专利名称：血管新生控制组合物以及控制血管新生的方法血管新生(angiogenesis)是指以来自组织的成熟血管的内皮细胞增殖以及迁移、重塑作为基本的新的分支血管的形成。近年来，从对于血管新生的细胞生物学的研究途径出发，关于其机理进行了飞跃的阐明。血管新生通过与基于缺血状态的低氧应答，使转录因子HIF (缺氧诱导因子，hypoxia-inducible factor)活化，诱导表达VEGF (血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor)mRNA而开始。产生的血管内皮增殖因子 VEGF与在血管内皮细胞中局部存在的VEGF受体(VEGFR)结合，使细胞内信号传导系统活化。结果，引起细胞外基底膜的分解，经过血管内皮细胞的迁移、增殖、血管内皮细胞的管腔形成、基底膜的形成和周细胞的包围这样的阶段，新生出血管。IHiS Murohara T “ Nitric oxide and angiogenesis in cardiovascular disease"，Antioxid Redox Signal.，Vol. 4，p. 825-831 Q002)(非专利文献 1)，作为与血管新生有关的细胞内信号传导系统，已知从磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)开始的路径。 PII路径中，确认了内皮型-氧化氮合成酶(endothelial NO synthase :eN0S)的活化、 基于其的内因性NO产生增加，根据Noiri E等，“Podokinesis in endothelial cell migration :role of nitric oxide" , The American Physiological Society, Vol. 274, p. 236-244(1998)(非专利文献 2)、Ziche M 等，"Nitric Oxide Promotes Proliferation and Plasminogen Activator Production by Coronary Venular Endothelium Through Endogenous bFGF"，Circulation Research, Vol. 80, p. 845-852 (1997)(非专利文献 3)、 Dimmeler S等，"Upregulation of Superoxide Dismutase and Nitric Oxide Synthase Mediates the Apoptosis-Suppressive Effects of Shear Stress on Endothelial Cells"，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.，Vol. 19. p. 656-664(1999)(非专利文献 4)， 目前，可以认为，内因性一氧化氮通过血管内皮细胞的增殖、迁移促进作用、细胞凋亡抑制作用，对血管新生发挥促进作用。临床医学中，已知血管新生对于创伤治疗以及大量的疾病的进展带来很大影响。 作为血管新生相关的疾病，已知早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼等眼科疾病、风湿性关节炎等炎症性疾病、实体瘤等恶性新生物等，在这些疾病中，出现缺乏控制机制的病态的血管新生。眼科疾病中的病态的血管新生的治疗战略一贯是血管新生的抑制、阻碍，如日本特开2002-284685号公报(专利文献1)、日本特开 2008-110950号公报(专利文献2、所公开，大致分为外科的治疗法和药物治疗法。作为外科的治疗法的代表，广泛使用激光凝固，该方法是对于发展的病态不得已进行代偿的组织破坏的方法，有时引起周边视力的下降、夜间视力的下降、以及色觉的变化。药物治疗中，从血管新生机制的分子生物学的阐明出发，对阻碍与血管新生相关的细胞内信号传导系统的各种阶段的抑制药进行研究、开发。作为VEGF抑制药，发明、开发了 VEGF抗体(贝伐单抗，Bevacizumab)、如日本特开2008-280356号公报(专利文献3)中所记载VEGF特异的结合性核酸(哌加他尼钠，Pegaptanib sodium)。这些对于视网膜病中的病态的血管新生的抑制和糖尿病黄斑浮肿有效，但报道了由VEGF抗体引起的正常血管的新生抑制、全身的创伤治疗延迟、脑出血、脑血管意外、心筋梗塞以及心绞痛等重大的副作用。另外，根据 Eyal B 等，“T2_TrpRS Inhibits Preretinal Neovascularization and Enhances Physiological Vascular Regrowth in OIR as Assessed by a New Method of Quantification " , Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 47, p. 2125-2134 (2006)(非专利文献幻，尝试进行通过使用了一氧化氮合成酶抑制药的内因性一氧化氮的产生抑制而带来的病态血管新生的抑制，然而，通过强力地抑制一氧化氮这样的在生理上发挥重要作用的分子，预测到作为视网膜病的原疾病的糖尿病的恶化、血压上升、心筋梗塞以及心绞痛等各种全身的副作用出现。另外，对于VEGF抑制药等眼血管治疗药而言，为了减轻全身的副作用而通过玻璃体内注射给药，因此，对患者的负担也大，不用说注射时的眼组织损伤，连晶状体以及视网膜组织也通常具有细菌感染的风险。以往技术文献专利文献1 日本特开2002-284685号公报专利文献2 日本特开2008-110950号公报专利文献3 日本特开2008-280356号公报__ 专禾Il 文 1 :Murohara T 等， “Nitric oxide and angiogenesis in cardiovascular disease" , Antioxid Redox Signal. , Vol. 4,p.825-831 (2002)非专利文献2:Noiri E 等，“Podokinesis in endothelial cell migration role of nitric oxide " , The American Physiological Society, Vol.274, p.236-244(1998)非专禾O 文献 3 :Ziche M 等，“Nitric Oxide Promotes Proliferation and Plasminogen Activator Production by Coronary Venular Endothelium Through EndogenousbFGF" , Circulation Research, Vol. 80,p.845-852(1997)非专利文献 4 :Dimmeler S 等，"Upregulation of Superoxide Dismutase and Nitric Oxide Synthase Mediates the Apoptosis-Suppressive Effects of Shear Stress on Endothelial Cells " , Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. , Vol. 19. p.656-664(1999)非专禾O文献 5 =Eyal B 等， 〃 T2_TrpRS Inhibits Preretinal Neovascularization and Enhances Physiological Vascular Regrowth in OIR as Assessed by a New Method of Quantification " , Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 47，p.2125-2134(2006)非专利文献6 :Katsumi Y 等，“Metabolic Fate of Nitric Oxide"，Int ArchOccup Environ Health, Vol. 46，p.71-77 (1980)非专利文献 7 :Zhi H 等，“Enzymatic function of hemoglobin as a nitrite reductase that produces NO under allosteric control“ ， The Journal of Clinical Investigation, Vol. 115，p.2099-2107(2005)8 =Lois E. H. Smith φ, “ Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse" , Invest Ophthalmol Vis Sci. Vol. 35, p.101-111(1994)
如上所述，与血管新生相伴随的眼科疾病的以往的治疗法的主流是伴随补偿的组织破坏的外科的治疗、或者正常血管新生的抑制、严重的全身性副作用、以及细菌感染的风险高的玻璃体内药物治疗，无法确立令人满意的外科的治疗法以及内科的治疗法。本发明是为了解决上述课题而进行的，其目的在于提供在内科上控制与血管新生相伴随的疾病特别是眼科疾病中的血管新生、能够在不抑制正常的血管新生的情况下进行治疗的副作用少、安全性高的对血管新生疾病的治疗、预防有效的组合物，以及使用其的控制血管新生的方法。为了解决上述课题，本发明人进行了深入的研究，结果发现硝酸盐、亚硝酸盐在医药上允许的安全的给药量下，具有控制血管新生过程的作用。可知，控制特别是眼科疾病中的血管新生，在不抑制正常的血管新生的情况下抑制病态的血管新生，这些化合物作为早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病(特别是增殖糖尿病视网膜病)、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼等眼科疾病治疗、预防药剂有用，从而完成了本发明。即，本发明如下。本发明为一种控制血管新生的组合物，用于治疗、预防被检体中的与血管新生相伴随的疾病，其特征在于，含有有效量的硝酸盐、亚硝酸盐、以及被吸收到被检体中且能够转换成硝酸盐或亚硝酸盐的化合物中的至少一种。本发明的组合物，优选是通过将被检体中的硝酸根离子浓度维持在有效浓度范围内来控制血管新生的组合物。本发明的组合物，优选以向被检体给药时提供8 μ mol/L 1000 μ mol/L的范围内的血浆中硝酸根离子浓度的量，含有硝酸盐、亚硝酸盐以及上述化合物中的至少一种。本发明中，与血管新生相伴随的疾病优选为选自早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼中的至少任一种眼科疾病。本发明的组合物，优选为医药用组合物，或选自健康食品、功能性食品、特定保健用食品以及营养补助食品中的至少任一种。本发明还提供一种控制血管新生的方法，其中，向被检体给予组合物，所述组合物含有硝酸盐、亚硝酸盐以及被吸收到被检体中且能够转换成硝酸盐或亚硝酸盐的化合物中的至少一种作为有效成分。本发明的方法，优选通过将被检体中的硝酸根离子浓度维持在有效浓度范围内来控制血管新生。本发明的方法，优选使被检体中的血浆中硝酸根离子浓度在8 μ mol/L 1000 μ mol/L的范围内。根据本发明，提供在内科上控制与血管新生相伴随的疾病特别是眼科疾病中的血管新生、能够在不抑制正常的血管新生的情况下进行治疗的副作用少、安全性高的对血管新生疾病的治疗、预防有效的组合物，以及使用其的控制血管新生的方法。图1是由实验例1的结果得到的视网膜血管的荧光造影照片，图1(a)表示给予 15 μ mol/kg的亚硝酸钠的情况，图1 (b)表示给予75 μ mol/kg的亚硝酸钠的情况，图1 (c) 表示给予75 μ mol/kg的硝酸钠给药的情况，图1 (d)表示给予生理盐水的情况。图2是比较在给予生理盐水、15 μ mol/kg硝酸钠、15 μ mol/kg亚硝酸钠、75 μ mol/ kg亚硝酸钠的情况时进入玻璃体的异常血管数而示出的图，纵轴为异常血管数(个)。图3是表示作为对照给予生理盐水时的视网膜断面的照片。图4是由实验例3的结果得到的视网膜血管的荧光造影照片，图4(a)表示给予 15 μ mol/kg的硝酸钠的情况，图4(b)表示给予15 μ mol/kg的亚硝酸钠的情况，图4(c)表示给予生理盐水的情况。图5是由实验例4的结果得到的视网膜血管的荧光造影照片，图5 (a)表示给予硝普钠(SNP)的情况，图5 (b)表示给予硝酸甘油(NTG)的情况，图5 (c)表示给予15 μ mol/kg 的亚硝酸钠的情况。图6是由实验例5的结果得到的视网膜血管的荧光造影照片，图6(a)表示给予 VEGF抗体的情况，图6 (b)表示给予15 μ mol/kg的亚硝酸钠的情况。图7表示由实验例6的结果得到的将15 μ mol/kg的亚硝酸钠在小鼠的颈部皮下给药的情况下的血浆中硝酸根离子浓度的时间推移。

列举一氧化氮等氮氧化物。需要说明的是，关于本发明的组合物，对于硝酸盐，报道了特别严重的副作用，对于亚硝酸盐，报道了作为急性以及亚急性毒性的高铁血红蛋白血症。但是，发挥本发明的效果的亚硝酸盐给药量，为与啮齿类中报道的高铁血红蛋白血症相关的最大无作用量(亚硝酸钠为8%ig/kg/天)的约1/8以下，即使对于新生儿也能够提供安全的治疗法。本发明中的利用硝酸盐以及亚硝酸盐的血管新生控制机制，如上所述，内因性一氧化氮具有血管内皮细胞的增殖、迁移促进作用，对血管新生发挥重要的作用，因此，可以推测例如 Zhi H等，“Enzymatic function of hemoglobin as a nitrite reductase that produces NO under allosteric control“ ， The Journal of Clinical Investigation, Vol. 115,p. 2099-2107(2005)(非专利文献7)所记载的与在组织缺血状态下进行的从亚硝酸根离子向一氧化氮的转换机制相关。但是，如后述的实验例4所证明，在硝普钠(SNP)和硝酸甘油(NTG)等常用一氧化氮供体药中，没有观察到视网膜病的恶化、或者血管新生控制效果，因此，本发明的该效果是限定于硝酸盐以及亚硝酸盐的极其特异的药理作用。艮口， 本发明的利用硝酸盐以及亚硝酸盐的血管新生控制效果，并不是简单地通过一氧化氮的供给量增加引起的效果，可以推测，与由本发明人发现的利用硝酸盐的生体内一氧化氮的产生控制以及血管内皮增殖因子(VEGF)的表达控制机制相关。本发明的组合物，优选为通过将被检体中的硝酸根离子浓度维持在有效浓度范围内来控制血管新生。由此，能够控制眼科疾病、炎症性疾病以及恶性新生物中的血管新生， 特别是对于选自早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼中的至少任一种眼科疾病中的血管新生的控制有效。根据这样的本发明的组合物，能够在不抑制正常的血管新生的情况下抑制病态的血管新生，抑制视网膜中的无血管区的减少、在玻璃体内中的病态的血管新生。在此考虑到亚硝酸盐被血红蛋白迅速氧化，大部分以硝酸盐的形式在血液中存在(亚硝酸根离子为硝酸根离子的5%以下)，以及如上所述两盐肠-唾液腺循环等能够在被检体内相互地转换，因此例如，本发明的组合物的治疗有效浓度在血浆中能够以硝酸根离子浓度进行规定。即，本发明的组合物优选，以向被检体给药时提供在8 μ mol/L 1000 μ mol/L的范围内(优选16 μ mol/L 400 μ mol/L的范围内、更优选32 μ mol/L 200 μ mol/L的范围内)的血浆中硝酸根离子浓度的量，含有有效成分。在向被检体给药时， 血浆中硝酸根离子浓度低于8 μ mol/L的情况下，无法充分地发挥血管新生的控制效果，有可能导致疾病的治疗、预防变得不充分，相反在向被检体给药时血浆中硝酸根离子浓度超过1000 μ mol/L的情况下，有时偶尔造成在视网膜病等中出血倾向上升。需要说明的是，关于该血浆中硝酸根离子浓度，可以通过使用高效液相与血浆中夹杂成分分离，直接通过吸光光度测定法、或应用格里斯法等来确定。本发明的组合物作为医药用组合物，可以是作为医药的制剂，另外，可以应用作为选自健康食品、功能性食品、特定保健用食品以及营养补助食品中的至少任一种的所谓的辅助品等。本发明的组合物由于硝酸盐、亚硝酸盐容易在水中溶解，从消化管的吸收性良好， 因此，不论非口服、口服，均能够使用多种的给药形式。作为非口服的给药路径，能够通过包含例如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、肺内、鼻腔内、外用局部的多种路径进行给药，作为剂型，可以列举注射剂、吸入剂等。另一方面，作为口服给药剂型，可以列举片剂、胶囊剂、颗粒齐U、散剂、内用液剂等，通过将这些制剂制备为胃崩解剂、肠溶剂、或者释放控制型，能够在消化管的期望部位释放硝酸盐以及亚硝酸盐。这些制剂，可以使用广泛使用的制剂技术，注意配合变化，使用医药上允许的医药品添加物形成制剂。需要说明的是，硝酸盐、亚硝酸盐的生物学的半衰期短，为3小时 5小时，因此，进行释放控制的制剂是使用发挥本发明的效果的剂型。本发明的组合物的给药量，根据年龄、体重、疾病的程度、给药形式或给药路径而不同，但只要能够发挥上述药理作用、并且所产生的副作用在能够允许的范围内，则没有特别的限定。作为具体的给药量，例如，在小鼠高氧负荷视网膜血管新生模型中皮下注射亚硝酸钠15 μ mol/kg/天时，最大血浆中硝酸根离子浓度达到100 μ mol/L上下，能够在不抑制正常的视网膜血管新生的情况下抑制病态的血管新生。另外，本发明的组合物的给药期间没有特别的限定，如后述的实验例3中所证明， 本发明的组合物，能够控制血管新生过程，在不抑制正常的血管新生的情况下抑制病态的血管新生，因此，优选在病态的血管新生产生后尽可能早地给药。例如，对于为了治疗、预防而应用本发明的组合物的与血管新生相伴随的疾病为选自早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼中的至少任一种眼科疾病的情况而言，优选从观察到伴随眼科疾病的病态的血管新生的症候的时间点开始，进行给药直至正常血管的新生充分进行、组织缺血状态缓和。另外，将本发明的组合物用于预防也是有效的，在早产儿视网膜病的情况下，从氧治疗中开始给予本药剂，另外，在糖尿病视网膜病的情况下，从观察到视网膜血管的出血、 浮肿的时间点开始给药本药剂，由此，能够防止症状的恶化。本发明还提供一种控制血管新生的方法，其中，向被检体给予将含有硝酸盐、亚硝酸盐、以及被吸收到被检体中且能够转换成硝酸盐或亚硝酸盐的化合物中的至少一种作为有效成分的组合物。本发明的方法中的细节，关于本发明的组合物与上述同样。本发明的方法中，关于本发明的组合物与上述同样，优选通过将被检体中的硝酸根离子浓度维持在有效浓度范围内来控制血管新生，优选使被检体中的血浆中硝酸根离子浓度为8 μ mol/L 1000 μ mol/L的范围内。另外，本发明的方法可以期待对与血管新生相伴随的疾病的治疗以及创伤的治疗，特别是与血管新生相伴随的疾病，优选为选自早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼中的至少任一种眼科疾病，此时，本发明的组合物向被检体的给药，优选从眼底检查中观察到病态的血管新生的症候的时间点开始，进行给药直至正常血管的新生充分进行、组织缺血状态缓和。以下，列举实验例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不限定于这些。<实验例1 硝酸盐、亚硝酸盐的视网膜无血管区改善效果的评价>
通过作为在体内的视网膜血管新生疾病的病态模型广泛使用的小鼠高氧负荷视网膜血管新生模型，评价硝酸钠或者亚硝酸钠的视网膜无血管区改善效果。(被试化合物注射液的制备)将作为被试化合物的硝酸钠或亚硝酸钠溶解在注射用生理盐水中，制备3 μ mol/ L 15 μ mol/L的被试化合物注射液。(实验方法)实验动物使用C57BL/6J小鼠(SLC)。小鼠高氧负荷视网膜血管新生模型基于 Smith 等的方法(例如，参照 Lois E. H. Smith 等，“Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse" ,Invest Ophthalmol Vis Sci. Vol. 35,p. 101-111 (1994)(非专利文献 8))进行。将新生仔鼠从出生后第7日(P7)至第12日(PU)与母小鼠一起在通过氧控制装置 (PR0-0X110、Reming Bioinstruments Co 制)控制为高氧(75士 O2)状态的笼内饲养。 在出生后第12日(PU)将新生仔鼠放回至大气压条件下(21% O2)，饲养至出生后第17日 (P17)，由此，引起视网膜血管新生。在出生后第7日(P7) 第16日(P16)的10日期间，1 日1次颈部皮下注射硝酸钠或者亚硝酸钠15 μ mol/kg或75 μ mol/kg。另外，作为对照，代替被试化合物同样地皮下注射注射用生理盐水。在出生后第17日(P17)通过给予苯巴比妥使小鼠深度麻醉，从左心室将分子量 2 X IO6的荧光素结合右旋糖苷(FITC-dextran =Sigma制)以50mg/animal进行全身灌流。 灌流后，摘下眼球，在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定4小时 12小时。固定后，从眼球中切除角膜以及晶状体，用微型钳子除去残存的玻璃体动脉。将视网膜在显微镜下剥离后，形成扁平状态，用VECTASHIELD (Vector Laboratories Inc制)包埋，制作视网膜伸展标本。(视网膜无血管区的评价法)视网膜平置(7，7卜7々 > 卜)标本在荧光倒置显微镜下(才·」、乂)、、1X71) 使用高感光度C⑶照相机进行拍摄。对于获得的图像，使用Wiotoshop CS4 extended计算出视网膜总面积以及视网膜无血管区面积，通过下式计算出视网膜无血管区面积比。视网膜无血管区面积比=视网膜无血管区面积(Pm2)+视网膜总面积 (μ m2) X 100(结果以及效果)图1是由实验例1的结果得到的视网膜血管的荧光造影照片，图1(a)表示 15 μ mol/kg的亚硝酸钠给药的情况，图1 (b)表示75 μ mol/kg的亚硝酸钠给药的情况，图 1(c)表示75 μ mol/kg的硝酸钠给药的情况，图1(d)表示生理盐水给药的情况。另外，将各种情况下的视网膜无血管区面积、视网膜总面积以及计算出的视网膜无血管区面积比的平均值示于表1。


提供一种控制血管新生的组合物，其用于治疗、预防被检体中的与血管新生相伴随的疾病，其中，以有效量含有硝酸盐、亚硝酸盐以及被吸收到被检体中且能够转换成硝酸盐或亚硝酸盐的化合物中的至少一种。还通过如下控制血管新生的方法，提供在内科上控制与血管新生相伴随的疾病特别是眼科疾病中的血管新生、而在不抑制正常的血管新生的情况下能够进行治疗的副作用少、安全性高的对血管新生疾病的治疗、预防有效的组合物、以及使用其的控制血管新生的方法，其中，上述控制血管新生的方法中，将含有有效量的硝酸盐、亚硝酸盐、以及吸收到被检体中且能够转换成硝酸盐或亚硝酸盐的化合物中的至少一种的组合物向被检体给药。