Msmb基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法[0002]β -微精蛋白(MSMB)基因(microseminoprotein, beta-.MSMB),定位于 10 号染色体IOqll.2上，51549552到51562516碱基对之间。MSMB基因编码的蛋白质是免疫球蛋白结合因子家族的成员，由前列腺上皮细胞合成，被分泌到精浆中。有研究表明，MSMB基因编码的PSP94能抑制肿瘤的生长和转移。PSP94的丧失导致了雄激素抵抗的前列腺癌的发生，而蛋白EZH2的过表达导致MSMB的低表达，从而使得PSP94低表达而引起前列腺癌的发生。SP94的低表达与前列腺癌根治术后复发有很大的关系，MSMB基因的多态性与前列腺癌发生有强相关性。[0003]目前，MSMB基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-T0F-MS)和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，不能与其他位点并行检测，同样不能满足实际应用的需要，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制，也难以满足实际应用的需要。
[0004]本发明的目的之一是提供MSMB基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测MSMB基因四种常见基因型C4944T、A52G、G1692A和C14917T的野生型和突变型。[0005]实现上述目的的技术方案如下:[0006]一种MSMB基因突变检测液相芯片，包括有:[0007](A).针对MSMB基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对--每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C4944T位点的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，针对A52G位点的SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 G1692A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 /或针对C14917T位点 的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列选自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.8 ；
[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对C4944T位点的SEQ ID N0.25及SEQID N0.26，针对 A52G 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，针对 G1692A 位点的 SEQ IDN0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或针对 C14917T 位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE弓丨物为:针对C4944T位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10组成的序列，针对A52G位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12组成的序列，针对G1692A位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14组成的序列，和/或针对C14917T位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于:MSMB基因突变检测的特异性引物。
[0013]具体技术方案如下:
[0014]用于:MSMB基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对C4944T位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，针对A52G位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对G1692A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 C14917T 位点的 SEQ ID N0.15及 SEQ ID N0.16。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的MSMB基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的MSMB基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，4种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

[0020]实施例1MSMB基因突变检测液相芯片，主要包括有:[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对MSMB基因四种常见基因型C4944T、A52G、G1692A和C14917T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1MSMB基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)