专利名称：一种生物乙醇制备方法随着世界エ业的迅速发展， 石油等化石资源的逐渐枯竭，利用可再生资源生产生物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，具有价廉、可降解和不污染生态环境等优点，因此用木质纤维素生产燃料こ醇替代石油燃料，对社会经济的可持续发展具有重要的意义。但是，纤维素是以葡萄糖基通过糖苷键连接起来的、具有线性结构的高分子化合物，其结构复杂，内部存在大量的晶区、非晶区结构和氢键，造成了纤维素资源化利用的障碍。纤维素酶酶解纤维素被认为最有效的破坏纤维素的复杂结构，高效利用植物纤维的方法之一。黑曲霉、康宁木霉等微生物可以分泌纤维素酶、木聚糖酶等多种植物纤维降解酶，高效降解天然植物纤维成为糖，这些糖可以被微生物利用发酵成为生物こ醇等能源产品，有助于解决能源危机。然而纤维素酶产生菌虽然能够降解植物纤维，但是不能用于生产生物こ醇等产品。高效代谢木糖和葡萄糖产こ醇的菌种是以植物纤维降解糖为原料生产こ醇的研究热点之一。由于常用的酿酒酵母和运动发酵单胞菌等微生物只能利用葡萄糖这样的六碳糖生产こ醇，不能利用植物纤维降解产生的木糖，造成了植物纤维降解产生的木糖浪费，导致こ醇产率不高；并且这些微生物こ醇高产菌不能直接利用植物纤维素生产生物こ醇。目前有报道利用基因工程改造的酵母菌、大肠杆菌等工程菌直接利用纤维素制备こ醇，但是基因工程菌通常需要抗生素維持其代谢能力，并且存在生长速度慢、代谢慢、こ醇产率不高、不能高效利用天然植物纤维等缺点，因此基因工程菌在直接利用植物纤维制备こ醇方面显示出不足之处。
发明目的本发明的目的是提供了一种产率高的生物こ醇制备方法。技术方案本发明所述的生物こ醇制备方法，包括以下步骤将植物纤维与纤维素酶产生菌种子液于发酵培养基中恒温振荡培养0-5天后，接入こ醇生产菌种子液，继续恒温振荡培养3-7天，得发酵液；过滤发酵液，滤液减压蒸馏即得生物こ醇。其中，所述纤维素酶产生菌种子液由纤维素酶产生菌于PDA培养基中恒温培养制得，所述こ醇生产菌种子液由こ醇生产菌于YEro培养基中恒温培养制得；培养温度为25-30°C，培养时间为3-5天。为了使纤维素酶产生菌对桑叶中的纤维素充分降解，本发明优化了发酵条件所述纤维素酶产生菌为黑曲霉(Aspergillus niger)或康氏木霉(Trichodermakoningii)； 所述こ醇生产菌为休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)或树干毕赤酵母(Pichiastipites；；所述植物纤维的用量为每升发酵培养基中含2_20g植物纤维；所述纤维素酶产生菌种子液的体积为发酵培养基体积的2-5% ；所述纤维素酶产生菌种子液与こ醇生产菌的菌种子液体积比为I : (O. 5-2)；培养温度为25-30°C，振荡速度为100-200r/min ；所述发酵培养基为以下任ー种(I)培养基 I 9g Na2HPO4 · 12H20，I. 5g KH2PO4,1. 2mg FeNH4-Citrate, 0. 34g(NH4)2S04，0. 15g 蛋白胨，0. 15g 酵母提取物，0. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005g FeSO4 · 7H20， 0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2, IOOOmL H2O ；pH 为 4-6 ；(2)培养基II 2g KH2PO4,1. 4g (NH4)2SO47O. 3g MgSO4,0. 3g CaCl2,0. 5g 蛋白胨，0. 005g FeSO4 · 7Η20，0· 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2, IOOOmLH2O ；pH 为 4-6 ；(3)培养基III :lg蛋白胨，2. Og NaNO3,1. 5g K2HPO4,0. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005gFeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 5g CoCl2,1. 5g 酵母提取物，H2OIOOOmL ；pH 为 4-6 ；(4)培养基 IV 3g NaNO3, Ig K2HPO4,0. 5g MgSO4 · 7H20，0. 5g KCl，0.005gFeSO4 ·7Η20，0· 0016g MnSO4 ·Η20，0. 0014g ZnSO4 ·Η20，0. 002g CoCl2, IOOOmL H20;pH为 4-6。有益效果本发明与现有技术相比，其显著优点是本发明的制备方法产率高、成本低、绿色环保，适于エ业化生产。本发明提供的生物こ醇制备方法产率高。本发明方法直接利用桑枝、秸杆、甘蔗渣等天然植物纤维为原料，构建了ー种纤维素酶产生菌和こ醇高产菌混合发酵的模式，不需要外加糖类或者酶就可以高效生产こ醇。纤维素酶产生菌在培养体系中分泌纤维素酶、木聚糖酶及多种其他酶协同降解天然植物纤维中的纤维素和半纤维素成为可发酵的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等糖；同时利用植物纤维作为碳源所产生的部分葡萄糖可以满足纤维素酶产生菌生存和代谢的需要。然而，纤维素酶产生菌不能利用半纤维素降解产生的木糖，因此培养液中还剩余大量的糖，糖积累对于植物纤维降解也产生反馈抑制。而休哈塔假丝酵母等微生物既可以利用葡萄糖生产こ醇也可以利用木糖高效生产こ醇，是发酵植物纤维降解物的优良菌种。在培养体系中加入高产こ醇的微生物如休哈塔假丝酵母进行混合发酵,休哈塔假丝酵母等こ醇生产菌直接利用还原糖发酵制备生物こ醇，同时葡萄糖和木糖等糖的消耗解除了糖积累对于植物纤维降解的反馈抑制，提高了植物纤维的利用效率，进ー步提高了こ醇的产率。本发明提供的生物こ醇制备方法成本低。传统的こ醇生产以石油或者蔗糖、玉米等为原料；浪费了不可再生的石油资源或者蔗糖、玉米等粮食资源。而本发明以可再生的秸杆等富含纤维素和半纤维素的废弃物为原料，通过混菌发酵生产こ醇，实现了秸杆等植物纤维废弃物的高值转化，原料来源丰富，再生循环迅速，成本低廉，免去了秸杆等材料酶解的步骤，有助于解决能源短缺问题。本发明提供的生物こ醇制备方法绿色环保。石化エ业生产こ醇需要高温高压，同时其废水、废气造成了环境污染。而微生物转化能在水相、室温和中性PH的环境下进行，无需高压和极端条件，节省了能源，避免了石化工业对环境的污染。(I)培养基 I 9g Na2HPO4 · 12H20，1. 5g KH2PO4,1. 2mg FeNH4-Citrate, 0. 34g(NH4)2S04，0. 15g 蛋白胨，0. 15g 酵母提取物，0. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2, IOOOmL H2O ；pH 为 4-6 ；(2)培养基II 2g KH2PO4,1. 4g (NH4)2SO47O. 3g MgSO4,0. 3g CaCl2,0. 5g 蛋白胨，0. 005g FeSO4 · 7Η20，0· 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2, IOOOmLH2O ；pH 为 4-6 ；(3)培养基III :lg 蛋白胨，2. Og NaNO3,1. 5g K2HPO47O. 3g CaCl2,0. 3gMgS04,0 . 00 5gFeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20，0. 5gCoCl2，I. 5g 酵母提取物，H2OIOOOmL ；pH 为 4-6 ；(4)培养基 IV :3g NaNO3, IgK2HPO4,0. 5g MgSO4 · 7H20，O. 5g KCl，O. 005gFeSO4 ·7Η20，0· 0016g MnSO4 ·Η20，0. 0014g ZnSO4 ·Η20，0. 002g CoCl2, IOOOmL H20;pH为 4-6。实施例2发酵条件考察(I)菌种的活化种子液的制备将黑曲霉(Aspergillus niger，DSMZ 821)在PDA培养基中25-30°C恒温培养3-5天制得こ醇生产菌休哈塔假丝酵母(Candida shehatae，ATCC34887)在YETO培养基中25-30°C恒温培养3-5天制得。(2)混菌发酵こ醇方法分别从菌种混合比例(黑曲霉休哈塔假丝酵母，生物量比分别为I :0. 5，I :1或I :2。)、总接种量、发酵温度与发酵初始pH值对こ醇得率的影响进行考察，以确定相关因素及其影响范围。以单因素实验为基础，采用正交试验设计对菌种混合比例、总接种量、发酵温度与发酵时间的最佳水平进行研究，利用响应面分析方法确定最佳发酵条件。首先采用单因素研究黑曲霉与休哈塔假丝酵母混合发酵甘蔗渣制こ醇的规律，采用摇瓶发酵方法液体发酵，分别考察培养时间、甘蔗渣(所采用的甘蔗原料为洗涤除糖之后的甘鹿洛)添加量、初始PH、接种量、磷酸ニ氢钾、温度、转速、硫酸铵、装液量对こ醇产量的影响。(I)延迟接入时间温度30°C，转速180r/min，两种菌的接种量分别为5ml，以推迟接入O (所述推迟O天即为同时接入)、1、2、3、4、5天的组合形式接入こ醇生产菌种子液于发酵液中，考察こ醇产生菌延迟接入时间对こ醇产量的影响。(2)混合培养时间温度30°C，转速180r/min，两种菌的接种量分别为5ml，培养时间分别为ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d的条件下，考察不同时间对こ醇产量的影响。(3)甘蔗渣添加量温度30°C，转速180r/min，在50ml培养基中，分别接入两种菌，接种量均为5ml，培养时间为4d，甘蔗渣添加量分别为O. Ig, O. 2g, O. 3g, O. 4g, O. 5g, 0. 6g, 0. 7g, 0. 8g, 0. 9g, I. Og 的条件下，考察不同甘蔗渣添加量对乙醇产量的影响。(4)培养基PH :温度30°C，转速lSOr/min，两种菌的接种量分别为5ml，培养时间为4d，初始PH分别为4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5. 7. O0考察不同初始PH对乙醇产量的影响。表I混菌发酵乙醇条件考察

本发明提供了一种生物乙醇制备方法，包括以下步骤将植物纤维与纤维素酶产生菌种子液于发酵培养基中恒温振荡培养0-5天后，接入乙醇生产菌种子液，继续恒温振荡培养3-7天；过滤发酵液，滤液减压蒸馏即得生物乙醇。本发明提供的一种生物乙醇制备方法产率高、成本低、绿色环保，适于工业化生产。