辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对及其应用的制作方法[0002]马铃薯是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大农作物。我国是世界马铃薯第一生产大国，据统计，“十五”期间，马铃薯年均种植面积7015.9万亩，占全世界总面积的1/4，年产量1，415.60万吨，占世界年总产量的1/5。[0003]马铃薯因具有耐旱、耐寒、耐瘠薄、适应性广的特点，全国大部分地区的土壤及气候条件都可满足其生产。中国是一个人口大国，耕地减少和人口增加的矛盾不可逆转，水资源日益紧缺、扩大有效灌溉面积难度较大，大力发展马铃薯产业对确保粮食安全，促进农民增收，振兴农村区域经济具有重要的战略意义。[0004]马铃薯病毒病分布于世界各马铃薯种植区，可导致马铃薯退化，产量降低，严重时减产80%以上，是当前马铃薯生产中的主要限制因子。在我国由北向南马铃薯带毒率逐渐增高，造成我国中部和南部不能自行留种，必须从北部发病轻的地区引种，造成巨大的经济损失。目前马铃薯上已发现多种病毒、类病毒，已报道的有25种以上病毒或病毒病，所幸的是其中仅有少数病毒危害严重，如马铃薯X病毒、Y病毒、S病毒、卷叶病毒等。[0005]目前，对于马铃薯病毒检测方法概括起来主要有3大类。即指示植物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR法，以下分别作一介绍。指示植物是经过筛选的对某种病毒有专化性反应的植物。例如千日红对X病毒的反应是接种后在叶片上出现红色病斑；洋酸浆对Y病毒的反应是种后在叶片上出现小枯斑；地霉松对A病毒的反应是在叶片上出现许多小型点状病斑等。早期鉴定PSTV株系的方法是用指示植物Rutgers番茄进行重复接种。但是指示植物法周期长，需要严格的环境条件，很难用于大规模检测。ELISA方法经济简便，快速直观，但其也存在一定的缺点:首先是抗体的制备所需时间长，费时费力，其次它一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度降低。此外，此法在检测病毒时还经常存在假阳性反应，给脱毒苗的检测带来困难。目前应用于马铃薯病毒检测的试剂盒多利用酶免法，这种方法受到血清学方法本身的灵敏度和假阳性的限制，无法对病毒进行高灵敏度和准确性的诊断。
[0006]本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对及其应用。[0007]本发明提供了一组引物对组合物，由特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙组成；所述特异引物对甲由序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成；所述特异引物对乙由序列表的序列3所示DNA分子和序列表的序列4所示DNA分子组成；所述特异引物对丙由序列表的序列5所示DNA分子和序列表的序列6所示DNA分子组成。
[0008]所述引物对组合物可用于辅助鉴定马铃薯病毒。[0009]所述引物对组合物可用于检测待测植物样本是否感染马铃薯病毒。
[0010]所述引物组合物可用于制备试剂盒。
[0011]所述引物组合物和阳性标准品可用于制备试剂盒；所述阳性标准品为重组质粒甲、重组质粒乙和重组质粒丙；所述重组质粒甲是将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒；所述重组质粒乙是将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入PMD18-T载体得到的重组质粒；所述重组质粒丙是将序列表的序列9所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。
[0012]所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):
[0013](a)辅助鉴定马铃薯病毒；
[0014](b)辅助检测待测植物样本是否感染马铃薯病毒。
[0015]本发明还保护一种应用所述引物对组合物辅助鉴定马铃薯病毒的方法，包括如下步骤:
[0016]以待测病毒的cDNA为模板，同时采用所述特异引物对甲、所述特异引物对乙和所述特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果所述PCR扩增产物为一种且大小为250-500bp (具体可为381-401bp，更具体可为391bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯X病毒；如果所述PCR扩增产物为一种，且大小为100-250bp (具体可为221-241bp，更具体可为231bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯S病毒；如果所述PCR扩增产物为一种，且大小为500-750bp (具体可为614-634bp，更具体可为624bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯卷叶病毒。
[0017]本发明还保护一种应用所述引物对组合物辅助鉴定马铃薯病毒的方法，包括如下步骤:`
[0018]以待测病毒的cDNA为模板，分别采用所述特异引物对甲、所述特异引物对乙和所述特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果采用所述特异引物对甲得到的PCR扩增产物为一种且大小为250-500bp (具体可为381-401bp，更具体可为391bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯X病毒；如果采用所述特异引物对乙得到的PCR扩增产物为一种且大小为100-250bp (具体可为221-241bp，更具体可为231bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯S病毒；如果采用所述特异引物对丙得到的PCR扩增产物为一种且大小为500-750bp (具体可为614-634bp，更具体可为624bp)，所述待测病毒为候选的马铃薯卷叶病毒。
[0019]本发明还保护一种应用所述引物对组合物辅助检测待测植物样本是否感染马铃薯病毒的方法，包括如下步骤:
[0020]以待测植物样本的cDNA为模板，同时采用所述特异引物对甲、所述特异引物对乙和所述特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0021]如果PCR扩增产物只有一种且大小为250_500bp (具体可为381_401bp，更具体可为391bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯X病毒；如果PCR扩增产物只有一种且大小为100-250bp (具体可为221-241bp，更具体可为231bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯S病毒；如果PCR扩增产物只有一种且大小为500-750bp (具体可为614-634bp，更具体可为624bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯卷叶病毒；
[0022]如果PCR扩增产物有两种，且大小分别为250_500bp(具体可为381_401bp，更具体可为391bp)和100-250bp (具体可为221-241bp，更具体可为231bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯X病毒和马铃薯S病毒；如果PCR扩增产物有两种，且大小分别为250-500bp(具体可为381-40Ibp，更具体可为39Ibp)和500_750bp (具体可为614_634bp，更具体可为624bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯X病毒和马铃薯卷叶病毒；如果PCR扩增产物有两种，且大小分别为100-250bp (具体可为221-241bp，更具体可为231bp)和500_750bp(具体可为614-634bp，更具体可为624bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒 ；
[0023]如果PCR扩增产物有三种，且大小分别为250_500bp(具体可为381_401bp，更具体可为391bp)、100-250bp (具体可为221_241bp，更具体可为231bp)和500_750bp (具体可为614-634bp，更具体可为624bp)，所述待测植物样本疑似感染马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒；
[0024]如果PCR扩增产物不为以上所述任何一种，所述待测植物样本疑似未感染马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒。
[0025]本发明还保护序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的特异引物对。
[0026]所述特异引物对可用于辅助鉴定马铃薯X病毒。
[0027]所述特异引物对可用于辅助检测待测植物样本是否感染马铃薯X病毒。
[0028]所述特异引物对可用于制备试剂盒的应用；所述试剂盒的功能为如下(C)或(d):
[0029](C)辅助鉴定马铃薯X病毒；
[0030](d)辅助检测待测植物样本是否感染马铃薯X病毒。
[0031]以上任一所述马铃薯病毒具体可为马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒。以上任一所述待测植物样本具体可为马铃薯植物样本。
[0032]本发明公开了用于辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对，具有良好的特异性和灵敏度，采用本发明提供的特异引物对组合，可以快速、准确、灵敏的同步检测出马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒。可将本发明提供的三对特异引物对组合得到试剂盒，用于马铃薯病毒的检测，具有高稳定性、高灵敏性、低突变性、低毒性等特点，可以广泛的推广应用。



[0033]图1为特异弓丨物对甲的特异性。
[0034]图2为特异弓丨物对乙的特异性。
[0035]图3为特异引物对丙的特异性。
[0036]图4为特异引物对甲检测马铃薯X病毒的灵敏度。
[0037]图5为特异引物对乙检测马铃薯S病毒的灵敏度。
[0038]图6为特异引物对丙检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度。
[0039]图7为应用特异引物对检测染病植物。

[0040]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMD18-T 购自 TaKaRa，货号:D101A。
[0041]马铃薯X病毒(PVX):公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献:王春香，高谦，潘乃機，陈章良.(1991)马铃薯X病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定?植物学报，33 (5):363-369.。
[0042]马铃薯S病毒(PVS):公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献:李广存，杨煜，王秀丽，李元军，毕玉平.(2004)马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.园艺学报，31 (4):517-519.。
[0043]马铃薯卷叶病毒(PLRV):公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献:路平，王蒂，司怀军.(2005)马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测.甘肃农业大学学报,4(40):532-534.。
[0044]实施例中所用的马铃薯植株均为中薯3号，购自中国农科院蔬菜花卉所。
[0045]2 X PCR buffer:含有 KCl 100mmol/L、MgCl 8mmol/L、dNTPs lmmol/L、Taq 酶 1U/U L、 Tris-Cl (PH8.3) 50mmol/L、10% (体积比)EvaGreen 染料(购自 Biotum 生物公司，货号:31000)，其余为水。
[0046]实施例1、马铃薯病毒引物的设计
[0047]根据三种马铃薯病毒的保守序列设计马铃薯X病毒(PVX)特异性引物20对、马铃薯S病毒(PVS)特异性引物20对、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物18对。经过筛选和优化，得到PVX、PVS、PLRV的特异性引物各1对，具体如下:
[0048]针对PVX的特异引物对(又称特异引物对甲，靶序列为39 1bp ):
[0049]上游引物F1:5’ -ACTGCAGGCGCAACTCCTGCCACAG-3’(序列表的序列 1)；
[0050]下游引物R1:5’ -GTGCTTGCCAGTTAGCAGGTGGAC-3’(序列表的序列 2)。
[0051 ] 针对PVX的特异引物对(又称特异引物对乙，靶序列为23 1bp ):
[0052]上游引物F2:5’-ATCGATGAGCTGTTCAAGATGG-3’(序列表的序列 3);
[0053]下游引物R2:5’ -GATCGAGTCCAAGGGCACTGCGCC-3’(序列表的序列 4)。
[0054]针对PLRV的特异引物对(又称特异引物对丙，靶序列为624bp ):
[0055]上游引物F3:5’ -AGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATG-3’(序列表的序列 5)；
[0056]下游引物R3:5’ -CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCAC-3’(序列表的序列 6)。
[0057]实施例2、引物对的特异性(单重RT-PCR)
[0058]一、特异引物对甲的特异性
[0059]分别将马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒进行如下步骤:
[0060]1、提取病毒的总RNA并反转录为cDNA。
[0061]2、以步骤I的cDNA为模板，采用特异引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0062]PCR 扩增体系:模板 2 μl，2 XPCR buffer 10 μl，上游引物(20 μM) 1 μl，下游引物(20μM) 1 u l，ddH20 6 μL。
[0063]PCR 扩增条件:94°C 3min ；94°C 30s、58°C 30s、72°C 30s, 30 个循环；72°C 10min。
[0064]3、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图1(图1中，泳道1为分子量标记，泳道2为马铃薯X病毒，泳道3为马铃薯S病毒，泳道4为马铃薯卷叶病毒)。结果表明，特异引物对甲特异性针对马铃薯X病毒(在250bp-500bp之间具有特异条带)，与其它马铃薯病毒没有交叉反应。回收特异条带并进行测序，其大小为391bp。
[0065]二、特异引物对乙的特异性
[0066]分别将马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒进行如下步骤:
[0067]1、提取病毒的总RNA并反转录为cDNA。
[0068]2、以步骤I的cDNA为模板，采用特异引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0069]PCR扩增体系和PCR扩增条件同步骤一。
[0070]3、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图2(图2中，泳道I为分子量标记，泳道2为马铃薯S病毒，泳道3为马铃薯X病毒，泳道4为马铃薯卷叶病毒)。结果表明，特异引物对乙特异性针对马铃薯S病毒(在100bp-250bp之间具有特异条带)，与其它马铃薯病毒没有交叉反应。回收特异条带并进行测序，其大小为231bp。
[0071]三、特异引物对丙的特异性
[0072]分别将马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和马铃薯卷叶病毒进行如下步骤:
[0073]1、提取病毒的总RNA并反转录为cDNA。
[0074]2、以步骤I的cDNA为模板，采用特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0075]PCR扩增体系和PCR扩增条件同步骤一。
[0076]3、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图3(图3中，泳道I为分子量标记，泳道2为马铃薯卷叶病毒，泳道3为马铃薯S病毒，泳道4为马铃薯X病毒)。结果表明，特异引物对丙特异性针对马铃薯卷叶病毒(在500bp-750bp之间具有特异条带)，与其它马铃薯病毒没有交叉反应。回收特异条带并进行测序，其大小为624bp。
[0077]实施例3、引物对的灵敏度
[0078]一、特异引物对甲的灵敏度
[0079]1、提取马铃薯X病毒的总RNA并反转录为cDNA，用核酸蛋白分析仪测定cDNA浓度，经测定，PVX的cDNA浓度为501.5ng/ U I。
[0080]2、用无菌水将 cDNA 稀释为 400ng/ u l、300ng/ u l、200ng/ u 1> IOOng/ u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七个浓度梯度的稀释液(按浓度从高至低，依次命名为稀释液I至稀释液7)。
[0081]3、分别以各个稀释液为模板，采用特异引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0082]PCR扩增体系和PCR扩增条件同实施例2的步骤一。
[0083]4、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图4(图4中，泳道I为分子量标记；泳道2-8依次代表以稀释液I至稀释液7为模板)。特异引物对甲检测马铃薯X病毒的最低浓度为50ng/ V-1。
[0084]二、特异引物对乙的灵敏度
[0085]1、提取马铃薯S病毒的总RNA并反转录为cDNA，用核酸蛋白分析仪测定cDNA浓度，经测定，PVS的cDNA浓度为460.4ng/ U I。
[0086]2、用无菌水将 cDNA 稀释为 400ng/ u l、300ng/ u l、200ng/ u 1> IOOng/ u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七个浓度梯度的稀释液(按浓度从高至低，依次命名为稀释液I至稀释液7)。
[0087]3、分别以各个稀释液为模板，采用特异引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0088]PCR扩增体系和PCR扩增条件同实施例2的步骤一。
[0089]4、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图5(图5中，泳道I为分子量标记；泳道2-8依次代表以稀释液I至稀释液7为模板)。特异引物对乙检测马铃薯S病毒的最低浓度为50ng/ V-1。
[0090]三、特异引物对丙的灵敏度
[0091]1、提取马铃薯卷叶病毒的总RNA并反转录为cDNA，用核酸蛋白分析仪测定cDNA浓度，经测定，PLRV的cDNA浓度为568.4ng/ U I。
[0092]2、用无菌水将 cDNA 稀释为 400ng/ u l、300ng/ii l、200ng/ii lU00ng/u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七个浓度梯度的稀释液(按浓度从高至低，依次命名为稀释液I至稀释液7)。
[0093]3、分别以各个稀释液为模板，采用特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0094]PCR扩增体系和PCR扩增条件同实施例2的步骤一。
[0095]4、将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图6(图6中，泳道I为分子量标记；泳道2-8依次代表以稀释液I至稀释液7为模板)。特异引物对丙检测马铃薯卷叶病毒的最低浓度为25ng/ V-1。
[0096]实施例4、应用特异引物对检测染病植物
`[0097]将马铃薯X病毒接种健康马铃薯植株，10天后取出现发病表征的叶片，作为植物样本甲。将马铃薯S病毒接种健康马铃薯植株，10天后取出现发病表征的叶片，作为植物样本乙。将马铃薯卷叶病毒接种健康马铃薯植株，10天后取出现发病表征的叶片，作为植物样本丙。马铃薯X病毒引起的发病表征为:马铃薯3、4片叶时产生轻叶症，有时叶脉间出现坏死斑。马铃薯S病毒引起的发病表征为:叶背面产生条斑，叶卷曲，或叶表面呈油光、皱缩、条斑。马铃薯卷叶病毒引起的发病表征为:叶片向上卷曲，叶变厚，发脆。
[0098]1、提取植物样本甲的总RNA并反转录为cDNA，作为cDNA样本甲。
[0099]2、提取植物样本乙的总RNA并反转录为cDNA，作为cDNA样本乙。
[0100]3、提取植物样本丙的总RNA并反转录为cDNA，作为cDNA样本丙。
[0101]4、分别进行如下几组PCR体系的PCR扩增:
[0102]PCR体系-1:cDNA样本甲2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特异引物对甲的上游引物(20iiM) liil，特异引物对甲的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0103]PCR体系-2:cDNA样本乙2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特异引物对乙的上游引物(20iiM) liil，特异引物对乙的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0104]PCR体系-3:cDNA样本丙2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特异引物对丙的上游引物(20iiM) liil，特异引物对丙的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0105]PCR 体系-4:cDNA 样本甲 Iii 1，cDNA 样本乙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特异引物对甲和特异引物对乙的上游引物(20 ii M)各I ill，特异引物对甲和特异弓丨物对乙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 I。
[0106]PCR 体系-5:cDNA 样本甲 Iii 1，cDNA 样本丙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特异引物对甲和特异引物对丙的上游引物(20 ii M)各I ill，特异引物对甲和特异弓丨物对丙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 4u I。
[0107]PCR 体系-6:cDNA 样本乙 Iii 1，cDNA 样本丙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特异引物对乙和特异引物对丙的上游引物(20 ii M)各I ill，特异引物对乙和特异引物对丙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 I。
[0108]PCR 体系-7:cDNA 样本甲 0.1，cDNA 样本乙 0.7 y 1，cDNA 样本丙 0.7 y 1，2XPCRbuffer 10 iil，特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙的上游引物(20 PM)各I iil，特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙的下游引物(20 PM)各I yl，ddH201.9u 10
[0109]PCR扩增条件同实施例2的步骤一。
[0110]PCR体系-1、PCR体系-3和PCR体系-5的1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果见图7A，其中泳道I为分子量标记，泳道2为PCR体系-3，泳道3为PCR体系-1，泳道4为PCR体系_5。
[0111]PCR体系-2、PCR体系-3和PCR体系-6的结果见图7B，其中泳道I为分子量标记，泳道2为PCR体系-3，泳道3为PCR体系-2，泳道4为PCR体系-6。
[0112]PCR体系-1、PCR体系-2和PCR体系_4的结果见图7C，其中泳道I为分子量标记，泳道2为PCR体系-1，泳道3为PCR体系-2，泳道4为PCR体系-4。
[0113]PCR体系-1、PCR体系-2、PCR体系_3和PCR体系_7的结果见图7D，其中泳道I为PCR体系-3，泳道2为PCR体系-1，泳道3为PCR体系-2，泳道4为PCR体系-7，泳道5为分子量标记。
[0114]在双重PCR中都有两条明亮的条带，大小与预期相符。三重PCR中出现三条与预期相符的条带。结果表明，三对特 异引物对在同一管PCR反应体系中具有较好地兼容性。
[0115]实施例5、阳性标准品的制备和应用
[0116]一、阳性标准品的制备
[0117]合成序列表的序列7所示的双链DNA分子，插入PMD18-T载体，得到重组质粒甲。
[0118]合成序列表的序列8所示的双链DNA分子，插入pMD18-T载体，得到重组质粒乙。
[0119]合成序列表的序列9所示的双链DNA分子，插入pMD18-T载体，得到重组质粒丙。
[0120]二、阳性标准品的应用
[0121]1、以重组质粒甲为模板，采用特异引物对甲进行PCR扩增，然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物只显示一条带，即391bp的条带。
[0122]2、以重组质粒乙为模板，采用特异引物对乙进行PCR扩增，然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物只显示一条带，即231bp的条带。
[0123]3、以重组质粒丙为模板，采用特异引物对丙进行PCR扩增，然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物只显示一条带，即624bp的条带。