马铃薯的马铃薯y病毒组抗性的制作方法[0001]相关专利申请案的交叉参考[0002]本申请案主张对2010年10月18日提出申请的美国临时申请案第61/394，081号和2011年5月4日提出申请的美国临时申请案第61/482，579号的优先权，全部临时申请案均以引用的方式并入本文中。[0004]马铃薯植物的马铃薯Y病毒组(potyvirus)感染根据病毒株而导致各种症状。这些症状包括产量损失、叶片卷曲、轻微斑点、感染区域和感染周围区域的快速死亡、扭曲和易碎的叶片、有褶皱且粗糙的叶片和马铃薯块茎坏死环斑病。坏死环斑病使得马铃薯不能上市销售且因此可导致收入明显损失。马铃薯Y病毒组可通过蚜虫载体传播，但也可在种用马铃薯中保持休眠。此意味着使用相同品系的马铃薯产生种用马铃薯用于几次连续世代将导致病毒载量的递增且随后作物损失。[0005]对抗特定马铃薯Y病毒组菌株的隐性抗性可与番茄、胡椒、甜瓜、大麦、生菜和豌豆中eIF4E蛋白质的一个 或几个氨基酸取代相关联(图1)。尽管这些取代显示出聚类，但已证明难以设计新的耐eIF4E介导的疾病的型式。[0006]eIF4E基因介导的抗性是隐性的，但已展示胡椒基因pvrl当在番茄中过表达时提供显性马铃薯Y病毒组抗性(康(Kang)等人,植物生物技术杂志(Plant BiotechnolJ) 5:526-536)。[0007]使用耕作(TILLING)不可能在四倍体马铃薯中发展马铃薯Y病毒组抗性(皮隆(Piron)等人，公共科学图书馆?综合(PLoS ONE) 5，2010)。此方法需要使用近交系(其不可能在四倍体马铃薯中产生)以及回交(以将所述性状与全基因组诱发突变处理所诱导的不希望突变隔离)。由于马铃薯是高度杂合子且遭受近交衰退，因此回交导致适应性降低且可触发幼苗死亡。[0008]还不知道关于马铃薯和其性相容“野生马铃薯”亲缘植物中的马铃薯Y病毒组抗性的分子基础的信息。此知识的缺乏使得不可能通过全植物源DNA转化(all-native DNAtransformation，一种被认为更为用户所接受的新的遗传改造途径)将抗性纳入到现有品种中。
[0009]马铃薯eIF4E 蛋白质具有共有序列 DX1X2X3X4K SX5Q X6Aff GSS X7RX8X9YTFSX10VEX11FffX12X13YN NIH X14P S KLX15X16GA D (SEQ ID NO: 25)的 46-氨基酸结构域，由此至少一个中性氨基酸(“χ”)由带电荷氨基酸取代或者至少一个带电荷氨基酸由中性氨基酸或具有相反电荷的氨基酸取代。参见美国专利第7，919，677号。还证实(i)中性氨基酸X3由负性氨基酸谷氨酸盐(E)代替，或(ii)中性氨基酸X7由正性氨基酸精氨酸(R)代替可获得马铃薯Y病毒组抗性。参见美国专利第7，772，462B2号。这些研究还指出抗性可通过用精氨酸代替8位的氨基酸来获得。
[0010]马铃薯与数百种野生马铃薯物种是性相容的，此意味着其是异常庞大且多样化基因库的一部分。然而，尽管存在此显著的竞争优势，但现有马铃薯品种均未显示对抗农业基因组学上重要的马铃薯Y病毒组病原体马铃薯病毒Y(PVY)的抗性。


[0011]本发明技术的一个方面是将PVY抗性赋予植物达至少一段时期的方法，其包含:
[0012](A)在植物的细胞中表达以下中的至少一者:(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwpl基因，或(ii)包含序列SEQ ID N0:4的全长pwp2基因；或者
[0013](B)在植物的细胞中表达以下中的至少一者:(i)包含序列SEQ ID NO:2的全长pwpl基因，或(ii)包含序列SEQ ID N0:4的全长pwp2基因，以及下调植物的内源性eIF4E基因的表达；或者
[0014](C)表达以下中的至少一者:(i) SEQ ID NO: 2的N-末端截短片段或(ii) SEQ IDNO:4的N-末端截短片段；或者
[0015](D)使植物的内源性eIF4E基因的序列发生突变以包含至少两个来自以下组成的群组的点突变:SEQ ID NO:6 ^ (i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T761、(vi)A77D、(vii)V1281、(viii)A130S、(ix)S172N 和(x) S175V，或 SEQ ID NO: 6 的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v) L140P，所述点突变赋予对PVY的抗性达至少一段时期；
[0016]其中所述植物完全抵抗PVY病毒感染，或在一段时期之后显现PVY疾病的一种或一种以上症状。
[0017]在一个实施例中，片段选自由以下组成的群组:(i) SEQ ID NO: 20、(ii)SEQ IDN0:21。
[0018]在另一实施例中，所述时期选自由以下组成的群组:⑴I到3天；(ii) 3到5天；(iii) 5 到 7 天；(iv) 7 到 9 天；(v) 9 到 11 天；(vi) 11 到 13 天；(vii) 13 到 15 天；(viii) 2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周；(xi) 5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
[0019]在另一实施例中，所述植物选自由以下组成的群组:(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
[0020]在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状:(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(V)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌(Phytophthora)具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
[0021]本发明技术的另一方面是转化植物以完`全抵抗PVY病毒疾病或以抵抗PVY疾病的一种或一种以上症状的发作达一段时期的方法，所述方法包含利用编码具有选自由以下组成的群组的序列的蛋白质的多核苷酸转化所述植物:(i) SEQ ID NO: 26, (ii)SEQ ID NO:28和(iii)选自由SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 32组成的群组的序列的N-末端截短片段。
[0022]在一个实施例中，所述时期选自由以下组成的群组:⑴I到3天；(ii)3到5天；(iii)5 到 7 天；(iv)7 到 9 天；(v)9 到 11 天；(vi) 11 到 13 天；(vii) 13 到 15 天；(viii) 2到3周；(ix)3到4周；(x)4到5周;(xi) 5到7周；(xii)7到10周；(xii)2到3个月和(xiii)3到5个月。
[0023]在另一实施例中，片段选自由以下组成的群组:(i)SEQ ID NO: 16和(ii) SEQ IDN0:23。
[0024]在另一实施例中，植物选自由以下组成的群组:(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
[0025]在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状:(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(V)低丙烯酰胺、(Vi)对疫霉菌具有抗性、(Vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(Viii)增加的抗氧化剂。
[0026]在另一实施例中，植物的内源性eIF4E基因被下调或抑制。举例来说，天然eIF4E基因的RNA转录物或天然eIF4E基因的蛋白质产物的量可降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0027]在另一实施例中，经转化植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状:⑴低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(v)低丙烯酰胺、(vi)对疫霉菌具有抗性、(vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(viii)增加的抗氧化剂。
[0028]本发明技术的另一方面是分离的多核苷酸，其包含序列，所述序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80% —致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代:SEQ ID N0:6的(i)T54A、(ii)S68N、
(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T761、(vi)A77D、(vii)V1281、(viii)A130S、(ix)S172N 和(x)S175V，或 SEQ ID NO:6 的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P;或(B)编码包含序列 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:4 的蛋白质，(C)编码 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或⑶编码包含序列SEQ ID N0:27或SEQ ID N0:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27, SEQ ID N0:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
[0029]S68N取代是在SEQ ID NO:25的由X1代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期S68可更换为另一种中性氨基酸，例如丙氨酸和半胱氨酸。
[0030]S68N取代是在SEQ ID NO:25的由X1代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期S68可更换为另一种中性氨基酸，例如丙氨酸和半胱氨酸。
[0031]I70T取代是在SEQ ID NO:25的由X3代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期170可更换为另一种中性氨基酸，例如缬氨酸和亮氨酸。
[0032]K72R取代是在SEQ ID NO: 25的由6位代表的位置处的中性到中性氨基酸变化。本发明技术预期K72可更换为另一种正性氨基酸,例如组氨酸和赖氨酸。
[0033]A77D取代是在SEQ ID NO:25的由11位代表的位置处的中性到负性氨基酸变化。本发明技术预期A77可更换为另一种负性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸。
[0034]在一个实施例中，多核苷酸编码的蛋白质与SEQ ID NO:2、4或6、或与SEQ IDNO: 2、4 或 6 的部分序列片段具有至少约 99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81% 或 80% 序列一致性。就此来说，SEQ ID NO:2、4或6的部分序列片段是指包含多于2个连续氨基酸且在植物上也起到赋予对PVY病毒的抗性的作用的肽片段。因此，在一个实施例中，SEQ ID NO: 2、4或6的部分序列片段赋予植物PVY抗性且包含SEQ ID NO:2、4或6的15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79 个、80 个、81 个、82 个、83 个、84 个、85 个、86 个、87 个、88 个、89 个、90 个、91 个、92 个、93个、94 个、95 个、96 个、97 个、98 个、99 个、100 个、101 个、102 个、103 个、104 个、105 个、106个、107 个、108 个、109 个、110 个、111 个、112 个、113 个、114 个、115 个、116 个、117 个、118个、119 个、120 个、121 个、122 个、123 个、124 个、125 个、126 个、127 个、128 个、129 个、130个、131 个、132 个、133 个、134 个、135 个、136 个、137 个、138 个、139 个、140 个、141 个、142个、143 个、144 个、145 个、146 个、147 个、148 个、149 个、150 个、151 个、152 个、153 个、154个、155 个、156 个、157 个、158 个、159 个、160 个、161 个、162 个、163 个、164 个、165 个、166个、167 个、168 个、169 个、170 个、171 个、172 个、173 个、174 个、175 个、176 个、177 个、178个、179 个、180 个、181 个、182 个、183 个、184 个、185 个、186 个、187 个、188 个、189 个、190个、191 个、192 个、193 个、194 个、195 个、196 个、197 个、198 个、199 个、200 个、201 个、202个、203 个、204 个、205 个、206 个、207 个、208 个、209 个、210 个、211 个、212 个、213 个、214个、215 个、216 个、217 个、218 个、219 个、220 个、221 个、222 个、223 个、224 个、225 个、226个、227个、228个、229个、230个或231个连续氨基酸。
[0035]在另一实施例中，多核苷酸编码本文所揭示的赋予植物PVY抗性的任何序列的N-末端截短片段，其中所述片段包含(i)SEQ ID N0:2、4或6的残基40-231，或(ii)SEQID NO: 2、4 或 6 的残基 50-231，或(iii) SEQ ID NO: 2、4 或 6 的残基 51-231，或(iv) SEQ IDNO:2、4或6 的残基52-231，或(v)SEQ ID NO:2、4或6 的残基53-231 ;或(vi) SEQ ID N0:2、4 或 6 的残基 54-231，或(vii)SEQ ID NO: 2、4 或 6 的残基 55-231，或(viii) SEQ ID NO: 2、4或6的残基60-231。[0036]在另一实施例中，SEQ ID N0:2的片段包含一个或一个以上以下氨基酸的组合:(N68，T70)、(N68，R72)、(N68, 176)、(N68, D77)、(N68，I128)、(N68, S130)、(N68，N172)、(N68，V175)、(T70，N68)、(T70, R72)、(T70, 176)、(T70, D77)、(T70，I128)、(T70, S130)、(T70，N172)、(T70，V175)、(R72, N68)、(R72, T70)、(R72, 176)、(R72, D77)、(R72，I128)、(R72，S130)、(R72，N172)、(R72, V175)、(176，N68)、(176，T70)、(176，R72)、(176，D77)、(176,1128)、(I76，S130)、(176，N172)、(176，V175)、(D77, N68)、(D77, T70)、(D77, R72)、(D77,176)、(D77,1128)、(D77,S130)、(D77, N172)、(D77, V175)、(1128，N68)、(1128，T70)、(I128，R72)、(1128,176)、(I128，D77)、(I128，S130)、(I128，N172)、(1128，V175)、(S130，N68)、(S130，T70)、(S130, R72)、(S130, 176)、(S130, D77)、(S130，I128)、(S130，N172)、(S130，V175)、(N172, N68)、(N172, T70)、(N172, R72)、(N172, 176)、(N172，D77)、(N172，I128)、(N172, S130)、(N172, V175)、(V175, N68)、(V175, T70)、(V175，R72)、(V175，I76)、(V175, D77)、(V175，I128)、(V175, S130)和(V175, N172)。此编号方案反映了所指示残基在SEQ ID N0:2内的位置。因此，“N68”是指天冬酰胺在SEQ IDNO:2的68位处；“T70”表明残基苏氨酸在SEQ ID NO:2的70位处等等。在一个实施例中，SEQ ID NO: 2的部分序列片段是含有一个或一个以上SEQ ID NO: 2的以下氨基酸的SEQ IDNO:2 的片段:(i)N68、(ii)T70、(iii)R72、(iv)I76、(v)D77、(vi)I128、(vii)S130、(viii)N172和(ix)V1750
[0037]在另一实施例中，SEQ ID N0:4的片段包含一个或一个以上以下氨基酸的组合:(T10，A23)、(T10，Y57)、(Τ10, Ν99Υ)、(T10, S140)、(A23, Y57)、(A23, N99Y)、(A23, S140)、(Y57, N99Y)、(Y57, S140)、(N99Y, S140)。此编号方案反映了所指示残基在 SEQ ID NO:4 内的位置。因此，“T10”是指苏氨酸在SEQ ID NO:4的10位处；“A23”表明残基丙氨酸在SEQID NO: 4的23位处等等。在一个实施例中，SEQ ID NO: 4的部分序列片段是含有一个或一个以上 SEQ ID NO:4 的以下氨基酸的 SEQ ID N0:4 的片段:(i)T10、(ii)A23、(iii)Y47、(iv)N99 和(V)SI40。
[0038]在另一实施例中，SEQ ID NO:6的片段包含一个或一个以上SEQ ID N0:6的以下氨基酸取代的组合:(S68N, I70T)、(S68N, K72R)、(S68N, T76I)、(S68N, A77D)、(S68N, V128I)、(S68N, A130S)、(S68N, S172N)、(S68N, S175V)、(I70T, S68N)、(I70T, K72R)、(I70T, T76I)、(I70T, A77D)、(I70T, V128I)、(I70T, A130S)、(I70T, S172N)、(I70T, S175V)、(K72R, S68N)、(K72R，I70T)、(K72R，T76I)、(K72R, A77D)、(K72R, V128I)、(K72R, A130S)、(K72R, S172N)、(K72R, S175V)、(T76I, S68N)、(T76I, I70T)、(T76I, K72R)、(T76I，A77D)、(T76I, V128I)、(T76I, A130S)、(T76I, S172N)、(T76I, S175V)、(A77D, S68N)、(A77D, I70T)、(A77D, K72R)、(A77D, T76I)、(A77D, V128I)、(A77D, A130S)、(A77D, S172N)、(A77D, S175V)、(V128I, S68N)、(V128I, I70T)、(V128I,K72R)、(V128I, T76I)、(V128I, A77D)、(V128I, A130S)、(V128I, S172N)、(V128I, S175V)、(A130S, S68N)、(A130S, I70T)、(A130S, K72R)、(A130S, T76I)、(A130S, A77D)、(A130S, V128I)、(A130S, S172N)、(A130S, S175V)、(S172N, S68N)、(S172N, I`70T)、(S172N, K72R)、(S172N, T76I)、(S172N, A77D)、(S172N, V128I)、(S172N, A130S)、(S172N, S175V)、(S175V, S68N)、(S175V, I70T)、(S175V, K72R)、(S175V, T76I)、(S175V, A77D)、(S175V, V128I)、(S175V, A130S)和(S175V, S172N)。
[0039]在另一实施例中，SEQ ID NO:6的片段包含一个或一个以上SEQ ID N0:6的以下氨基酸取代的组合:(Tl0M, A23G)、(Tl0M, Y57F)、(Tl0M, N99Y)、(Tl0M, L140P)、(A23G, Y57F)、(A23G, N99Y)、(A23G, L140P)、(Y57F, N99Y)、(Y57F, L140P)和(N99Y, L140P)。
[0040]在一个实施例中，片段选自由以下组成的群组:(i)SEQ ID NO:20, (ii)SEQ IDNO:21、 (iii)SEQ ID NO:16 和(iv)SEQ ID NO:23。
[0041]本发明技术的另一方面是载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID NO:6的至少15个连续氨基酸具有至少80% —致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代:SEQ ID NO: 6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T761、(vi)A77D、(vii)V1281、(viii)A130S、(ix)S172N 和(x)S175V，或 SEQ ID NO:6 的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P ;或(B)编码包含序列SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID N0:2或SEQ IDNO:4的N-末端截短片段；或⑶编码包含序列SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28的蛋白质；或(E)编码序列SEQ ID NO:27, SEQ ID N0:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
[0042]在一个实施例中，多核苷酸位于土壤杆菌(Agrobacterium)转移DNA中。
[0043]在另一实施例中，土壤杆菌转移DNA包含与任何土壤杆菌T-DNA边界序列均非100% 一致的边界样序列。
[0044]本发明技术的另一方面是在其基因组中包含多核苷酸或以其它方式表达所述多核苷酸的植物，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID N0:6的至少15个连续氨基酸具有至少80% —致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代:SEQ ID NO:6 ^ (i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、(iv)K72R、(v)T761、(vi)A77D、(vii)V1281、(viii)A130S、(ix)S172N 和(x) S175V，或 SEQ ID NO: 6 的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P ;或(B)编码包含序列 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的N-末端截短片段；或⑶编码包含序列 SEQ ID N0:27 或SEQ ID NO:28 的蛋白质；或(E)编码序列 SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29或SEQ ID NO: 32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达是赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。
[0045]在一个实施例中，植物选自由以下组成的群组:(i)马铃薯、(ii)番茄、(iii)生菜和(iv)胡椒。
[0046]另一实施例是从植物生长的块茎、叶片或果实。
[0047]在另一实施例中，所述植物具有一种或一种以上选自由以下组成的群组的额外性状:(i)低还原糖、(ii)低游离天冬酰胺、(iii)低损伤性、(iv)降低的低温诱导甜化、(V)低丙烯酰胺、(Vi)对疫霉菌具有抗性、(Vii)降低的淀粉磷酸酯水平和(Viii)增加的抗氧化剂。
[0048]本发明技术的另一方面`制造食品的方法，其包含:(I)利用根据技术方案13所述的多核苷酸转化植物；(2)使所述经转化植物生长并从植物获得块茎、果实或叶片；和(3)(i)将块茎、果实或叶片作为食品直接使用或(ii)将块茎、果实或叶片加工成食品。
[0049]在一个实施例中，植物的内源性eIF4E基因的表达被下调或抑制。举例来说，天然eIF4E基因的RNA转录物或天然eIF4E基因的蛋白质产物的量可降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0050]在另一实施例中，经转化植物的实质上所有的细胞均表达多核苷酸。
[0051]在另一实施例中，经转化植物的至少5个叶片表达多核苷酸。
[0052]在另一实施例中，经转化植物的至少50%细胞表达多核苷酸。
[0053]在另一实施例中，多核苷酸表达持续至少I周。
[0054]本发明技术的另一方面是通过制造食品的方法制得的食品，其包含:(1)利用根据权利要求13所述的多核苷酸转化植物；(2)使所述经转化植物生长并从植物获得块茎、果实或叶片；和(3) (i)将块茎、果实或叶片作为食品直接使用或(ii)将块茎、果实或叶片加工成食品。
[0055]本发明技术的另一方面是食品，其包含从在其基因组内包含多核苷酸或以其它方式表达所述多核苷酸的植物获得的植物细胞，所述多核苷酸包含的序列(A)编码与eIF4E蛋白质序列SEQ ID N0:6的至少15个连续氨基酸具有至少80%—致性的蛋白质且包含至少两个选自由以下组成的群组的氨基酸取代:SEQ ID NO:6的(i)T54A、(ii)S68N、(iii)I70T、
(iv)K72R、(v)T761、(vi)A77D、(vii)V1281、(viii)A130S、(ix)S172N 和(x) S175V，或 SEQID NO:6 的(i)T10M、(ii)A23G、(iii)Y57F、(iv)N99Y、(v)L140P ;或(B)编码包含序列 SEQID N0:2或SEQ ID N0:4的蛋白质，(C)编码SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的N-末端截短片段；或⑶编码包含序列SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的蛋白质；或(E)编码序列SEQID NO:27, SEQ ID N0:29或SEQ ID NO:32的N-末端截短片段；其中多核苷酸当在植物中表达时赋予对PVY疾病的完全或部分抗性。



[0056]图1:与隐性抗性相关联的eIF4E蛋白质的比对。在每一抗性等位基因中所观察到的突变加下划线。
[0057]图2:由来自马铃薯(potato, S.tuberosum)和来自野生马铃薯物种的种质(accession)非结薯马铃薯种(S.etuberosum)、恰柯薯(S.chacoense)和落果薯(S.demissum)的隔离个体的eIF4E编码的蛋白质的比对。pwpl是从非结薯马铃薯种的种质PI245939、恰柯薯种质PI175446和PI175419以及落果薯种质PI175423中分离。pwp2是从匍枝薯(S.stoloniferum)种质PI195195和PI275244分离。两种野生型等位基因之间的多态性加下划线，且野生马铃薯等位基因上的突变也加下划线。
[0058]图3:具有与隐性抗性相关联的先前表征的eIF4E蛋白质的pwpl和pwp2的比对。pwpl和pwp2上的突变加下划线。
[0059]图4:pwpl、Pwp2和SteIF4EA77D蛋白质在酵母双杂交系统中的vpg结合能力。(顶部板)pwpl和P wp 2 结合能力:(左侧)SD (-Leu、-Trp)板上的酵母转化株。(右侧)SD(-Leu、-Trp、-His)板上的酵母转化株。诱馆质粒(bait plasmid)PBD用于表达来自PVY菌株NTN的vpg。猎物质粒(prey plasmid) PAD用于表达野生型马铃薯EIF4E和野生马铃薯 pwpl 和 pwp2。1-4:单一载体转化株(I, PBD-vpg ；2, PAD-wt EIF4E ；3, PAD-pwpI ；4，PAD_pwp2)。5-6:双重载体共转化株(5, PBD-vpg+PAD-wt EIF4E ；6, PBD-vpg+PAD-pwpl ；7，PBD-vpg+PAD-pwp2)。在亮氨酸、色氨酸介质上生长的来自每一共转化的菌落表明存在两种构建体。仅PBD-VPg/PAD-WTEIF4E共转化株在亮氨酸、色氨酸、组氨酸板上生长表明仅wtEIF4E与VPg相互作用，而pwpl和pwp2不与VPg相互作用。(底部板)SteIF4EA77D结合能力。将两个独立的酵母转化株在SD (-Leu, -Trp, -His)板上划线。I和4 (PAD:: SteIF4EA77D和 PBD::VPg)，2 和 5(PAD::SteIF4E 和 PBD::VPg)，3 和 6 (PAD::SteIF4EA77D)。PBD-VPg/PAD-SteIF4EA77D共转化株在亮氨酸、色氨酸、组氨酸板上生长表明仅A77D突变不能废除SteIF4E蛋白质的VPg结合能力。
[0060]图5:pSIM1567植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(Burbank)(Wt)、空白载体对照(VC)和转基因pSIM1567(l-25)植株的叶片组织中分离，在凝胶上运行，转移到尼龙(nylon)膜上并根据标准试验方案与经Dig标记的马铃薯EIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。
[0061]图6:用于PVY控制的全植物源转移DNA。
[0062]图7:pSIM1719品系的叶片中的Fpvr的转录水平。RBc是黄褐色布尔班克对照且401c是空白载体对照。[0063]图8:所选pSM1569植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSM1569(9、16、18、23、25)植株的叶片组织中分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的马铃薯EIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。
[0064]图9:所选pSM1588 (经修饰胡椒eIF4El，mpel，过表达)植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSM1588(2、5、7、9、12、
13、18、19、20和23)植株的叶片组织分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的胡椒eIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。品系7、9、13、19和20在感染后抵抗PVY达2周，且品系9和13在感染后抵抗PVY达4周。品系2、5、12、18、23易受感染。
[0065]图10:所选pSM1723 (经修饰胡椒eIF4E2，mpe2,过表达)植株的RNA凝胶印迹分析。将RNA从野生型布尔班克(wt)、空白载体对照(401)和转基因pSM1723(6、7、9、10、
15、19、20和22)植株的叶片组织分离，在凝胶上运行，转移到尼龙膜并根据标准试验方案与经Dig标记的胡椒eIF4E探针杂交。使用EB染色的核糖体RNA作为负载量对照。品系9和20在感染后抵抗PVY达2周，品系20在感染后抵抗PVY达4周，且品系6、7、10、15、19和22易受感染。

[0066]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与所属领域的技术人员通常所了解意义相同的意义。通常，本文所用的命名法和本文所描述的在细胞培养、分子遗传学和核酸化学和杂交中的试验程序均是此项技术中众所周知且普遍采用的那些。使用标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析和医药调配和递送。通常，酶反应和纯化和/或分离步骤是根据制造商说明书执行。这些技术和程序通常根据常规方法来执行，例如在“分子克隆试验手册(`Molecular cloning a laboratory manual)”,第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港(ColdSpring Harbor, N.Y.) (1989)和分子生物学实验手册(Current protocols in molecularbiology),约翰.威利父子公司(John Wiley&Sons),马里兰州巴尔的摩(Baltimore, Md.)(1989)中所揭示。
[0067]“土壤杆菌”是指用于转化植物细胞且一般含有载体的根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌的卸甲(disarmed)及毒性衍生物的任何土壤杆菌属。载体通常含有位于T-DNA的边界之间或根据本发明在“植物_DNA”( “P-DNA”)的边界样序列(参见下文定义)之间的所要多核苷酸，所述边界(样)序列能够将所要多核苷酸转移到植物基因组中。土壤杆菌属的实例包括(但不限于)土壤杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、叶杆菌属(Phyllobacteriumsp.)、大豆根瘤菌属(SinoRhizobium sp.)和中间根瘤菌属(MesoRhizobium sp.)。
[0068]“氨基酸序列”包括从植物中分离、源于植物或在植物中天然存在或以合成方式制得但包含内源性对应物的核酸序列的低聚肽、肽、多肽或蛋白质和其片段。
[0069]“人工操纵”是指通过人工或通过机械手段或重组手段(例如通过遗传改造技术)移动、布置、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未经操纵的天然存在的对应物相比具有不同的生物学、生物化学、形态学或生理学表型和/或基因型的植物或植物细胞
[0070]“无性繁殖”是指通过从叶插、茎插、根插、块茎眼(tuber eye)、匍匐枝、单一植物细胞原生质体、愈伤组织(callus)等生成整个植株来产生后代，而不涉及配子融合。
[0071]“骨架”是指除去待整合到植物基因组中的特定盒或表达盒或构建体以外的载体或质粒的核酸序列。举例来说，在土壤杆菌转移质粒的情形中，骨架是除去位于引入和/或整合到植物基因组中的所要核酸内的特定T-DNA或P-DNA序列以外的整个质粒。因此，此质粒的骨架可含有其它表达盒，例如用于表达可选标记但不希望转移到植物基因组中的那些表达盒。这些不打算转移到植物基因组中的盒和构建体因此可视为质粒或载体“骨架”的构成部分。
[0072]“细菌介导的植物转化”是指植物改性，其通过利用选自由土壤杆菌属、根瘤菌属、叶杆菌属、大豆根瘤菌属和中间根瘤菌属组成的群组的细菌感染植物或源自所述植物的外植体或细胞，以将在所述细菌中复制的质粒的至少一部分转移到个别植物细胞的细胞核中用于随后稳定整合到所述植物细胞的基因组中。
[0073]“双元质粒”或“双元构建体”是指可保持在大肠杆菌(E.coli)和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens) 二者中且含有T-DNA右侧和左侧边界的质粒,所述边界侧接至少10个侧接土壤杆菌Ti或Ri质粒中的这些元件的DNA碱基对。“边界和边界样序列”是促使转化载体T-DNA或P-DNA的裂解的土壤杆菌衍生的或植物源序列。通常，左侧边界序列和右侧边界序列侧接T-DNA或P-DNA且它们均起到virD2催化的切割反应的识别位点的作用。此活动释放位于这些边界之间的核酸。参见下表1针对边界序列的实例。
[0074]表1.“边界”和“边界样”序列
[0075]`[0076]