专利名称：铜绿假单胞菌g血清型脂多糖抗体的制作方法铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种广泛并主要分布在自然环境(如土壤和水)中的革兰氏阴性需氧杆菌。铜绿假单胞菌是一种通常不引起健康受试者致病的非病原细菌，所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有适度的抗体效价和足够的免疫功能。然 而，一旦体弱患者感染了铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可引起严重的症状，其可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的主要病原菌已经引起了关注，因此，预防和治疗铜绿假单胞菌感染已经是医学领域的重要问题。为预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已经主要使用了抗生素或合成抗细菌剂。然而，铜绿假单胞菌对这些药物产成了抗药性，因此，这些药物在很多情况下不会提供足够的治疗作用。具体来说，对使用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌(MDRP)的感染是很难的，并且有局限性。为此，作为其替代方法，已经开始进行使用免疫球蛋白制剂的治疗。同时，已经检验了使用铜绿假单胞菌的抗体来预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已经开发了各自特异性结合具体血清型铜绿假单胞菌菌株的抗体(专利文献1-5，非专利文献I和2)。然而，到目前为止开发的铜绿假单胞菌抗体在铜绿假单胞菌感染的预防或治疗中尚不能提供足够的作用。引文列表专利文献专利文献I日本未经审查的专利申请公开文本平成6-178688专利文献2日本未经审查的专利申请公开文本平成6-178689专利文献3日本未经审查的专利申请公开文本平成7-327677专利文献4国际公开文本W02004/101622专利文献5国际公开文本W02006/084758非专利文献非专利文献IThe Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299。非专利文献2Journal of General Microbiology, 133，1987，3581-3590。
技术问题鉴于上述情况做出本发明，并且本发明的一个目标是提供一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新型抗体。本发明的一个主要目标是提供一种可特异性结合铜绿假单胞菌菌株G血清型脂多糖的抗体。技术方案为实现上述目标，本发明使用了下述方法。首先，从慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者和健康志愿者采集血液样本。借助如下手段确定具有高比例的对脂多糖(下文中有时简称为“LPS”)特异的成浆细胞的供体样本(I)FACS分析，其测定血液循环中成浆细胞和浆细胞的量；(2) ELISP0T分析，其测定血液循环中的细胞量，所述细胞产生对具体LPS抗原特异的抗体；以及(3) ELISA分析，其测定存在或不存在对具体LPS抗原特异的免疫球蛋白。接下来，由这样确定的供体样本制备识别LPS的抗体。具体而言，通过染色⑶19、⑶38、A轻链和死细胞 来选择活成浆细胞。在所选出的成浆细胞上，通过包含多重重叠延伸PT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR，将从相同B细胞获得编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA序列配对(图I )。接下来，将扩增的DNA插入筛选载体中，并随后转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中。从所述大肠杆菌纯化出扩增载体集合。将所获得的抗体库在动物培养细胞中表达。通过ELISA筛选编码可结合纯化的LPS分子的抗体的克隆，并选择LPS特异的克隆。随后，测定所选克隆的碱基序列。之后，对由此获得的克隆所编码的抗体检测其多种活性、其血清型特异性以及抗原表位。作为结果，发现了所确定的抗体可结合铜绿假单胞菌G血清型LPS，并且在体外和体内具有优良的抗细菌活性。具体而言，本发明涉及结合铜绿假单胞菌G血清型LPS的抗体，其显示出优良的抗细菌活性。本发明也涉及该抗体的应用。更具体而言，本发明提供了[I] 一种抗体，其可识别铜绿假单胞菌的脂多糖的B带LPS，并且其实质上可与G血清型铜绿假单胞菌菌株表面结合，但实质上不与A、B、C、D、E、F、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面分结合。[2]条款I所述的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性。[3]条款2所述的抗体，其中对ATCC 33354标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是0. 5 ii g/ml或更小。[4]条款2所述的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是g/ml或更小。[5]条款1-4中任一项所述的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的凝集活性。[6]条款5所述的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的单位量(u g) IgG的凝集效价是100或更大。[7]条款1-6中任一项所述的抗体，其对G血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染具有抗细菌作用。[8]条款7所述的抗体，其中对全身性感染ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的中性粒细胞减少症小鼠模型的抗细菌作用的ED50不超过青霉酮(Venilon)的ED50的1/100。[9]具有下述(a)- (d)特征中任一项的抗体(a)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO: 1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ ID N0:l_3中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列或在SEQ ID N0:4_6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列或在SEQ ID N0:9_ll中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及 重链可变区，其包含在SEQ ID NO: 12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(C)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO: 17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID N0:20_22中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及(d)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID N0:25_27中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID N0:28_30中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。[10]具有下述(a) - (d)特征中任一项的抗体(a)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQID N0:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQID N0:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO: 15中描述的氨基酸序列或在SEQID NO: 15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID NO: 16中描述的氨基酸序列或在SEQID NO: 16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(C)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列或在SEQID N0:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID NO: 24中描述的氨基酸序列或在SEQID NO: 24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及(d)包含轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列或在SEQID N0:31中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及重链可变区，其包含在SEQ ID NO: 32中描述的氨基酸序列或在SEQID NO: 32中描 述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。[11]包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下述(a)_ (d)特征中任一项(a)包含在SEQ ID NO: 1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO: 1-3中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含在SEQ ID N0:9_ll中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:9_11中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(c)包含在SEQ ID NO: 17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及(d)包含在SEQ ID NO: 25-27中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。[12]包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下述(a)_ (d)特征中任一项(a)包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含在SEQ ID NO: 15中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(c)包含在SEQ ID NO: 23中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及缺失、添加和/或插入。[13]包含抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下述(a)_ (d)特征中任一项(a)包含在SEQ ID NO:4_6中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:4_6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含在SEQ ID NO: 12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(c)包含在SEQ ID NO: 20-22中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及(d)包含在SEQ ID NO: 28-30中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。[14]包含抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下述(a)_ (d)特征中任一项(a)包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(b)包含在SEQ ID NO: 16中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；(c)包含在SEQ ID NO: 24中描述的氨基酸序列或在SEQ IDN0:24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及缺失、添加和/或插入；[15]在下述(a)_ (d)中任一项所述的抗体中，可与G血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖B带LPS中的表位结合的抗体(a)含有包括在SEQ ID N0:7中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQN0:8中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；(b)含有包括在SEQ ID NO: 15中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO: 16中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；(C)含有包括在SEQ ID N0:23中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQNO:24中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；以及含有包括在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:32中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体。[16]编码根据条款1-15中任一项的抗体或肽的DNA。[17]产生根据条款1-10和15中任一项的抗体的杂交瘤细胞。[18]用于与铜绿假单胞菌相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据条款1-10和15中任一项的抗体；以及任选至少一种可药用载体和/或稀释剂。[19]根据条款18所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。[20]根据条款18所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的肺部感染疾病。[21]用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含根据条款1、9、10和15中任一项所述的抗体。[22]用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含根据条款1、9、10和15中任一项所述的抗体。有益效果本发明提供了可结合铜绿假单胞菌G血清型LPS并显示出优良的抗细菌活性的抗体。本发明的抗体可对铜绿假单胞菌的全身性感染或肺部感染显示出优良的调理素作用和优良的抗细菌作用。本发明的抗体可制备为人抗体，因此是高度安全的。同时，通过结合本发明的抗体可制备出对70%或更多临床分离的菌株有效并且显示出强抗细菌活性的革命性多克隆抗体。本发明抗体的应用使得可有效治疗或预防由铜绿假单胞菌(包括耐多药铜绿假单胞菌)引起的感染，例如HAP/VAP、菌血症、败血症以及烧伤伤口感染。图I图I是显示了实施两步PCR以获得编码本发明抗体的DNA的图。图2图2是显示了用于将编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列进行配对的00-VP-002载体的图，所述重链可变区和轻链可变区来自于相同B细胞。



本发明提供了一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新型抗体。通过使用从患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者获得的成浆细胞作为起始原料，成功地获得了可与G血清型铜绿假单胞菌菌株LPS结合且在体外和体内具有优良的抗细菌活性的抗体。