专利名称：一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物的制作方法 我国每年大约有200万人患癌，150万人死于癌症；而且还在不断的增长，并逐渐呈年轻化趋势。癌症每年给我国造成的直接经济损失逾千亿元(摘自北京晨报2007/03/31)。据卫生部2007年报告，至2006年我国因肿瘤死亡的人数已达180万，较2005年高出30万。肿瘤发生的早期人体没有感觉和症状，所以只有早期体检才能早期发现。但是目前在临床上，80％以上的肿瘤病人是出现症状后才就医治疗，一经确诊既非早期，大多数病人都发生转移，已经失去手术机会；很多经过手术的肿瘤患者，也要采取反复的放化疗已防止复发和转移。这就是使无数肿瘤患者在很多医生追求“无瘤生存”的理念下不得不忍受精神和肉体上痛苦折磨而接受无休止的放化疗，实际效果肿瘤缩小了，但病人出现全身脏器功能衰竭，血细胞低下，不得不终止治疗。 肿瘤是一种全身性疾病，应该从肿瘤的生物学特性来研究肿瘤和考虑肿瘤的临床治疗方案。免疫系统特别适合于清除少量残存的肿瘤细胞，尤其是对那种放疗和化疗很难杀灭的静止细胞或肿瘤干细胞，这有助于延长无瘤生存期。所以1984年，Oldham提出了肿瘤治疗的第四种模式——生物疗法的概念。 肿瘤的生物治疗主要是提高自身的免疫杀瘤系统。近10年来，肿瘤的生物治疗得到长足的发展，在改善患者生存质量，降低复发率，预防转移方面的重要作用已得到越来越多的认可和重视。有条件的医院纷纷开展了生物治疗项目，主要包括免疫调节剂治疗；肿瘤细胞瘤苗治疗；过继性T细胞治疗-CIK；树突细胞治疗；造血干细胞移植治疗等，其目的就是通过增强肿瘤患者的免疫力来控制肿瘤的发展。 临床上已经开展的上述生物治疗多数只能在条件较高的医院进行，而且治疗费用高，一般病人难以承受，临床上难以推广。因此，寻找高效的生物免疫增强剂是肿瘤生物治疗的任务之一。 发明人经过基础研究和临床实践，认为对肿瘤的免疫治疗应该从多种途径和多靶点激活机体免疫系统，调整机体的免疫平衡。因此，本发明采用多种生物免疫制剂的组合。本发明组合物具有较强的激活自然杀伤与巨噬细胞的作用，从而抑制肿瘤发展。 目前许多菌以及类毒素主要作为疫苗，用于预防接种和抗感染治疗，虽然其途径也是通过增强免疫系统，但本发明主要是利用多价疫苗，即选择的灭活菌以及类毒素的组合，充分调动机体的抗肿瘤免疫功能，从而增强肿瘤患者的抗肿瘤免疫功能。

本发明的目的在于提供一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，该治疗癌症的组合物涉及灭活人伤寒沙门氏菌和灭活百日咳杆菌；以及可以附加的白喉类毒素或破伤风类毒素或金葡菌肠毒素C作为新组合，具有增强肿瘤患者机体免疫力、抑制肿瘤生长和防止肿瘤转移的作用。
本发明的技术方案有下列 一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有灭活人伤寒沙门氏菌和灭活百日咳杆菌。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有下列配合比例组份的物质以灭活菌的个数的比例为灭活人伤寒沙门氏菌5亿-150亿，灭活百日咳杆菌10亿-100亿。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有下列配合比例组份的物质灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中还含有下列配合比例组份的物质白喉类毒素200Lf-2000Lf或破伤风类毒素50Lf-500Lf或金葡菌肠毒素C 100-5000ng中的任意一种或一种以上。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中每100毫升溶液中含有下列配合比例组份的物质灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中灭活人伤寒沙门氏菌为一种或一种以上的灭活伤寒杆菌、灭活副伤寒杆菌甲、灭活副伤寒杆菌乙。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中还含有下列配合比例组份的物质多糖10mg-5g。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中多糖为右旋糖苷0.5-5g或香菇多糖50-500mg或灵芝多糖50-500mg或猪苓多糖50-500mg。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中剩余的成分为注射用生理盐水或注射用缓冲液、或重量百分浓度5-10％注射用脂肪乳剂。
一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中每100毫升溶液中含有下列配合比例组份的物质灭活伤寒杆菌5亿个-50亿个或灭活副伤寒杆菌甲5亿个-50亿个或灭活副伤寒杆菌乙5亿个-50亿个。
上述生物免疫增强剂组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明所指的灭活人伤寒沙门氏菌或灭活百日咳杆菌是按照《中国生物制品规程》提供的方法或者其他常规的灭活方法进行。
以下是部分专业学术用语及其对应的英语关键词。
Lf是类毒素的计量单位，见《中国药典》三部附录2005版。
本发明所指人伤寒沙门氏菌Human Bacillus typhi salmonella，包括伤寒杆菌Bacillustyphi、副伤寒杆菌甲Bacillus paratyphosus A、副伤寒杆菌乙Bacillus paratyphosus B。
百日咳杆菌Bacillus pertussis；白喉类毒素diphtheria toxoid；DT；破伤风类毒素tetanus toxoid；TT；金葡菌肠毒素C即金黄色葡萄球菌肠毒素C(staphylococcalenterotoxin C，SEC)。
香菇多糖Lentinus edodes polysaccharide；灵芝多糖Ganoderma lucidumpolysaccharide；猪苓多糖polyporus umbellate polysaccharides。
本发明的优点 从以上实验数据分析可以知道灭活人伤寒沙门氏菌菌，灭活百日咳杆菌菌的组合已经有一定的抑制肿瘤的效果，其抑制肿瘤的效果基本维持在26％以上，而且，对多种类型的肿瘤细胞都有抑制作用；同时，能够显著提高肿瘤患者的生存质量，所以灭活人伤寒沙门氏菌，灭活百日咳杆菌的组合具有比较好的肿瘤治疗价值。
作为灭活人伤寒沙门氏菌的代表，在进一步的研究中发现一种或一种以上的灭活伤寒杆菌，灭活副伤寒杆菌甲，灭活副伤寒杆菌乙对技术都有一定的贡献，但复合的三种灭活伤寒杆菌，灭活副伤寒杆菌甲，灭活副伤寒杆菌乙的效果更好一些。
在进一步的研究中发现如果增加白喉类毒素或破伤风类毒素或金葡菌肠毒素C中的任意一种或数种通常能不同程度的增强灭活人伤寒沙门氏菌，灭活百日咳杆菌的组合抑制肿瘤的效果，其抑制肿瘤的效果高的可维持在60％左右，甚至更高，而且抑制肿瘤的种类也比较广普。
在进一步的研究中发现如果增加多糖，也可以不同程度的增强灭活人伤寒沙门氏菌，灭活百日咳杆菌等的组合的抑制肿瘤的效果。由于多糖在药物组合中多为辅助作用，本发明的右旋糖苷，香菇多糖，灵芝多糖只是众多多糖中的少数几种，但依然可以推断常用的可以作为药用的多糖类物质也可以有类似作用。
本发明的给药途径主要是皮下注射，以液体的水剂，乳剂为主。通常的治疗方案中其使用方法为0.01-1.5毫升/天，每三天一次，或一周一次，治疗周期依病人病情而定。在水剂，乳剂领域中将有治疗效果的药用生理盐水或注射用缓冲液，或重量百分浓度5-10％注射用脂肪乳剂配成成品是通用的技术。
当生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂使用量大，配置的成品中的有效成分相对较稀，则治疗或试验所采用的成品的剂量就较大。反之生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂使用量小，配置的成品中的有效成分相对较浓，则治疗或试验所采用的成品的剂量就较小。本发明的注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂在常规范围内不影响治疗效果。不进一步限定生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂的使用量并不会影响本发明的效果。
比如A方案可以按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配成100毫升溶液的成品。
比如B方案可以按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配成200毫升溶液的成品。
C方案比如可以按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配成30毫升溶液的成品。
A，B，C方案在治疗方面没有本质区别，因此将发明技术方案限定在每100毫升中灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例是不合适的，真正起作用的还是有效物质的含量之间的比例关系。
具体实施例 以下涉及的治疗癌症的免疫增强剂组合物按下列方式获得 实施例1 按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例2 按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成50毫升成品。
实施例3 按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素0-2000Lf或破伤风类毒素0-500Lf或金葡菌肠毒素C 0-5000ng，多糖0-5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成200毫升成品。
实施例4 按灭活人伤寒沙门氏菌5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例5 按灭活人伤寒沙门氏菌150亿个，灭活百日咳杆菌100亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例6 按灭活人伤寒沙门氏菌10亿个，灭活百日咳杆菌20亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例7 按灭活人伤寒沙门氏菌100亿个，灭活百日咳杆菌60亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例8 按灭活人伤寒沙门氏菌40亿个，灭活百日咳杆菌40亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例9 按灭活人伤寒沙门氏菌50亿个，灭活百日咳杆菌25亿个，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例10 以上实施例1-9中的灭活人伤寒沙门氏菌选择灭活伤寒杆菌。
实施例11 以上实施例1-9中的灭活人伤寒沙门氏菌选择灭活副伤寒杆菌甲。
实施例12 以上实施例1-9中的灭活人伤寒沙门氏菌选择灭活副伤寒杆菌乙。
实施例13 将白喉类毒素2000Lf分别加入上述实施例1-12中。
实施例14 将白喉类毒素1000Lf分别加入上述实施例1-12中。
实施例15 将破伤风类毒500Lf分别加入上述实施例1-12中。
实施例16 将破伤风类毒100Lf分别加入上述实施例1-12中。
实施例17 将金葡菌肠毒素C 5000ng分别加入上述实施例1-12中。
实施例18 将金葡菌肠毒素C 2000ng分别加入上述实施例1-12中。
实施例19 将多糖5g分别加入上述实施例1-12中。
实施例20 将多糖2g分别加入上述实施例1-12中。
实施例21 将多糖50mg分别加入上述实施例1-12中。
实施例22 将多糖100mg分别加入上述实施例1-12中。
实施例23 按灭活伤寒杆菌15亿个，灭活百日咳杆菌70亿个，白喉类毒素100Lf，破伤风类毒素30Lf，金葡菌肠毒素C 100ng，香菇多糖50mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例24 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活百日咳杆菌100亿个，白喉类毒素200Lf，破伤风类毒素50Lf，金葡菌肠毒素C 500ng，香菇多糖500mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例25 按灭活伤寒杆菌10亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，白喉类毒素300Lf，破伤风类毒素100Lf，金葡菌肠毒素C 1000ng，香菇多糖200mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例26 按灭活伤寒杆菌20亿个，灭活百日咳杆菌500亿个，白喉类毒素500Lf，破伤风类毒素200Lf，金葡菌肠毒素C 2500ng，灵芝多糖50mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例27 按灭活伤寒杆菌30亿个，灭活百日咳杆菌700亿个，白喉类毒素700Lf，破伤风类毒素300Lf，金葡菌肠毒素C 4000ng，灵芝多糖500mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例28 按灭活伤寒杆菌50亿个，灭活百日咳杆菌900亿个，白喉类毒素1000Lf，破伤风类毒素500Lf，金葡菌肠毒素C 5000ng，灵芝多糖200mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例29 按灭活伤寒杆菌70亿个，灭活百日咳杆菌1200亿个，白喉类毒素2800Lf，破伤风类毒素600Lf，金葡菌肠毒素C 4500ng，右旋糖苷5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例30 按灭活伤寒杆菌20亿个，灭活百日咳杆菌500亿个，白喉类毒素500Lf，破伤风类毒素200Lf，金葡菌肠毒素C 2500ng，猪苓多糖50mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例31 按灭活伤寒杆菌30亿个，灭活百日咳杆菌700亿个，白喉类毒素700Lf，破伤风类毒素300Lf，金葡菌肠毒素C 4000ng，猪苓多糖500mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例32 按灭活伤寒杆菌50亿个，灭活百日咳杆菌900亿个，白喉类毒素1000Lf，破伤风类毒素500Lf，金葡菌肠毒素C 5000ng，猪苓多糖300mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例33 按灭活伤寒杆菌10亿个，灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌20亿个，白喉类毒素200Lf，破伤风类毒素30Lf，金葡菌肠毒素C 125ng，右旋糖苷0.5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例34 按灭活伤寒杆菌20亿个，灭活副伤寒杆菌甲15亿个，灭活副伤寒杆菌乙20亿个，灭活百日咳杆菌100亿个，白喉类毒素250Lf，破伤风类毒素160Lf，金葡菌肠毒素C 300ng，右旋糖苷5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例35 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活副伤寒杆菌甲10亿个，灭活副伤寒杆菌乙2亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，白喉类毒素300Lf，破伤风类毒素100Lf，金葡菌肠毒素C 3000ng，右旋糖苷1g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例36 按灭活伤寒杆菌10亿个，灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活百日咳杆菌20亿个，白喉类毒素200Lf，破伤风类毒素30Lf，金葡菌肠毒素C 200ng，右旋糖苷0.5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例37 灭活副伤寒杆菌甲15亿个，灭活副伤寒杆菌乙20亿个，灭活百日咳杆菌100亿个，白喉类毒素250Lf，破伤风类毒素200Lf，金葡菌肠毒素C 300ng，右旋糖苷5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例38 按灭活伤寒杆菌45亿个，灭活副伤寒杆菌乙10亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，白喉类毒素300Lf，破伤风类毒素100Lf，金葡菌肠毒素C 3000ng，右旋糖苷1g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例39 按灭活伤寒杆菌10亿个，灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活百日咳杆菌20亿个，破伤风类毒素30Lf，金葡菌肠毒素C 200ng，右旋糖苷0.5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例40 灭活副伤寒杆菌甲15亿个，灭活副伤寒杆菌乙20亿个，灭活百日咳杆菌100亿个，白喉类毒素250Lf，破伤风类毒素200Lf，金葡菌肠毒素C 300ng，右旋糖苷5g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例41 按灭活伤寒杆菌45亿个，灭活副伤寒杆菌乙10亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，金葡菌肠毒素C 3000ng，右旋糖苷1g、灵芝多糖100mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例42 按灭活伤寒杆菌45亿个，灭活副伤寒杆菌乙10亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，金葡菌肠毒素C 3000ng，右旋糖苷2g、香菇多糖200mg、灵芝多糖10mg的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例43 按灭活伤寒杆菌45亿个，灭活副伤寒杆菌乙10亿个，灭活百日咳杆菌250亿个，金葡菌肠毒素C 3000ng，人生多糖1g的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或重量百分浓度5％注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例44 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例45 按灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例46 按灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例47 按灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌100亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例48 按灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活伤寒杆菌5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或重量百分浓度10％注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例49 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌60亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或重量百分浓度8％注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例50 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌10亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或重量百分浓度6％注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例51 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活百日咳杆菌100亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例52 按灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活百日咳杆菌100亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例53 按灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌100亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例54 按灭活伤寒杆菌5亿个，灭活百日咳杆菌30亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例55 按灭活副伤寒杆菌甲5亿个，灭活百日咳杆菌20亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例56 按灭活副伤寒杆菌乙5亿个，灭活百日咳杆菌70亿个的比例配制有效成分，加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。
实施例57 一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有下列配合比例组份的物质以灭活菌的个数的比例为灭活人伤寒沙门氏菌5亿，灭活百日咳杆菌100亿。
实施例58 一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有下列配合比例组份的物质以灭活菌的个数的比例为灭活人伤寒沙门氏菌150亿，灭活百日咳杆菌10亿。
实施例59 一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，其中含有下列配合比例组份的物质以灭活菌的个数的比例为灭活人伤寒沙门氏菌30亿，灭活百日咳杆菌70亿。
实施例60 以上各个实施例中涉及的用注射加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。全部替换为加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成180毫升成品。
实施例61 以上各个实施例中涉及的加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。全部替换为加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成60毫升成品。
实施例62 以上各个实施例中涉及的加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。全部替换为加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成120毫升成品。
实施例60 以上各个实施例中涉及的加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成100毫升成品。全部替换为加注射用生理盐水或注射用缓冲液，或注射用脂肪乳剂配制成40毫升成品。
具体试验例 为了方便起见，采用HIS代号代表本发明组合物。
试验例一、不同剂量HIS对小鼠实体瘤抑瘤率的影响试验 1、试验目的 在几个有代表性的组方中考察适当的剂量范围。
2、动物与瘤株 实验动物Balb/c小鼠，体重20±1.3g，雌雄各半。医科院实验动物中心提供。肿瘤细胞株选择S-180肉瘤、Lewwis肺癌、B16BL6黑色素瘤、H22肝癌、Ketr-3人肾癌、HeLa人宫颈癌肿瘤细胞株，来源军事医学科学院，中国医学科学院肿瘤研究所、北京大学肿瘤医院。
3、试验方法 (1)肿瘤移植取生长旺盛的S-180肉瘤、Lewis肺癌、BL6黑色素瘤、H22肝癌、HeLa人宫颈癌、MS-070乳腺癌等肿瘤细胞制备细胞均浆，将细胞浓度调整成2×107细胞/ml，在小鼠的左腋分别皮下接种0.2ml瘤细胞均浆，次日随机分组。
(2)试验分组将肿瘤移植的小鼠随机分成1、荷瘤对照组、2、CTX治疗组(阳性药物环磷酰胺组)、3、不同剂量HIS治疗组我们从HIS的各种组方中抽出5种组方，即HIS-A、HIS-E、HIS-G、HIS-J、HIS-M，HIS-N在这6种组方种，我们从组方范围下限外各取一组设定为HIS-A1、HIS-E1、HIS-G1、HIS-J1、HIS-M1、HIS-N1和高限外各取一组设定为HIS-A5、HIS-E5、HIS-G5、HIS-J5、HIS-M5，HIS-N5，其它三个剂量在组方范围内取低、中、高各三组(详细分组组别见表1)，进行抑瘤试验研究，每组动物数为12只，雌雄各半。
(3)给药方法小鼠肿瘤移植的第2日开始，HIS治疗组皮下注射HIS 0.1ml；荷瘤对照组皮下注射0.1ml生理盐水，每隔三天一次，一共4次；CTX组腹腔注射CTX(环磷酰胺30mg/kg)，7天，末次给药后第三天，处死小鼠，解剖动物，取出瘤株称重，计算各组抑瘤率，抑瘤率计算方式抑瘤率(％)＝(荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/荷瘤对照组平均瘤重x100％。
4、试验结果 试验结果见表2，从表2试验数据说明 (1)HIS-A1、HIS-E1、HIS-G1、HIS-J1、HIS-M1、HIS-N1组对实体瘤的平均抑瘤率较低分别为有29.75％、26.04％、29.59％、27.00％、28.21％、27.55％。
(2)HIS-A5、HIS-E5、HIS-G5、HIS-J5、HIS-M5、HIS-N5组对实体瘤平均抑瘤率分别达到了56.51％、60.86％、64.17％、62.33％、61.67％、51.07％。但是我们在试验观察中发现这六组超高限配方组出动物不活动，毛发竖起，饮食减少、呕吐等和CTX组出现的症状一样； (3)在组方范围内取低、中、高三个配方组的抑瘤率均在47％以上，而且与超低限组比较抑瘤率明显，P＜0.01； (4)CTX组，即化疗药物环磷酰胺组，抑瘤率较高达到了80％以上，但毒副作用太大，动物出现呕吐、不活动、食欲下降、毛发竖立，动物出现死亡现象。
(5)从这个试验结果说明，我们设计的组方范围对实体肿瘤的抑瘤率高和毒副作用小，为最佳范围。
表1.六组中不同剂量的HIS分组组别表(试验例一) 表2.六组不同剂量的HIS对小鼠实体肿瘤抑瘤率(单位100％) #与本组超下限组(HIS-A1、HIS-E1、HIS-G1、HIS-J1、HIS-M1、HIS-N1)比较P＜0.01；在我们剂量范围内的抑瘤率明显高于超下限组。
△CTX细胞毒药物环磷酰胺组与HIS组比较P＜0.01，但细胞毒副作用明显，小鼠活动减少，食欲下降，毛发竖立，出现小鼠死亡现象； ★为HIS超高限剂量组动物活动减少，食欲下降，嗜睡、毛发竖立、呕吐等毒性反应。
▲HIS-N5抑瘤率与HIS-N3、HIS-N4抑瘤率差异不大，P＞0.05；但也没有提高；但个别鼠出现食欲下降，毛发鼠竖立等副作用表现。
由于从众多配方和配比中广泛的做小鼠实体瘤抑瘤率工作，工作量太大，为了能有效的说明问题而又能适当减少工作量，我们特别设计和归纳了试验例一。
通过试验例一可以得到的结果是在入围的灭活人伤寒沙门氏菌、灭活百日咳杆菌、白喉类毒素、破伤风类毒素、金葡菌肠毒素成分及其组方，将太低剂量和太高剂量进行剔除。由于试验例一的存在，我们可以认为每100毫升中灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-50亿个，灭活百日咳杆菌10亿个-100亿个，白喉类毒素200Lf-2000Lf或破伤风类毒素50Lf-500Lf或金葡菌肠毒素C 500-5000ng在上述范围内都出现了良好的共性。这一良好共性就是剂量适中，既有比较好的抑制效果，动物不良反应又相对较小。
通过试验例一结果分析，我们选择本发明的组方成分剂量范围合适，在后续试验研究中都采用这一剂量范围，而不选择效果较差的低于范围剂量的组方和出现副作用的高于范围剂量组方。
试验例二、不同组方HIS对小鼠实体瘤抑瘤率影响试验 1、动物与瘤株 实验动物Balb/c小鼠，体重20±1.3g，雌雄各半。医科院实验动物中心提供。肿瘤细胞株选择S-180肉瘤、Lewwis肺癌、B16BL6黑色素瘤、H22肝癌、Ketr-3人肾癌、HeLa人宫颈癌肿瘤细胞株，来源军事医学科学院，中国医学科学院肿瘤研究所、北京大学肿瘤医院。
2、试验方法 (1)肿瘤移植参见试验例一。
(2)试验分组将肿瘤移植的小鼠随机分成1、荷瘤对照组、2、CTX治疗组(阳性药物环磷酰胺组)、3、HIS治疗组根据试验例一量效试验结果分析，试验例一的编号尾数为-4、-3、-2对应的高、中、低组的作用相差不大，所以我们只要选择一个组方剂量即可，在试验例二试验中，在不同组别的HIS中选择高剂量组(详见分组组别表3)进行实体瘤的抑瘤率试验，再一次验证HIS组方的有效性。
(3)给药方法参见试验例一。
3、试验结果 试验结果见表4，从表4结果中说明，23个HIS组方对小鼠S-180肉瘤都有明显的抑制作用，几乎超过30％以上的抑瘤率，尤其HIS-9、HIS-10、HIS-11、HIS-14、HIS-15、HIS-16抑瘤效果较好，达到60％以上。进一步验证本组方具有抑制肿瘤生长的作用。
表3.不同组方HIS治疗组分组组别表(试验例二) 表4.高剂量的HIS对小鼠实体肿瘤抑瘤率(单位％) 试验例三、对荷瘤S-180肉瘤小鼠巨噬细胞活性影响试验 1、肿瘤移植参照试验例二。
2、试验分组将肿瘤移植的小鼠随机分成1、荷瘤对照组、2、CTX治疗组(阳性药物环磷酰胺组)、3、HIS治疗组根据试验例一量效试验结果分析，试验例一的编号尾数为-4、-3、-2对应的高、中、低组的作用相差不大，所以我们只要选择一个组方剂量即可，在试验例本次试验中，在不同组别的HIS中选择低剂量组(详见分组组别表5)进行对荷瘤S-180肉瘤小鼠巨噬细胞活性影响试验，再一次验证HIS组方的有效性。
3、给药方法参照试验例一。
4、试验方法 在最后一次给药后24小时后，采集腹腔巨噬细胞 (1)小鼠腹腔巨噬细胞收集(“参照一种检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性新方法的建立”畜牧与兽医2005年第37卷第11期)，为了获得更多的巨噬细胞，每只小鼠在给药后第三天，腹腔注射1mL 6％的淀粉肉汤(w/V)，24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，并用碘酒和70％乙醇先后消毒腹部，再向腹腔注射4mL生理盐水液，揉匀，静置5min后无菌剖开皮层，用注射器针头刺入腹膜吸取腹腔液于硅化玻璃试管内，用血球计数板计数，并计算巨噬细胞浓度，然后用生理盐水调整巨噬细胞的浓度为5×106/mL和2×105/mL后待用。
(2)鸡红细胞收集(畜牧与兽医2005年第37卷第11期“一种检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性新方法的建立”)25％鸡红细胞悬液的制备鸡翅下静脉取血保存于阿氏(Alsever)液中，血液和阿氏液的体积比为1∶4。使用前先用生理盐水洗涤鸡红细胞2次，每次离心弃上清(1000r/min，5min)，最后用生理盐水配制5％(v/V)的鸡红细胞悬液。
(3)巨噬细胞的吞噬试验，eppendorf管法分别加入5×106/mL的巨噬细胞悬液和5％鸡红细胞悬液各300uL于多个无菌的1.5mL eppendorf管中，37℃分别培养45分钟(5min摇匀一次)，然后每管取300ul加到干净的盖玻片(18mm×18mm)上，于37℃黏附30min，取出后用37℃预热的PBS(磷酸缓冲液)冲洗未被吞噬的鸡红细胞(切勿用力过大使巨噬细胞被冲掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水纸从玻片边缘吸除大部分甲醇后自然晾干，然后Giemsa染液染色30min，自来水冲洗去多余染液后晾干显微镜观察。每个数据同样为10只不同小鼠的平均值。
吞噬百分率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数×100％ 吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/计数的总巨噬细胞数 5、巨噬细胞活性测定结果表明，HIS能够刺激巨噬细胞的产生和激活巨噬细胞的活性。巨噬细胞在肿瘤免疫治疗上起着十分重要的作用，它可以直接吞噬杀灭肿瘤细胞，而且还可以分泌许多细胞因子间接杀灭肿瘤细胞，可以作为抗原递呈细胞递呈抗原，激活特异性抗肿瘤作用。提示HIS抑制肿瘤生长与激活巨噬细胞活性有关。结果见表6。
表5.不同组方HIS治疗组分组组别表(试验例三) 表6.HIS对S-180小鼠巨噬细胞吞噬活性实验结果 ▲与荷瘤组比较P＜0.01；△与荷瘤组比较P＜0.05 试验例三、对小鼠S-180肉瘤免疫系统的作用 1、实验动物参见试验例一。
2、材料和细胞株参见试验例一。
3、试验分组将肿瘤移植的小鼠随机分成1、荷瘤对照组、2、CTX治疗组(阳性药物环磷酰胺组)、3、HIS治疗组根据试验例一量效试验结果分析，试验例一的编号尾数为-4、-3、-2对应的高、中、低组的作用相差不大，所以我们只要选择一个组方剂量即可，在试验例本次试验中，在不同组别的HIS中选择中剂量组(详见分组组别表7)进行对荷瘤S-180肉瘤小鼠免疫系统的作用试验研究。
4、给药方法参照试验例一。
5、试验测定方法于末次给药后第三天各组小鼠分别颈椎处死取脾进行以下实验。
(1)NK细胞杀伤活性的测定 小鼠脾脏NK细胞的获得常规方法制备脾细胞，计数，调细胞数至1×107个/ml，即为备用的NK细胞。靶细胞传代培养的L929细胞在试验时用0.25％胰蛋白酶消化1～2min，加完全1640培养液轻轻吹打细胞，离心将细胞重悬于含10％小牛血清的1640培养液中，调细胞数至2×105个/ml，即为备用的NK细胞的靶细胞。NK细胞活性的测定取事先配好的靶细胞悬液加入96孔板中，0.1ml/孔，然后培养箱中培养1h，向每孔加入0.1ml效应细胞(使效靶比例50∶1)，靶细胞对照孔加完全1640 0.1ml，各设4个复孔，再放入培养箱中培养20h，MTT法检测NK细胞活性。
杀伤率(％)＝(靶细胞OD值-实验组OD值)/靶细胞OD值×100％。
(2)淋巴细胞增殖反应的测定 常规制备1×107/ml脾细胞悬液，加入96孔培养板，每孔200μl，实验孔每孔再加50μg/ml ConA 20μl。对照孔加培养液20μl，每个组均设平行孔3孔。培养箱中培养66～72h，取出培养板。离心取上清100μl MTT测A值，计算淋巴细胞增殖率。
(3)淋巴细胞增殖率(％)＝实验孔A值/对照孔A值×100％淋巴细胞IL2诱生与活性测定IL2样品的制备常规方法制备1×107/ml脾淋巴细胞悬液，加ConA 5μg/ml，培养于24孔细胞培养板，在37℃ CO2培养箱中温育24h；离心收集上清液，-20℃保存，即为IL2待测样品。IL2检测细胞的制备BalB/C小鼠颈椎脱臼处死，常规方法制备5×106/ml脾淋巴细胞悬液，加ConA 2.5μg/ml，置25ml的细胞培养瓶中温育96h。细胞用10mg/ml a甲基甘露糖苷(a-mm)的Hank’s液洗两次，调节细胞浓度为1×106/ml，作为测定IL2的反应靶细胞。IL2样品的检测在96孔细胞培养板中，每孔加反应细胞0.1ml(1×105个)和等量的IL2上清液，每样均设3个复孔。每孔加100mg/ml amm 20μl，在CO2培养箱中温育48h，用MTT比色法测定结果。
(4)CD3、CD4、CD8测定(参照中国免疫学杂志，2002，18(11)799-803)，取1×107个/ml浓度的小鼠外周血100ul于小离心管中，分别加入R-PE标记的CD3、CD4、CD8抗体10ul，振荡混匀，室温、避光放置30min用PBS洗涤2遍，再加入500ul PBS混匀，10min后用流式细胞仪FACS Calibur(美国BECTON DICKINSON公司)检测CD3、CD4、CD8阳性表达率。
6.实验结果 (1)HIS组小鼠NK细胞活性及淋巴细胞增殖能力显著高于荷瘤模型组小鼠(P＜0.05、P＜0.01)； (2)CTX组NK细胞活性及淋巴细胞增殖能力显著低于荷瘤模型组(P＜0.05)，说明CTX化疗药物对免疫系统有抑制毒性作用； (3)HIS组小鼠IL2含量也显著高于荷瘤模型组和环磷酰胺组(P＜0.01)。HIS显著提高小鼠CD3、CD4细胞(P＜0.01)，对CD8细胞影响较小； (4)HIS显著提高CD4/CD8比值(P＜0.01)。
HIS能促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞ConA的增殖反应，说明HIS能增强细胞免疫。淋巴细胞在有丝分裂原ConA刺激下，转化为淋巴母细胞，并分化增殖，使细胞内蛋白质和核酸合成增加，多种活性因子的释放也增加，提高了机体的整体抗肿瘤水平。HIS对NK细胞杀伤活性有明显增强作用，可认为HIS增强了NK细胞对肿瘤细胞刺激的敏感性，而使NK细胞活性增强。另外，IL2可以激活NK细胞，活化后的NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞，也同时释放许多细胞因子如IFN-γ，IL-2，IFN-α，从而扩大抗肿瘤谱。结果见表8。
表7.不同组方HIS治疗组分组组别表(试验例三) 表8.HIS对S-180肉瘤小鼠免疫系统功能的影响试验结果 ▲与荷瘤组比较P＜0.01；△与荷瘤组比较P＜0.05；#与荷瘤组比较P＜0.05。


本发明涉及一种治疗癌症的生物免疫增强剂组合物，该治疗癌症的组合药物主要含有灭活人伤寒沙门氏菌5亿个-150亿个，灭活的百日咳杆菌10亿个-100亿个；以及白喉类毒素或破伤风类毒素或金葡菌肠毒素C。本发明的新组合对激活肿瘤患者免疫系统、改善生存质量、抑制肿瘤生长和转移有一定的帮助。