组织型纤溶酶原激活剂的新型组合突变体的制作方法[0002]组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是目前应用广泛的溶栓药物。但天然型t-PA存在着半衰期短，有出血副作用，使用剂量高，成本价格高，临床使用条件苛刻等缺陷，因此科学界一直对其进行蛋白质结构改造。为提高t-PA的溶栓活性，并克服上述缺陷，我们从改造天然t-PA的分子结构入手，通过蛋白质工程改造，得到了 t-PA的重组衍生物-新型组合突变体(简称rPA)。
[0003]根据t-PA的结构分析和分子设计，我们在将t-PA分子中的EGF区、Finger区和Kringle I区删除的基础上，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二个功能区(176-527氨基酸)，同时将t-PA分子中的PA1-1结合位点的氨基酸进行定点突变，构建了能够显著延长t-PA半衰期、提高特异活性，且其活性不被PA1-1抑制的，诸多优势特征组合的新型t-PA突变体。该新型t-PA溶栓剂，其多种特性均有显著改善。经检索我们的这种新型t-PA突变体氨基酸序列是首创性工作，国际上没有类似的突变体发表。(rPA的核苷酸序列和氨基酸序列附后)。[0004]首先PCR扩增出天然t-PA的176-527位氨基酸的cDNA。再将该cDNA中的PA1-1结合位点核苷酸序列364-372的CAC AGG AGG改变为GCC GCG GCG，使相应的第122-124位氨基酸HRR突变为AAA，便构建了新的t-PA突变体rPA，并克隆于大肠杆菌表达载体pET22b。在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的40%，以包涵体形式存在。经蛋白质变性、复性，得到了有生物活性的rPA。为了获得更高的rPA的表达，保证其生物活性，我们将rPA基因克隆于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k，用毕赤酵母进行表达，在培养上清中经分离纯化，得到高活性的rPA。对用大肠杆菌和毕赤酵母表达的rPA进行理化和生物学性质研究表明，rPA在具有天然t-PA的优点，如血栓特异性的同时，在药理药代上优于t-PA。突变体的半衰期为约28分钟，而t-PA只有3.5分钟。rPA还表现出显著增强的血纤蛋白刺激性，并实质性地增加酶原性；与PA1-1反应后t-PA活性无抑制。说明我们的分子改构提高了纤溶酶原水解活性，大幅度增加了血纤蛋白辅因子的差别，核苷酸序列364-372相对应的氨基酸序列影响PA1-1结合活性，而不影响其纤溶酶原水解活性，这样的氨基酸突变显著提高了对PA1-1抑制的耐受性。上述突变特征的组合增加了该t-PA突变体的临床治疗应用的优势。该工作使其成为治疗活性好、用量少、临床使用方便的治疗心肌梗塞和脑血栓、肺栓塞等血栓性疾病的新型生物工程药物。[0005]当然，亦可依不同方法来制备rPA，如可在细菌或昆虫细胞及动物细胞等较高等真核细胞中表达，但最好是在酵母系统中表达。由于rPA分子包含9对二硫键，若用大肠杆菌进行表达必需经过变性和复性步骤，复性率很低，纯化困难，其产量和应用受到限制。为了提高rPA的表达产率，我们用甲醇营养型的毕赤酵母来分泌表达rPA。由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌rPA，而且还因为它在实际上是呈准确折迭形式的并具有高度活性的。[0006]优选采用的酵母载体是所谓的穿梭载体，其具有的细菌质粒和酵母质粒的复制原点，以在两种宿主系统中分泌的基因。此外，该类型载体还含有表达外来基因所必需的启动子顺序，以及最好有可改善产率的终止顺序，从而即可使利于同分泌信号融合的异源基因定位于启动子和终止密码子之间。[0007]具体工艺简述如下:[0008]rPA表达质粒构建一转化毕赤酵母一高密度发酵表达一上清液分离一超滤浓缩一阳离子交换层析纯化一脱盐一除菌过滤一制剂分装一成品冻干。经上述步骤，即可制备得到纯度大于99%，生物比活性高于500，000IU/mg蛋白的rPA。[0009]实施例1:[0010]首先用PCR扩增和定点突变的方法获得rPA的全长cDNA。经DNA序列测定证实其序列正确后，插入我们已改建过的酵母表达质粒PPIC9K-Y。所购建成的表达质粒经DNA序列测定分析正确后，用Sal I酶切成线性质粒，用电穿孔的方法转化入毕赤酵母，经过筛选即得到rPA的高表达酵母工程菌。该工程菌在酵母培养基中生长、诱导、分泌，再将发酵液离心后，取上清液，超滤至十分之一体积，经脱盐后，过CM-Sepharose阳离子交换层析住纯化，即得到纯度>99%，比活性高于500，000IU/mg的rPA纯品。[0011]本发明的优点:[0012]本发明提供了一种t-PA的新型重组衍生物-组合突变体rPA以及用酵母分泌表达具天然蛋白结构和生物活性的rPA的新型工艺方法。rPA在具有天然t_PA的优点，如血栓特异性的同时，还具有以下优点:显著增强的血纤蛋白刺激性，延长的半衰期，增加的酶原性以及提高的对PA1-1抑制的耐受性。因而可能成为具有诸多临床优势的新一代溶栓药物。[0013]rPA核苷酸序列和氨基酸序列[0014]1/128/10[0015]ATG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT GGC ACG[0016]gly asn ser asp cys tyr phe gly asn gly ser ala tyr arg gly thr[0017]58/2088/30[0018]CAC AGC CTC ACC GAG TOG GGT GCC TCC TGC CTC COG TGG MT TCC ATG ATC CTG ATA GGC[0019]his ser leu thr glu ser gly ala ser cys leu pro trp asn ser met ile leu ile gly[0020]118/40148/50`[0021]MG GTT TAC ACA GCA CAG AAC COC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AM CAT MT TAC[0022]Iys val tyr thr ala gin asn pro ser ala gin ala leu gly leu gly Iys his asn tyr[0023]178/60208/70[0024]TGC OGG MT CCT GAT GGG GAT GCC MG CCC TGG TGC CAC GTG CTG MG AAC OGC AGG CTG[0025]cys arg asn pro asp gly asp ala Iys pro trp cys his val leu Iys asn arg arg leu