichia coli)， 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophiIia)，伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans),嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)，松脆厌气杆菌 (Bacterioides fragilis),巴尔通体(Bartonella henselae),百日咳杆菌(Bordetella pertussis),伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，人心杆菌(Cardiobacterium hominis)， 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza),嗜肺军团菌(Legionella pneumophila),单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes),卡他莫拉菌(Moraxella catarrhal is), 摩氏摩根菌(Morganella morganii),脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides),成团泛菌(Pantoea agglomerans)，牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis),普氏菌齿垢(Prevotella denticola),普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，肠类球菌(Enterococcus faecalis)，肠屎球菌 (Enterococcus faecium)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)，月市炎链球菌(Streptococcus pneumonia),无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes),缓症链球菌(Streptococcus mitis)，錯样芽抱杆菌(Bacillus cereus)，产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens),杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)，溶血孪生球菌(Gemella haemolysans)，组织胞衆菌(Histoplasma capsulatum)，偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum),结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),肺炎分枝杆菌(Mycoplasma pneumonia),大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus),痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes),烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，白色念珠菌(Candida albicans),光滑念珠菌(Candida glabrata)，克柔念珠菌(Candida krusei)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)， 热带念珠菌(Candida tropicalis)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans),腺病毒(Adenoviruses),抱疫病毒(Herpesviruses),正粘病毒(Orthomyxoviruses), Paramycxo viruses和小核糖核算病毒(Picornaviruses)用本发明的检测方法、试剂盒以及寡核苷酸检测不出来本发明还提供了一对能够从上述IATS 01, S2(血清组2包括IATS-02，IATS-05, IA TS-016), IATS06,和IATS 011中特异性检测一种或多种铜绿假单胞菌血清型的寡核苷酸 其中，所述成对的第一和第二寡核苷酸是SEQ ID Nos 1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、 11和12、13和14，或15和16所示的核苷酸序列中至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 ，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34 或 35 个连续核苷酸如特别地，本发明提供的寡核苷酸对选自以下组成的组a)含有SEQ ID No. I所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No. 2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，b)含有SEQ ID No. 3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No. 4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，c)含有SEQ ID No. 5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No. 6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，d)含有SEQ ID No. 7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No. 8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，e)含有SEQ ID No. 9所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No. 10所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，f)含有SEQ ID No. 11所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有 SEQ ID No. 12所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，g)含有SEQ ID No. 13所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有 SEQ ID No. 14所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，和h)含有SEQ ID No. 15所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有 SEQ ID No. 16所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸本发明的寡核苷酸具有以下表I中所示的技术特征表I
