专利名称：副溶血性弧菌检测用引物组及方法副溶血性弧菌检测用弓I物组及方法副溶血性弧菌(Bibrio Parahemolyticus),又称嗜盐杆菌，属于非霍乱弧菌，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，副溶血性弧菌是最常见的食源性细菌病原体，在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血性弧菌污染，在广东、广西、海南、江苏、浙江等养殖老区尤为严重，已成为我国重要的食源性致病菌。传统副溶血性弧菌检测方法是一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原，虽然可靠的，但却很费力、耗时，需要4 7天才能完成。因此，在需要及时、 快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10 15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出副溶血性弧菌，这些方法通称为快速检测。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本的荣研株式会的Notomi T等2000年在Nucleic. Acids. Res.杂志上报道的一种新的核酸扩增方法。LAMP方法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应。可以在I小时之内，将靶基因DNA片段扩增109-1010倍，并且只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定是否扩增，不需要电泳检测过程。LAMP方法的原理决定了它具有许多其它DNA扩增方法无法比拟的优点(I)操作简单，无需特殊设备=LAMP反应在等温状态下就能进行，无需预先进行双链的变性。同时LAMP反应不需要特殊仪器和试剂，只需要将PCR反应中的Taq DNA聚合换成具有链置换活性的Bst DNA聚合酶；(2)灵敏度高LAMP方法能检测到比PCR方法还少的拷贝数，其灵敏度可以比PCR法高10 100倍；(3)特异性强LAMP应体系要求四条引物完全匹配才能进行扩增，信息量大，因此反应体系中的其他模板对反应的干扰很小；(4)速度快，耗时短LAMP反应不需要加热变性，省去了热循环步骤，40 60min即完成扩增反应；(5)可直接扩增RNA :扩增RNA时，只要在扩增DNA试剂的基础上加上逆转录酶和酶阻抑剂，就能一步实现RNA的扩增；科学家们已经建立了逆转录LAMP (RT-LAMP)方，该方法的灵敏度是RT-PCR方法的100倍；(6)产物检测方便、快捷LAMP反应只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否，进行实时验证。
F3 引物GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC ；B3 引物GCC ATC ACT AGC CAT AGC G ；FIP 引物:CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG ；BIP 引物CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGAACC CAAAAT CCG GGC。本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测副溶血性弧菌的方法。上述技术问题通过以下技术方案实现一种副溶血性弧菌的检测方法，具体为(101)对待检样品提取待检I旲板DNA待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取ImL待检增菌液，7000 X g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80 ii LDNA提取液，混匀后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ；7000 X g离心2min，取上清液作为待检模板DNA ；(102)副溶血性弧菌的环介导等温扩增按下述LAMP反应体系，在反应管中加入相应反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，然后加入稳定液，最后在反应管中加入待检模板DNA，进行65°C环介导等温扩增反应60min ；LAMP反应体系为本发明涉及一种副溶血性弧菌检测用引物组，包括下列引物F3引物GAC GTACCATGTACTAGATC；B3引物GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。本发明还提供一种使用上述引物组检测副溶血性弧菌的方法。本发明的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为副溶血性弧菌的检测提供一强力有效的手段。