专利名称：多糖硫酸酯作为制备抗流感病毒药物的应用的制作方法流感是流感病毒引起的严重危害人类健康的一种急性病毒性呼吸道传染病，被称为致死率最高的病毒性传染病之一。历史上流感曾有过几次大规模流行，给人类带来了深重灾难。尽管已有多种治疗药物问世，但是流感的危害性及其造成的损失仍不容忽视。流感。我国是流感多发地，基本上每年都有局部爆发流行。为此，我国卫生部已将流感列为“十五”期间重点监控的疾病之一。流感病毒是由两种表面糖蛋白-血凝素和神经氨酸酶包围的微粒，属于正粘病毒家族，抗原变异是它最显著的生物学特征，根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原型差异可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中A型流感病毒按血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原性差异分为若干亚型(HxNy)。H1N1和H3N2亚型和B型流感病毒是近十年引起人类流感暴发和流行的主要病原。流感疫苗接种是目前预防流感的唯一措施。常见的流感疫苗有灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗(或称载体疫苗)、亚单位疫苗、合成寡肽疫苗和核酸疫苗。现在临床使用的流感疫苗是失去感染性的灭活疫苗。由于流感病毒抗原易变异，而且由于目前尚缺乏可靠的方法对流感发生与流行的周期性进行有效预测，因此接种流感疫苗的措施仍具有局限性。治疗流感的药物研究已取得较大进展。目前，已经应用和正在研究的抗流感病毒药物有金刚烷胺类药物、神经氨酸酶抑制剂，流感病毒受体阻断剂等。金刚烷胺和金刚乙胺是常用临床治疗药物，仅对A型病毒有效，对B型流感病毒无效，且易产生耐药性并具有神经毒性。1999年由美国FDA批准用于临床的Zanamivir(GG167或Relenza)和Oseltamivir(GS4104或Tamiflu)为神经氨酸酶(NA)抑制物，主要用于早期治疗，对甲、乙型流感均有效。然而，这两种药物对具有合并症的流感疗效较差，因此这两种药物尚未广泛加以应用。鉴于流感病毒的危害性，针对预防和治疗流感病毒的药物的研究受到了特别的重视。多糖硫酸酯是指糖羟基上带有硫酸基团的多糖，也称为硫酸多糖或硫酸酯化多糖。近年来，多糖的抗病毒作用已引起医药界的高度重视，尤其是多糖硫酸酯的强抗病毒活性，显示了广阔的药用前景。据有关文献报道，具有强阴离子基团的多糖类物质抗被膜病毒(Envelopedvirus)的主要机理是抑制被膜病毒向宿主细胞的吸附与侵入，即多糖硫酸酯靠静电作用与被膜外膜蛋白结合，占据了被膜病毒与受体细胞结合的部位，从而使被膜病毒不能感染细胞。病毒吸附到细胞原生质膜是一种与静电作用有关的受体识别过程，需要细胞表面与病毒间的分子亲和力[Fenner，1974]。多糖硫酸酯能与艾滋病病毒HIV-1外壳糖蛋白的gp120的阳离子区域结合，占据被膜病毒与宿主细胞受体部位，从而阻止病毒与宿主细胞的结合[周靓1997]。对抑制作用模式的研究表明，病毒对宿主细胞的吸附被硫酸聚阴离子阻断[Liebhaber1963，Schulze 1964，Takemoto 1964，Baba 1988，Neyts 1992，Mitsuya 1988，Schols1990]。当存在多聚阳离子如DEAE-葡聚糖和鱼精蛋白时，抑制作用可被阻止或反转。多糖硫酸酯还抑制病毒进入细胞或进入细胞后复制的某一步骤[周靓1997]。流感病毒与HIV等同属于被膜病毒。葡聚糖有α-D-(1→4)、β-D-(1→4)、α-D-(1→3)、β-D-(1→3)、α-D-(1→6)等多种糖苷键连接类型。各种葡聚糖硫酸酯由于在分子量、分子侧链、糖苷键类型、硫酸键类型、单糖硫酸酯个数(取代度)等方面的差异，使其具有不同的功能。如可作为抗凝血剂(US2715091，分子量为22000-200000、取代度最高为3.0)；抗轮状病毒(WO96/30027)；抗艾滋病病毒(US5861383和EP0406512，分子量为500000，一般为75000；EP0293826分子量为5000、8000、90000、200000；CN1206717A，β-D-(1→4)-葡聚糖硫酸酯)；抗单纯疱疹病毒(WO94/15624，分子量为50000-500000，糖苷键为α-D-(1→4)或β-D-(1→4))；抗肿瘤(CN1283632A，α-D-(1→3)-葡聚糖硫酸酯)等。α-D-(1→6)-葡聚糖(Dextran，右旋糖苷)硫酸酯及其他葡聚糖硫酸酯的抗流感病毒活性未见报道。耳突麒麟菜(Eucheume cottoni)是重要的一类红藻，其主要成分为卡拉胶(Carrageenan，具有部分硫酸酯基团的聚D-半乳糖-3，6-内醚-半乳糖硫酸酯)。1958年Gerber等人首次提出海藻含有天然抗病毒活性物质。从GelidiumCartilagenium提取的未经化学修饰的天然多糖可保护受孕卵免受流行性腮腺炎病毒和A型流感病毒的侵染。80年代末科学家研究发现有几种聚阴离子物质(天然的或半合成的红藻多糖硫酸酯)是艾滋病病毒(HIV)复制的有效抑制剂，引起了人们对多糖硫酸酯抗病毒作用研究的兴趣，从多种红藻中也发现了对单纯疱疹病毒HSV1和HSV2具有抑制作用的多糖。对39种加利福尼亚红藻抗鼠白血病病毒筛选中发现，Schizymenia提取物具有抗逆转录病毒活性，对水提取物及其级分进一步的研究发现，卡拉胶确实是抗病毒活性成分。另外，一些专利中提到卡拉胶或其硫酸酯抗单纯疱疹病毒的作用(WO94/15624)、抗HIV的作用(WO88/06396，EPA293826)、抗HIV以及其它DNA和RNA病毒(GB2262531)、抗轮状病毒(WO96/30027)等，并与纤维生长因子协同抗单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、森里基森林病毒、艾滋病病毒和莫洛尼氏肉瘤病毒等(EP0497341A2，分子量大于1000万)。对天然耳突麒麟菜多糖硫酸酯抗B型流感病毒未见报道；对经化学加工得到特定分子量、特定单糖硫酸根取代度的耳突麒麟菜多糖硫酸酯抗A型和B型流感病毒也未见报道。
坛紫菜(Porphyra haitanensis)是产于我国南方的一种重要经济红藻。紫菜多糖具有明显的抗凝血、降血脂、抗血栓、强心作用，还具有抑制肿瘤、降低血糖、抗炎和防治溃疡等作用，据报道紫菜多糖还具有明显增强细胞免疫和体液免疫的功能，但有关紫菜多糖硫酸酯用于抗流感病毒的研究未见报道。
在已报导的文献及专利中，有关天然海洋红藻多糖(包括卡拉胶和坛紫菜多糖)经化学修饰和处理制得的平均分子量为1000到100000、单糖硫酸根取代度为1.0至3.0的红藻多糖硫酸酯(卡拉胶多糖硫酸酯、紫菜多糖硫酸酯)和α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯对流感A型及B型病毒的单独抑制或协同抑制作用，未见报导。


本发明的目的在于公开多糖硫酸酯在抗流感病毒中的应用，并制备α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯(平均分子量范围为1000-100000，单糖硫酸根取代度0.2-3.0)和海洋红藻多糖硫酸酯如卡拉胶多糖硫酸酯(平均分子量范围为1000-100000，单糖硫酸根取代度1.0-3.0)和紫菜多糖硫酸酯(平均分子量范围为1000-100000，单糖硫酸根取代度0.5-3.0)为实用药物剂型，确定了这些多糖硫酸酯具有单独或协同抗A型和B型流感病毒的用途。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下(1)称取一定量的耳突麒麟菜，粉碎后于95℃水提3h，粗提液经离心后收集上清液，加入适量KCl，离心分离沉淀物。沉淀物用水溶解后用乙醇再次进行沉淀后过滤，过滤物于50℃真空干燥，磨成细粉，得卡拉胶粉末。
(2)称取一定量干燥紫菜，加水浸泡过夜，捣碎后置-20℃冰冻，取出后微波解冻，如此重复3次后，于60℃水浴中搅拌提取30min，离心，上清液经减压浓缩，干燥得粗多糖。粗多糖经732阳离子交换树脂法除蛋白，得到精制紫菜多糖。
(3)称取(1)所制备的卡拉胶或市售卡拉胶(分子量一般大于50万，单糖硫酸根取代度为0.3-0.8)或(2)所制备的紫菜多糖，配成2-15％的溶液，在0.005％～5％w范围的硫酸(或盐酸)浓度、40～120℃下作用10～180分钟。反应结束后，立即用NaOH溶液进行中和，然后用超滤膜截留过滤，制备特定分子量的卡拉胶多糖或紫菜多糖。
(4)将(3)所得到的较小分子量的红藻多糖或市售的葡聚糖(Dextran，α-D-(1→6)-葡聚糖)经常规吡啶-氯磺酸法处理，得到特定单糖硫酸根取代度的多糖硫酸酯，采用超滤手段除去小分子物质后，以2倍量无水乙醇醇析沉淀，沉淀物经蒸馏水溶解后再次用2倍量乙醇醇析，所得沉淀物经60℃真空干燥得到所需的多糖硫酸酯，该多糖硫酸酯粉末的杂质含量低于2％，主要杂质为NaCl和Na2SO4。
(5)多糖硫酸酯粉末经干燥后在除湿环境中装成胶囊以制备成口服剂型。也可将多糖硫酸酯粉末按照所需浓度溶于生理盐水，经0.22μm膜过滤除菌后，即制备成等渗透压的、可用于鼻粘膜(肺粘膜)吸收的药物剂型。
(6)采用鸡胚模型和小鼠实验模型，对(5)所制备的多糖硫酸酯试样进行单独抗流感病毒的试验，并与金刚烷胺、病毒唑、金刚乙胺、Zanamivir(GG167或Relenza)和Oseltamivir(GS4104或Tamiflu)等现有抗流感药物组成复方后，进行协同抗流感病毒的试验。试验表明，所制备的多糖硫酸酯具有明显的抗A型和B型流感病毒活性，且与金刚烷胺、病毒唑等现有药物按1∶0.01-1∶100含量配比形成复方后具有协同作用，可进一步增强抗流感病毒作用，实施例中列举了多糖硫酸酯与金刚烷胺、病毒唑按5∶2的含量配比形成复方的抗流感病毒实验效果。


图1为本发明所涉及的从耳突麒麟菜中提取得到的卡拉胶的结构式，为聚D-半乳糖-3，6-内醚-D-半乳糖，具有部分硫酸基团。
图2为本发明所涉及的α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯的分子结构式，其中取代基R可为H或SO3H。当取代基R都为H时为α-D-(1→6)-葡聚糖。
图3为α-D-(1→6)-葡聚糖的红外光谱图。
图4为α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯的红外光谱图，其中1244cm-1左右吸收为S＝O伸缩振动、800cm-1左右吸收为C-O-S的拉伸振动，说明葡聚糖已被硫酸酯化。

本发明参照下面的实施例进行详细说明，但并不限于此。
实施例1耳突麒麟菜多糖(卡拉胶)的制备称取一定量干燥的耳突麒麟菜(购自厦门水产研究所)，剪碎洗净，加入50倍重量的热水，95℃搅拌加热3小时。将多糖粗提液5000rpm离心10分钟，收集上清液。加入KCl，使终浓度为5％，搅匀，静置过夜，在5000rpm下离心10分钟，分离不溶物。将不溶物用蒸馏水溶解，再以3∶1(v/v)的比例加入乙醇，静置沉淀60分钟，60℃真空干燥，磨成细粉，得精制卡拉胶粉末。所制得的卡拉胶分子量高于50万，每单糖硫酸根取代度为0.45。
实施例2紫菜多糖的制备称取一定量干燥的坛紫菜(产地为福建平潭)，剪碎洗净，加入50倍的蒸馏水浸泡过夜，采用捣碎机将紫菜捣碎，置-20℃冰冻，取出后微波解冻，如此重复3次后，于60℃水浴中搅拌提取30min，3000rpm离心20min，上清液另置，紫菜渣加入蒸馏水后重复提取2次，合并3次上清液，50℃减压浓缩，冻干，得粗多糖。
将紫菜粗多糖配成2％溶液，加入硫酸调节pH至2.0。多糖溶液流经再生的732阳离子交换树脂柱，可有效去除蛋白质。收集过柱液，浓缩至3％w/v后用乙醇沉降多糖。沉淀物经真空干燥，粉碎后得到紫菜多糖粉末。
实施例3特定分子量卡拉胶多糖的制备将实施例1制备的卡拉胶(或商品卡拉胶)配制成5％的胶液，置恒温水浴锅中，充分混匀。加入硫酸调节pH至2.5，90℃恒温反应120分钟。反应结束后，立即用1N的NaOH溶液进行中和，然后采用不同截留分子量的超滤膜过滤，制备不同分子量的卡拉胶多糖。所制得的特定分子量的卡拉胶多糖经喷雾干燥处理，用于卡拉胶多糖硫酸酯的制备。
实施例4α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯的制备将配置冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置盐水—冰浴中，加入吡啶48ml，搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗加入氯磺酸13ml。迅速将三颈烧瓶移入100℃水浴中，加入平均分子量为20000的α-D-(1→6)-葡聚糖3.0g，100℃恒温搅拌1h。将冷至室温的反应液倾入200ml冰水中，用40％NaOH中和至pH10.5，静置分层，用分液漏斗分离出下层水相。水相部分加入4倍体积量的95％乙醇，葡聚糖硫酸酯析出沉淀，3000rpm离心10分钟，收集沉淀物。将沉淀物溶于去离子水，在去离子水中透析48h。经透析后的物料在真空旋转蒸发器中浓缩至5％w/v，加入无水乙醇100ml，静置沉淀，离心分离沉淀物。用去离子水溶解沉淀物，再加入无水乙醇离心分离沉淀物。重复醇析分离过程三次。将最终一次沉淀物真空干燥，制得α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯。经测定，平均分子量为45000，平均单糖硫酸根取代度为2.13。
实施例5小分子量紫菜多糖硫酸酯的制备按照实施例3所述的方法将实施例2中所制得的紫菜多糖进行处理后，得到平均分子量约60000、单糖硫酸根取代度为0.50的小分子量紫菜多糖ZSO。在10℃温度条件下，将25ml氯磺酸缓慢加入120ml无水吡啶中。迅速升高反应温度，在充分搅拌条件下加入用吡啶分散的小分子量紫菜多糖ZSO样品15克。在90℃条件下反应4h。将反应液温度降至10℃，加入饱和NaOH冷溶液，将pH调至10.5。静置分层10min后，分离上层有机相和下层水相。下层水相经真空浓缩至5％w/v，加入异丙醇，异丙醇终浓度为60％w/v。沉淀物经离心分离，然后用异丙醇洗涤三次。经异丙醇洗涤的沉淀物重新溶解于去离子水中，用截留分子量为5000的超滤膜过滤，去除小分子量杂质。经超滤膜浓缩的物料中固形物含量达到约5％w/v时，加入2倍体积的异丙醇。经过滤得到的沉淀物在真空条件下干燥(90℃，0.005MPa)。所制备的样品ZSS的平均分子量约90000，平均单糖硫酸根取代度为1.57。
实施例6小分子量卡拉胶多糖硫酸酯的制备按实施例3的方法降解大分子量卡拉胶，采用超滤膜截留的方法制备平均分子量为35000的较小分子量卡拉胶多糖。
在500ml三颈烧瓶中，加入吡啶200ml，在10℃和充分搅拌条件下，缓慢加入氯磺酸20ml。加完氯磺酸后将反应液加热至60℃，加入卡拉胶多糖15克。然后升温至80℃恒温搅拌2h。反应完毕后将反应液冷却至10℃，用40％NaOH冷溶液中和至pH9.0。反应液静置分层，用分液漏斗分离出下层水相。水相料液经真空浓缩至5％w/v，加入无水乙醇，乙醇终浓度为75％。沉淀物经离心分离后，溶于去离子水，装入透析膜后，在去离子水中透析48h。经透析处理的物料再置于真空旋转干燥装置中浓缩，浓缩至5％w/v浓度后，加入无水乙醇，乙醇终浓度为75％。沉淀物经干燥，磨碎，制得卡拉胶多糖硫酸酯。经测定，平均单糖硫酸根取代度为1.91。
实施例7 卡拉胶多糖硫酸酯抗流感病毒H1N1药效研究a.按实施例1的方法，从耳突麒麟菜中提取卡拉胶。按实施例3的方法，制备平均分子量为35000的卡拉胶多糖，平均单糖硫酸根取代度为0.45。
b.将步骤a制备的卡拉胶多糖进行硫酸酯化。制得卡拉胶多糖硫酸酯K1(平均分子量60000，平均单糖硫酸根取代度为1.91)。配制5000μg/ml的K1药物制剂，同时配制2000μg/ml金刚烷胺药物制剂。按5倍比例稀释，过滤除菌，制备一系列不同浓度试样。
c.取中国国家流感中心提供的H1N1流感病毒毒株，感染鸡胚尿囊腔，37℃恒温孵育。3天后，取鸡胚尿囊腔液，进行病毒浓度测定。配制病毒浓度为100TCID的H1N1流感病毒试样。
d.取9日龄鸡胚蛋，迅速将上述步骤a、b制备的药物试样和病毒试样先后注入胚蛋，每胚蛋0.2ml。每种药物浓度试验使用5个胚蛋。同时设定病毒阳性对照组和生理盐水阴性对照组。37℃恒温孵育，连续3天观察鸡胚存活情况。
e.按步骤d处理的胚蛋孵育3天后，置于4℃冰箱过夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，进行血凝实验，测定H1N1病毒滴度。
实验表明(见表1、表2)，K1样品具有明显的抗H1N1流感病毒的效果。在实验样品浓度达4.26μg/胚蛋时，病毒抑制率可达50％以上。K1抗H1N1流感病毒的药效优于金刚烷胺，且毒性极低，其治疗指数TI50明显高于金刚烷胺。
表1 卡拉胶多糖硫酸酯K1抗流感病毒H1N1的实验结果K1用量(μg/胚蛋) 病毒抑制率％1 1000 98.22 200 87.53 40 85.64 875.05 1.6 42.8表2 卡拉胶多糖硫酸酯K1和金刚烷胺抗病毒H1N1的药效比较
K1金刚烷胺K1+金刚烷胺LD50(μg/胚蛋) 7386.71866.07 7386.87+1866.7EC50(μg/胚蛋) 4.26 5.683.38+1.35TI501734.0328.53 2185.46+1382.7f.卡拉胶多糖硫酸酯K1与金刚烷胺的抗H1N1流感病毒的协同效应配制含量配比为5∶2的卡拉胶多糖硫酸酯K1和金刚烷胺混合溶液，其中K1含量为5000μg/ml，金刚烷胺含量为2000μg/ml。按步骤d实施，测定混合药物抗H1N1流感病毒的协同效应，实验结果示于表2。表2表明，两种药物的混合使用，有助于提高抗H1N1病毒的效果，治疗指数增加；两种药物混合时的毒性与金刚烷胺单独使用时相当，未观察到二种药物毒性叠加的现象。
实施例8 卡拉胶多糖硫酸酯K2抗B型流感病毒药效研究a.按实施例7方法制备卡拉胶多糖硫酸酯K2(平均分子量约40000，每单位单糖硫酸根取代度1.75)。配制5000μg/ml K2药物制剂，按2倍比例稀释，制成一系列药物试样。
b.按实施例7方法制备B流感病毒(由国家流感中心提供)试样，病毒浓度为100TCID。
c.按实施例7步骤d实施。
d.按步骤c处理的胚度孵育，置于4℃冰箱过夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，进行血凝实验，测定B型病毒滴度。表3表明，K2单独抗B型流感病毒的效果较为明显。药物用量为100μg/胚蛋时，病毒抑制率达90％以上；药物用量12.5μg/胚蛋时，病毒抑制率达75％。
表3 K2抗B型流感病毒血凝实验结果药物K2用量(μg/胚蛋) 病毒抑制率(％)1 200 95.532 100 90.543 50 82.14
4 2578.575 12.5 75.0实施例9 卡拉胶多糖硫酸酯K2抗H3N2流感病毒药效学实验a.按实施例8所制备的卡拉胶多糖硫酸酯K2样品。配制5000μg/ml的样品，配制2000μg/ml金刚烷胺样品。按2倍比例逐次稀释。金刚烷胺为对照药物。
b.按实施例7方法制备H3N2流感病毒试样，病毒浓度为100TCID。
c、d均按实施例8实施。实验数据示于表4。
表4表明，卡拉胶多糖硫酸酯样品K2具有较显著的抑制H3N2流感病毒攻击宿主细胞的功效。
表4 卡拉胶多糖硫酸酯K2抗病毒H3N2的实验结果药物K2用量(μg/胚蛋) 病毒抑制率(％)1 200 85.242 100 80.153 5069.424 2564.295 12.5 60.15实施例10 卡拉胶多糖硫酸酯K3抗流感病毒H1N1鼠肺适应株的药效研究a.采用市售卡拉胶粉末，按实施例3的方法，制备平均分子量为4000的卡拉胶多糖，平均单糖硫酸根取代度为0.45。
b.按实施例6的方法，将步骤a制备的卡拉胶多糖进行硫酸酯化，制得卡拉胶多糖硫酸酯K3(平均分子量为7000，平均单糖硫酸根取代度为2.14)。
c.配制5000μg/ml的K3药物制剂试样。配制2000μg/ml病毒唑药物制剂试样。按4倍比例逐次稀释，制成一系列试样。病毒唑为对照药物。
d.流感病毒H1N1鼠肺适应株(由国家流感中心提供)经胚蛋感染富集后，制成病毒浓度为100TCID病毒供试样。
e.取18-20克小鼠，先感染病毒，2h后采用滴鼻方式给药。每天给药两次，连续给药7天。7天后处死小鼠，称其体重，然后解剖，取其肺，称肺重。另设空白阴性对照组、病毒阳性对照组和病毒唑对照组。
小鼠肺变指数为小鼠肺重与体重之比，表示小鼠在感染流感病毒后肺病变增重指标。阴性对照组为0.686，阳性对照组为0.850。卡拉胶硫酸酯K3通过滴鼻方式给药，可取得明显抗病毒效果，其肺变指数与阴性对照组相近(见表5)。实验表明，鼻粘膜吸收是一种良好的给药方式。
表5 卡拉胶硫酸酯K3抗流感病毒鼠肺适应株的药效比较空白病毒病毒唑 卡拉胶多糖硫酸酯K3阴性对照阳性对照给药剂量 120 120μg/d·kg肺变指数％ 0.6860.850 0.8220.680实施例11 卡拉胶多糖硫酸酯K1的鸡胚毒性实验a.配制30000μg/ml的卡拉胶多糖硫酸酯K1的药物制剂溶液。同时配制5000μg/ml金刚烷胺药物制剂溶液。按5倍比例逐次稀释，过滤除菌。每胚蛋尿囊腔注入0.5ml试样。每种试样实验5个胚蛋。
b.将上述鸡胚于37℃恒温孵育。连续观察鸡胚死亡或发育情况。接种后24小时内死亡的鸡胚量为非特异性死亡，不包括在统计数据内。
实验观察到卡拉胶多糖硫酸酯K1的药物用量达3000μg/胚蛋时，鸡胚出现致死现象。K1半致死量LD50为9706μg/胚蛋。而对照药物金刚烷胺的半致死量LD50为1866μg/胚蛋。在给药量小于2000μg/胚蛋时，未观察到K1对鸡胚发育有不良影响，在实验胚蛋发育成小鸡后，也未观察到小鸡生长有异常现象。实验表明，K1对鸡胚发育毒性极低。
c.配制10000μg/ml K1和5000μg/ml金刚烷胺混合试样，按5倍比例逐级稀释，过滤除菌。进行9日龄胚蛋药物协同毒性实验。发现鸡胚致死的最低药物浓度为K12000μg/胚蛋和金刚烷胺1000μg/胚蛋；混合药物的半致死浓度为LD50为K17386.86μg/胚蛋和金刚烷胺1866μg/胚蛋。混合药物的毒性主要来自金刚烷胺，未观察到二种药物毒性叠加现象。
实施例12 卡拉胶多糖硫酸酯K3的小鼠毒性实验用生理盐水配制60000μg/ml的K3溶液，过滤除菌。
取18-20克小鼠采用灌胃方式给药，考察K3对小鼠的毒性。每日分上午、下午间隔8小时灌胃，每次灌药0.5ml。连续灌药7天未观察到小鼠致死，也未观察到小鼠内脏异常现象和其他异常现象。
取18-20克小鼠采用滴鼻方式给药。给药量120μg/d·kg，分上午、下午间隔8小时给药。连续给药7天，未观察到小鼠致死，也未观察到小鼠其他异常现象。
实施例13 α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯抗流感病毒的药效研究a.按实施例4的方法制备α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯样品L1。样品L1的平均分子量约45000，单糖硫酸根取代度2.13。配制5000μg/ml L1药物制剂。同时配制2000μg/ml的金刚烷胺(或病毒唑)药物制剂为对照药物。按5倍比例逐次稀释，过滤灭菌，制成一系列不同浓度的供试样品。
b.取中国国家流感中心提供的A型流感病毒(H1N1和H3N2)和B型流感病毒毒株，分别感染鸡胚尿囊腔，37℃恒温孵育。3天后，取鸡胚尿囊腔液，进行病毒浓度测定。配制病毒浓度为均为100TCID的A型和B型流感病毒试样。
c.取9日龄鸡胚蛋，迅速将上述步骤a、b制备的药物试样和病毒试样先后注入胚蛋，每胚蛋0.2ml。每种药物浓度试验使用5个胚蛋。同时设定病毒阳性对照组和生理盐水阴性对照组。37℃恒温孵育，连续3天观察鸡胚存活情况。
d.经步骤c处理的胚蛋孵育3天后，置于4℃冰箱中过夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，进行血凝实验，测定病毒浓度。实验结果(表6和表7)表明α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1具有明显的抗流感病毒活性，对H1N1病毒的半数抑制病毒的浓度为15.61μg/胚蛋，对H3N2病毒的半数抑制病毒的浓度为12.60μg/胚蛋，对B型流感病毒的半数抑制病毒的浓度为8.75μg/胚蛋。
表6 α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1和金刚烷胺抗流感病毒H1N1血凝实验结果α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1金刚烷胺病毒抑制 药物用量 病毒抑制药物用量(μg/胚蛋)率(％) (μg/胚蛋) 率(％)11000 90.63 400 98.212200 85.71 80 97.77340 60.71 16 85.714842.86 3.2 32.6351.6 28.57 0.640e.α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1与金刚烷胺(或病毒唑)的协同抗流感病毒的药效研究配制配比为5∶2的α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1与金刚烷胺(或病毒唑)的混合溶液，其中L1含量为5000μg/ml，金刚烷胺(或病毒唑)含量为2000μg/ml。按2倍比例逐次稀释，制得一系列不同浓度的α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1与金刚烷胺(或病毒唑)的混合药物试样。
按步骤b、c、d进行鸡胚实验。实验结果表明，α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯和金刚烷胺(或病毒唑)具有协同抗流感病毒作用。通过协同作用，降低α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯和金刚烷胺的EC50值，直接提高药物抗病毒效果，实验结果见表7a、7b、7c。α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1单独使用时对鸡胚的毒性小于金刚烷胺，而L1与金刚烷胺组成复方后，也未观察到两药物毒性叠加现象。
表7a α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1与金刚烷胺抗流感病毒H1N1的药效比较L1金刚烷胺 L1+金刚烷胺
LD50(μg/胚蛋) 6427.2 1866.07 6427.2+1866.07EC50(μg/胚蛋) 15.61 5.68 5.24+2.09TI50411.7 328.51226.5+892.8表7b α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1抗流感病毒H3N2的药效L1病毒唑 L1+病毒唑EC50(μg/胚蛋)12.60 17.079.78+14.88表7c α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1抗B型流感病毒的药效L1病毒唑 L1+病毒唑EC50(μg/胚蛋)8.75 12.685.71+9.69实施例14α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1抗流感病毒H1N1鼠肺适应株药效研究a.配制5000μg/ml的α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1制剂试样。配制2000μg/ml病毒唑药物制剂试样。按4倍比例逐次稀释，制成一系列试样。病毒唑为对照药物。
b.按实施例10步骤d实施。
c.取18-20g小鼠，先感染病毒，2h后分别通过口服或滴鼻方式给药。每天给药两次，给药量为120μg/d·kg，连续给药7天。病毒唑为对照药物。7天后处死小鼠，测定小鼠肺变指数。
α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1通过滴鼻方式给药，其肺变指数与阴性对照组相近，说明抗病毒效果明显，而口服方式给药效果不太显著(见表8)。
表8α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1抗流感病毒鼠肺适应株的药效比较α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯空白 病毒 病毒唑L1阴性对照 阳性对照 滴 鼻滴 鼻口 服给药剂量 120 120120μg/d·kg
肺变指数％ 0.686 0.850 0.822 0.683 0.797按实施例12所述方法，考察α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1对小鼠的毒性。采用灌胃方式给药和采用滴鼻方式给药，连续给药7天均未观察到小鼠致死，也未观察到小鼠内脏异常现象和其他异常现象，说明α-D-(1→6)-葡聚糖硫酸酯L1对小鼠的毒性极小。
实施例15 紫菜多糖硫酸酯的抗流感病毒的药效研究a.将由实施例5得到的紫菜多糖硫酸酯ZSO(平均分子量为60000，单糖硫酸根取代度为0.50)和紫菜多糖硫酸酯ZSS(平均分子量为90000，单糖硫酸根取代度为1.57)配制成5000μg/ml药物制剂试样。配制金刚烷胺对照药物制剂试样，浓度为2000μg/ml。上述试样均按2倍比例逐次稀释，过滤除菌，制成一系列不同浓度试样。
b.按实施例13步骤b，制备A型流感病毒(H1N1和H3N2)与B型流感病毒试样。进行病毒浓度测定，配制病毒浓度为100TCID的病毒试样。
c.按实施例13步骤c实施。
d.经步骤c处理的胚蛋孵育3天后，置于4℃冰箱过夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，进行血凝实验，测定病毒浓度。
紫菜多糖硫酸酯ZSO具有一定抗H1N1病毒活性，EC50约28.9μg/胚蛋。紫菜多糖硫酸酯ZSS具有较强的抗H1N1病毒活性。经硫酸酯化后，ZSS样品的EC50为13.1μg/胚蛋，表明硫酸酯化后提高单糖硫酸根取代度有助于提高抗H1N1流感病毒的活性。
紫菜多糖硫酸酯ZSS具有较强的抗A型流感病毒H3N2和B型流感病毒的药效。在每胚蛋用药量为62.5μg/胚蛋时，对H3N2和B型流感病毒的抑制率分别达到51.40％和68.75％(见表9)。
表9a紫菜多糖硫酸酯ZSS抗流感病毒H1N1的血凝实验结果紫菜多糖硫酸酯ZSS ZSS+金刚烷胺药物用量 病毒抑 病毒抑药物用量(μg/胚蛋)(μg/胚蛋)制率％ 制率％1 1000.099.11000.0/400.0 99.12 500.0 93.5500.0/200.099.13 250.0 87.0250.0/100.093.64 125.0 84.8125.0/50.0 91.05 6.5 75.062.5/2.0 81.5表9b紫菜多糖硫酸酯ZSS抗流感病毒H3N2的血凝实验结果药物用量(μg/胚蛋) 病毒抑制率％1 1000.097.252 500.0 84.383 250.0 81.254 125.0 56.255 62.5 51.40表9c紫菜多糖硫酸酯ZSS抗B型流感病毒的血凝实验结果药物用量(μg/胚蛋) 病毒抑制率％1 1000.097.852 500.0 96.293 250.0 85.944 125.0 73.805 62.5 68.75e.按照实施例11的步骤进行ZSS的鸡胚毒性试验。ZSS对鸡胚的半数致死量LD50为2122.49μg/胚蛋，表明ZSS对鸡胚发育毒性极小。


多糖硫酸酯作为制备抗流感病毒药物的应用属于合成药物学领域，涉及多糖硫酸酯作为制备抗流感病毒药物的应用，尤其涉及海洋红藻多糖硫酸酯和α－D－(1→6)－葡聚糖硫酸酯作为制备抗流感病毒药物的应用。本发明公开了多糖硫酸酯在抗流感病毒中的应用，制备了α－D－(1→6)－葡聚糖硫酸酯(平均分子量范围为1000－100000，单糖硫酸根取代度0.2－3.0)和海洋红藻多糖硫酸酯如卡拉胶多糖硫酸酯(平均分子量范围为1000－100000，单糖硫酸根取代度1.0－3.0)和紫菜多糖硫酸酯(平均分子量范围为1000－100000，单糖硫酸根取代度0.5－3.0)的实用药物剂型，确定了这些多糖硫酸酯具有单独或与金刚烷胺、病毒唑等现有抗流感药物组成复方后协同抗A型和B型流感病毒的用途。