专利名称：新型多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替代品的制作方法近年来，临床用血量迅速增加，我国的血液年需求量约5000万单位，而实际年供 应量仅1300万单位，仅能满足需求的1/3。同时，由于血型、血源、传播血源性疾病等原因， 使血源受到巨大限制，另外，在偏远地区，由于地势险恶，交通不便，在发生一些重大灾害 时，血液的供应更难以得到保证。在血液制品供求矛盾急剧尖锐化的同时，人工血液以其来 源广泛、价格低廉、无表面抗原、无输血反应及感染的优势，成为解决这一危机的唯一出路。 包裹血红蛋白是目前最有前途的一种人工血液的探索，而采用纳米技术和生物可降解材料 包裹血红蛋白及其酶系统可能是解决这一问题的最终方法。人体内的血红蛋白分子量约67 000，直径6nm左右，由四个亚基构成，分别为 两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以 自动组装成α 2β 2的形态，是红细胞内负责结合和运载氧气的蛋白。现在血红蛋白类的血 液替代品研究广泛，因其没有红细胞群抗原，无需交叉配血，可以通过巴斯消毒，超滤及一 些化学方法灭菌。未经修饰的血红蛋白不能直接作为血液替代品，因为未经修饰的血红蛋 白在体内循环过程中很快被分解成二聚体和单体，从肾脏滤过而产生强烈肾毒性。另外，脱 离红细胞的Hb失去2，3-DPG的调节，氧亲和力升高，不能向组织有效供氧。同时，由于游离 的血红蛋白四聚体分子及其分解产物能够渗透血管内皮进入器官及组织间质，引起严重的 副作用。通过对血红蛋白的纳米囊包裹，可以解决上述问题。现在研究较多的是脂质体载 体和其它生物可降解材料制备的纳米载体。将无基质血红蛋白包裹在脂基膜或脂质体内成 为脂质体包裹的血红蛋白氧载体(LEHb)。通常还要在磷脂双分子层中加入增加机械稳定性 的胆固醇，并加入2，3- 二磷酸甘油酸或肌醇六磷酸盐以调整氧的解离曲线，故其Ρ50与人 血液相似。但是，LEHb易被网状内皮细胞系统的巨噬细胞吞噬而清除，巨噬细胞吞噬了大 量进入体内的LEHb后，因吞噬饱和而引起功能阻断，使机体免疫功能受损，因此有些进行 LEH换血试验的动物死于感染性休克。另外，脂质体包裹血红蛋白极易蛋白泄漏，循环时间 很短，而磷脂极易氧化，诸多这些问题不能得到解决，使得人们把目光都转到了别的生物可 降解聚合物诸如聚乳酸(PLA)，聚异丁基丙烯氰酯(PACA)等。因为与细胞膜的磷脂双分子层结构类似，脂质体具有别的材料所不具备的优势， 脂质体血红蛋白对动物的脑、心脏、肾以及肺都没有毒副作用，所以，人们也没有停止对脂 质体修饰的步伐。在上世纪90年代至本世纪初，聚乙二醇(PEG) —直是人们研究的焦点， 通过PEG对脂质体进行了修饰，可以延长血液循环时间，避免被吞噬细胞吞噬，同时蛋白外 漏的问题也得到了很大的改进。然而，这样的修饰最终还只能是被动的载体，没有主动性、靶向性，近年来，多糖类药物载体以其独特的优点引起了众多科研人员的关注，天然生物可 降解，来源广泛，低廉等，其中关于淀粉、葡聚糖、壳聚糖方面的研究更是铺天盖地。用多糖 代替PEG，对纳米微粒表面进行修饰，从而达到改变微粒的性能的目的，有研究表明，多糖链 在细胞识别的机制中起了很大作用。另外，多糖还能进一步的修饰得到更多的性能，比如接 枝一些特殊的集团，使微粒实现温敏、PH敏感的主动靶向载体。VSronique Baudin-Creuza等通过氰基丙烯酸酯和多糖的反应得到两者的共聚物，进而通过自组装的 方法将Hb吸附在表面；Antoine Richard等则先通过多糖的两亲性的改性，接枝疏水性基 团，从而与脂质体表面结合，实现对脂质体的修饰。他们认为，只有通过疏水性基团修饰，才 能最终实现脂质体的多糖修饰。加拿大华裔科学家TMS Chang曾分别用乳液聚合法、聚合物沉降法、乳化扩散法， 以聚异丁基丙烯氰酯或聚乳酸或聚乳酸聚乙醇酸共聚物为囊材，包埋血红蛋白制备了粒径 为50nm-1000nm的血红蛋白纳米囊。在这三种方法在制备过程中，均使用了大量的有机溶 剂，血红蛋白易于发生变性，包埋率也较低。后来法国科学家N. Cedrati以聚乳酸(PLA)为 膜材，用复乳法包埋血红蛋白，最后制得10-500 μ m的血红蛋白微胶囊，该方法相对简单， 基本保持了血红蛋白的活性，但其粒径较大，不能用于人体。Naveen Palath等报道了一种 新型的人工红细胞，通过5μπι左右的CaCO3多孔微球将Hb吸附在其表面，然后通过自组 装的方法在CaCO3微粒表面形成了多层聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的多层结构，接着用乙 二胺四醋酸溶解CaCO3模板，制得了 5μπι左右的人工红细胞，最终延长了循环时间和防止 蛋白外漏的问题，然而这种人工红细胞粒径较大，难以通过血栓发生的地方，另外，很难避 免吞噬细胞的识别。然而，他们忽略了微粒的电荷作用。通过制备出带电荷的脂质体，然后 在表面通过电荷的作用，选用一对带电荷的聚电解质多糖，比如壳聚糖(+ )/葡聚糖硫酸盐 (一)，通过层层自组装的方法，我们完全可以实现多糖对脂质体的表面修饰。聚电解质层层自组装技术应用广泛，是近年来发展的新的成膜技术。该技术最早 是1991年德国Mainz大学的Decher首先提出，其原理是将带正电荷的固体表面与溶液中 聚阴离子电解质接触、吸附、然后用水洗净，使表面带负电，再浸入聚阳离子电解质溶液中 取出，表面即带正电，如此反复，形成多层自组装膜。该技术具有以下优点1)制备方法简单。只需将离子化的基底交替浸入带相反电荷的聚电解质溶液中，静置 一段时间即可，整个过程不需要复杂的仪器设备；2)成膜物质丰富。适用于静电沉积技术来制备超薄膜的物质不再局限于聚电解质，带 电荷的有机小分子、有机粒、生物分子，如蛋白质、DNA、病毒、酶等带有电荷的物质都有可 能通过此技术来获得超薄膜；3)吸收层的厚度在纳米尺寸范围内可以精确调控；4)静电沉积技术的成膜不受基底大小、形状和种类的限制，且由于相邻层间靠静电力 维系，所获得的超薄膜具有良好的稳定性；5)特别适合制备复合超薄膜。将相关的构筑基元按照一定顺序进行组装，可自由地控 制复合超薄膜的结构及功能。层层自组装的方法可以在制备微囊过程中基本上不使用有机溶剂，整个制备过程条件温和，可以很好的保存蛋白的活性。另外，壳聚糖是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，生物相容性良好，在生物医学 及制药等方面的应用极其广泛，可用作烧伤敷料及伤口愈合剂。由于壳聚糖2位碳上的 胺基，使其在稀酸溶液中带正电荷，可以作为一种很好的聚电解质材料。此外，壳聚糖上具 有-NH2，可以对该基团进行修饰，将原来PEG修饰制备的改性脂质体血液替代品所不具备的 主动靶向性成为可以实现的目标，温敏以及PH敏感的智能氧载体将会成为现实。而葡聚糖 硫酸钠也是多糖的衍生物，生物相容性好，作为聚电解质材料有其独特之处。

本发明的目的在于进一步改进血红蛋白类氧运载体的性能，设计了一种新型的多 层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替代品；
本发明的另一目的是在于提供该多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替 代品的制备方法。本发明的技术方案是设计一种新型的多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米 囊血液替代品，其特征在于该纳米囊含有一带正电荷的脂质体内核，外层通过层层自组装 的方法利用壳聚糖/葡聚糖酸钠这对多糖类的聚电解质进行修饰。所述的血红蛋白采用牛血红蛋白，另外还有谷胱甘肽、碳酸酐酶等影响血红蛋白 功能的酶。所述带正电荷的脂质体是阳离子脂质体是通过二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固 醇，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)制备而成的。所述二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB) 的比例为1 1 0. 05 (摩尔比)。多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替代品的制备方法是它按如下 步骤制备
①.将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 一定比例溶于氯仿与甲醇的混合溶剂(4:1 ν/ν)中；
②.旋转蒸发器将1中的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层；
③.将牛血红蛋白、谷胱甘肽、碳酸酐酶等溶于ρΗ=7的PBS中，慢慢将其溶液加入到有 类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径 为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红蛋白微囊；
④.配置葡聚糖酸钠(Dextran)和壳聚糖(Chitosan)溶液；
⑤.将3中的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，磁力搅拌，控 制滴速，滴加完成后，孵育6h以上；
⑥.离心洗涤步骤，离心步骤采用了多次速度递增法；
⑦.用同样的方法进行后面的包裹，即将Dextran换成Chitosan/Dextran，然后3次 重复步骤5和6，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L -(DE-CH)3-DE (L=Liposome, 即内层的脂质体层；DE: Dextran)，收集最终产物。所述有机溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合物，其比例为4 :1。所述的葡聚糖酸钠的分子量为IOkDa,壳聚糖分子量为91. 11 kDa，脱乙酰度为90%。
所述的葡聚糖酸钠(Dextran)浓度为lmg/ml和壳聚糖(Chitosan)浓度为lmg/ml溶液。所述的血红蛋白溶液为分子内聚合的牛血红蛋白溶液。本发明的特点是本发明涉及牛血红蛋白纳米囊血液替代品及其制备方法，该纳 米囊含有一带正电荷的脂质体内核，外层通过层层自组装的方法用壳聚糖/葡聚糖酸钠这 对多糖类的聚电解质进行修饰，其血红蛋白含量高且载氧活性很接近天然红细胞；所述方 法通过下列步骤进行①.将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇，以及双十八烷基二甲基 氯化氨(DDAB)按一定比例溶于氯仿与甲醇的混合物溶剂中。②.旋转蒸发器将1中的混 合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。③.将牛血红蛋白、谷胱甘肽、碳酸酐酶等溶于pH=7的PBS 中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此混悬液于4°C放置4-6天，待 类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红蛋白微囊。④.配置葡聚糖 酸钠(Dextran)和壳聚糖(Chitosan)溶液。⑤.将3中的脂质体配成溶液，逐滴加入到装 有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上。⑥.离心洗涤 步骤。⑦用同样的方法进行后面的包裹，即将Dextran换成Chitosan/Dextran，然后3次重 复步骤5和6，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L -(DE-CH)3-DE (L liposome,即 内层的脂质体层；DE: Dextran)，收集最终产物。该制备方法，工艺简单，所用有机溶剂少， 反应过程温和，对血红蛋白等的生物性能影响小。


下面结合附图对本发明做进一步说明
图1是新型多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替代品制备的流程图； 图2是壳聚糖(Chitosan)和葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate)的化学结构式； 图3包裹前Hb和包裹后Hb纳米微囊释放物的红外吸收谱图对比。

①.将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 一定比例溶于氯仿与甲醇的混合物溶剂中。②.旋转蒸发器将1中的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。③.将牛血红蛋白、谷胱甘肽、碳酸酐酶等溶于pH=7的PBS中，慢慢将其溶液加入 到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过 孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红蛋白微囊。④.配置葡聚糖酸钠(Dextran)和壳聚糖(Chitosan)溶液。⑤.将3中的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，磁力搅 拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上。⑥.离心洗涤步骤，离心步骤采用了多次速度递增法。⑦用同样的方法进行后面的包裹，即将Dextran换成Chitosan/Dextran，然后3次重复步骤5和6，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L -(DE-CH)3-DE (L liposome, 即内层的脂质体层；DE: Dextran)，收集最终产物。本发明制备的血红蛋白复合纳米囊中，血红蛋白含量高，产品的载氧性能很接近 天然红细胞，其P50= 18.4 mmHg，Hill系数=2.86。本发明提供的血红蛋白复合纳米囊血液替代品制备方法工艺简单，所用囊材均为 天然可降解的材料，制备条件温和，对蛋白质生物活性影响小。本发明过程中所用有机溶剂较少，在制备类脂薄膜的同时已经将有机溶剂去除， 不会对血红蛋白的生物性能造成影响；本发明过程中多糖聚电解质材料壳聚糖/葡聚糖酸 钠为天然多糖，通过L-b-L技术，形成多层修饰层结构，但在纳米粒粒径上却增加了很少， 每层修饰层也就增加了几纳米，而在延长蛋白释放时间上却改进明显，多糖还具有逃避免 疫监视的作用，此外，壳聚糖上具有-NH2,可以对该基团进行修饰，将原来PEG修饰制备的改 性脂质体血液替代品所不具备的主动靶向性成为可以实现的目标，温敏以及PH敏感的智 能氧载体将会成为现实。本发明使用薄膜分散法制备了带正电荷的载有牛血红蛋白的脂质体纳米囊内核， 其粒径在 185nm，Zeta 电位为 +33. 48mV,分别修饰了 1 层[DE]，3 层[DE/CH/De]，5 层[DE/ CH/DE/CH/DE]，7层[(DE_CH)3- De](保证最外层为负电位)后，其粒径范围为150-260nm， 表面 Zeta 电位分别为-56. 3mV、-36. 47mV、-35. 26mV、-35. 83mV。实施例1
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转 蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐酶 等溶于pH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此混 悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红 蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐 滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后， 孵育6h以上，离心洗涤3次，最终得到包裹了 1层聚电解质的纳米囊，L - (DE)，收集最终 产物，即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为25%，粒径范围为150-200 nm。透 射电镜下可见微囊呈球形或椭球形。实施例2
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 3层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH)- DE，收集最终产物，即 复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为25%，粒径范围为160-200 nm。透射电镜下可见微囊呈球形或椭球形。实施例3
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 5层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH)2- DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为24%，粒径范围为160-220 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例4
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3_DE，收集最终产物，即 复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为20%，粒径范围为200-260 nm。透射电镜下 可见微囊呈球形或椭球形。实施例5
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 1 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转 蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐酶 等溶于pH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此混 悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红 蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)(浓度为lmg/ml)溶液，将之前的 脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比为1 :2)磁力搅拌，控制 滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，最终得到包裹了 1层聚电解质的纳米囊，L -(DE)，收集最终产物，即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为20%，粒径范围为 200-300 nm。透射电镜下可见微囊呈球形或椭球形。实施例6
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 1 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 3层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH)- DE，收集最终产物，即 复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为18%，粒径范围为200-300 nm。透射电镜下 可见微囊呈球形或椭球形。实施例7
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 1 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转 蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 5层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH)2- DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为18%，粒径范围为220-350 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例8
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 1 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转 蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3 - DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为15 %，粒径范围为250-350 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例9:
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 2mg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3 - DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为18%，粒径范围为250-300 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例10
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 1 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋转 蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 2mg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH)3- DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为16%，粒径范围为250-380 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例11
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 2mg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3 - DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为15%，粒径范围为250-350 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例12
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 2mg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :4)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran
10和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3 _ DE，收集最终产物， 即复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为8%，粒径范围为350-500 nm。透射电镜 下可见微囊呈球形或椭球形。实施例13
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3_DE，收集最终产物，即 复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为20%，粒径范围为200-260 nm。透射电镜下 可见微囊呈球形或椭球形。精密称取含有一定质量的包裹有Hb的L - (DE-CH) 3_DE微囊悬浊液ImL装入透 析袋内，同时加入30ml的PBS溶液(ρΗ7· 4)，在37°C的恒温水浴振荡，分别于1，3，5，7，9， 13，15d定时取出释放介质1.0ml，同时补充相同体积的新鲜释放介质。电泳分离出释放出 来的Hb，用紫外分析法测定释放介质中的Hb含量。并将释放前后的血红蛋白进行红外分 析，观察是否化学结构发生变化。对比包裹前Hb和包裹后Hb纳米微囊释放物的红外吸收 谱图(附图3)，结果表明释放物与包裹前的Hb结构无差异。实施例14
将二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，以及双十八烷基二甲基氯化氨(DDAB)按 如下比例=DPPC =CH =DDAB=I 1 0. 05 (摩尔比)溶于20ml氯仿与甲醇的混合物溶剂中，旋 转蒸发器将之前的混合溶液真空蒸发至呈干燥薄层。将20mg牛血红蛋白谷胱甘肽、碳酸酐 酶等溶于PH=7的PBS 20ml中，慢慢将其溶液加入到有类脂的膜的烧瓶内，缓缓搅动，将此 混悬液于4°C放置4-6天，待类脂充分水合后，通过孔径为0. 2 μ m的聚碳酸纤维膜，收集血 红蛋白微囊。配置葡聚糖酸钠(Dextran)(浓度为lmg/ml)和壳聚糖(Chitosan)(浓度为 lmg/ml)溶液，将之前的脂质体配成溶液，逐滴加入到装有葡聚糖酸钠溶液的瓶中，(质量比 为1 :2)磁力搅拌，控制滴速，滴加完成后，孵育6h以上，离心洗涤3次，重复包裹Dextran 和Chitosan，最终得到包裹了 7层聚电解质的纳米囊，L - (DE-CH) 3_DE，收集最终产物，即 复合多层纳米囊。微囊中血红蛋白的包封率为20%，粒径范围为200-260 nm。透射电镜下 可见微囊呈球形或椭球形。将包裹有牛Hb的L -(DE-CH)3-DE微囊进行体外携氧的功能实验，并与天然红细胞 进行对比，分别测量两者的P50和Hill系数量化表征，结果显示包裹有牛Hb的L -(DE-CH) 3-DE微囊的的P50为18. 4 mmHg,而天然牛Hb的P50为26mmHg ；包裹有牛Hb的L -(DE-CH) 3_DE微囊的Hill系数为2. 86，天然牛Hb的Hill系数为2. 348，相差值较小。


新型多层多糖结构修饰的血红蛋白脂质体纳米囊血液替代品，本发明涉及牛血红蛋白纳米囊血液替代品及其制备方法，该纳米囊含有一带正电荷的脂质体内核，外层通过层层自组装的方法用壳聚糖/葡聚糖酸钠这对多糖类的聚电解质进行修饰，其血红蛋白含量高且载氧活性很接近天然红细胞；所述方法通过七个步骤进行，最终得到包裹了7层聚电解质的纳米囊，L-(DE-CH)3-DE(L:Liposome,即内层的脂质体层；DE:Dextran,CH:Chiotsan)，收集最终产物；该制备方法，工艺简单，所用有机溶剂少，反应过程温和，对血红蛋白等的生物性能影响小。