专利名称：用于治疗局部病毒感染的新协同组合物的制作方法局部病毒感染在人类中非常常见，这是因为病毒通常首先经由病毒与外部体表接触而进入体内。病毒是直径为10纳米至300纳米不等且长度达1400纳米(丝状病毒)或1400纳米以上不等的极小传染物。病毒可仅在宿主细胞内部繁殖。所有病毒都具有由DNA或RNA构成的基因和保护这些基因的蛋白质外壳。ー些病毒具有在其位于宿主细胞外时包围其的脂肪包膜。虽然病毒进入宿主细胞中的机理随不同病毒群而变化，但所有病毒按照三个基本步骤来感染宿主细胞和繁殖。一旦病毒与宿主细胞接触，第一步是病毒附着于宿主细胞(初期感染)，第二步是细胞内的病毒基因组复制(病毒増殖)，和第三步是新产生的病毒粒子从宿主细胞中排出。局部病毒感染的进展模式与全身病毒感染完全不同。在局部外部感染(例如流感病毒)期间，最初少量病毒粒子与皮肤或粘膜上的少量细胞接触并进入细胞中。在一些情况下，病毒可存在于体内作为潜伏性病毒，朝皮肤或粘膜迁移。举例来说，在唇疱疹或生殖器疱疹病毒感染情况下，存在于神经细胞中的潜伏性病毒朝唇皮肤或朝阴道粘膜迁移且开始在少量细胞中増殖。在其它情况下，一旦进入，一些病毒可仍呈休眠状态而进入细胞(例如进入神经细胞的疱疹I和疱疹II)中且一旦身体防御机理减弱则产生疾病。在所有情况下，在这ー阶段几乎都无临床征象。初期感染后，病毒在少量细胞中増殖，然后数百万新病毒粒子局部释放，且其开始攻击新细胞，从而产生可见病变。咽喉病毒感染发生相同过程，除了初期病毒粒子不是存储于体内而是由宿主个体吸入。病毒包膜对病毒初期感染来说具有重要作用。病毒包膜与表面层的数种蛋白质(糖蛋白)相关。 表面层的糖蛋白是跨膜蛋白，通过疏水性域锚定于包膜。其可见于病毒表面上。病毒利用这些糖蛋白附着于细胞膜并进入宿主细胞中。病毒包膜是含有许多类型糖蛋白的高度复杂的结构。举例来说，单纯疱疹病毒(HSV I和HSV 2)含有例如gB、gD、gH、gL、gC、gl、gE等表面糖蛋白作为主要蛋白质。为感染细胞，目前假设C糖蛋白和/或B糖蛋白(分别为gC和gB)和可能的gH糖蛋白结合至细胞表面上的硫酸こ酰肝素受体以与宿主细胞膜融合和产生病毒进入宿主细胞所经的开ロ或小孔。因此，缺乏硫酸こ酰肝素受体的细胞不易患HSV(纳塔利 车森可(NataliaChesenko)，2002)。这ー特异性决定病毒的宿主范围。表面糖蛋白结构的差异赋予同一病毒家族不同的形态和抗原性。举例来说，三个不同类型的流感病毒( 称为A、B和C)已经鉴别以HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)作为主要表面糖蛋白。早已鉴别13种主要类型的HA和NA的9种主要的抗原决定子。这显示病毒衣壳在表面层上可含有超多种的糖蛋白。还意味着，各类型的病毒具有自身的促进细胞附着和细胞进入的方式。尚未发现所有病毒糖蛋白，且正不断研究新病毒糖蛋白的存在和其在病毒増殖和感染中的作用。不断发现新病毒表面糖蛋白、其在宿主细胞感染中的作用和常见病毒突变，使得几乎不可能开发特异性局部抗病毒药物。在不存在任何特异性抗病毒药物的情况下，目前认为疫苗是最佳抗病毒疗法。虽然疫苗可含有病毒糖蛋白亚单位，但其具有不良免疫性，因为不是所有糖蛋白都能在一种疫苗中表现且其抗原性可变。虽然完全失活的病毒疫苗更高效，但仅可针对小规模且高抗原性的病毒制备。虽然具低病毒病原性的活病毒疫苗是良好的免疫原，但其不稳定、危险(活病毒)且具回复毒カ的风险。令人遗憾的是，由于表面糖蛋白结构复杂，因此不能开发针对许多病毒的疫苗，例如HIV、疱疹、乳头瘤病毒和许多其它病毒。当病毒粒子存在于皮肤病变(例如唇疱疹)、阴道粘膜(例如生殖器疱疹)或咽喉表面(例如流感)上时，大多数抗病毒治疗是针对干扰细胞内病毒增殖过程，而对游离病毒粒子根本不起作用。所有目前可用的抗病毒药物是针对一旦已建立感染则阻止细胞内病毒生长。举例来说，使用细胞内神经氨酸酶抑制剂治疗流感A、B和C型包膜病毒，有2种主要类别的通过经ロ途径的药物-金刚烷，干扰细胞内的病毒脱壳且仅有效针对流感A型病毒；-较新类别的扎那米,(Zanamivir)或奥司他伟(Oseltamivir)(特敏福(Tamiflu))，干扰细胞内子代病毒的释放且需要早期经ロ投予来阻止进ー步病毒生长。为治疗全身疱疫病毒感染，使用不同类型的无环鸟苷(Acycloguanosine)(阿昔洛,(Aciclovirs))且以例如舒维疗(Zovirax、昔洛,(Ciclovir、赫派(Herpex、阿昔,(Acivir,阿昔维疗(Acivirax、阿昔洛,(Aciclovir和舒维(Zovir等商品名销售。这些是核苷类似物，其干扰细胞内的病毒生长但对体表的游离病毒不起作用，因为这些药物通过循环传播且无法到达存在于开放的病毒病变上的游离病毒粒子。此外，因为全部抗病毒药物通过干扰正常细胞代谢功能来起作用，所以其通常诱发重度有毒作用。经ロ投予无环病毒(acyclovirus )和泛昔洛韦(famciclovir )以治疗唇疱疹、生殖器疱疹、帯状疱疹和水痘可诱发恶心、呕吐、腹泻、头痛、皮疹、肾损伤和精神混乱；金刚胺(amantadine )治疗流感A可引起恶心、食欲不振、神经紧张(nervousness)、轻度头痛、不稳定、嗜睡和精神混乱；西多福,(cidofovir )、甘昔洛,(ganciclovir )和福卡内特(foscamet )治疗巨细胞病毒可广生肾损伤和低白细胞计数；给予干扰素- a以刺激针对病毒感染的免疫性可引起流感样症状、贫血症、抑郁症、低白细胞计数、低血小板计数；已知奥司他,(oseltamivir )治疗流感A和流感B产生恶心、呕吐和眩晕，且病毒唑(ribavirin )用于儿童RSV感染可产生红细胞分解和贫血症(优|11 M (URBAN M)，默克手册■ (Merck Manual), 2009)。针对唇疱疫(cold sore)局部施用无环病毒(舒维疗(zovirax )、喷昔洛,(penciclovir )阿糖腺苷(vidarabine ))并不有效且无已知的重度有毒作用。在体表上局部中和游离病毒粒子似乎是阻止感染的非常高效的替代方案；然而目前尚无可用于阻止局部病毒感染，特别是在初期感染阶段，从而避免局部病毒进入细胞中的疫苗。近来的科学研究还证明，除病毒表面糖蛋白以外，蛋白酶也在促进局部病毒进入细胞中发挥重要作用。已知在细胞内部病毒増殖期间使用蛋白酶，但近来发现蛋白酶涉·及促进来自例如疱疹等外部体表的病毒进入和来自皮肤病变或咽喉表面的流感病毒进入(奇多(Kido)，2007 ;德尔沃伊(Delboy)，2008)。)因为蛋白酶具有水解特异性蛋白质的潜能，所以ー些表面上无附着和进入宿主细胞的特异性受体的病毒借助于这些蛋白酶来破坏细胞壁并进入细胞中。蛋白酶(protease),也称为蛋白酶(proteinase)或蛋白水解酶(proteolyticenzyme)，是细胞内部或外部、尤其损伤组织附近可见的一大群酶，且在蛋白质分解代谢中通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而发挥重要作用。蛋白酶涉及蛋白质分子的分裂。其主要作用是破坏井清洁组织分解期间产生的蛋白质残骸，因为这些物质干扰组织修复过程。其对为后续组织修复产生有利的环境来说必不可少。其中一些可从蛋白质链分离末端氨基酸(外肽酶，例如氨基肽酶、羧基肽酶)，而其它攻击蛋白质的内部肽键(内肽酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶)。局部或细胞内部可见数百种蛋白酶，且所述蛋白酶根据其催化活性部位的特征和作用条件可分为四个主要群组丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶或基质金属蛋白质(Matrix-Metallo-Protein, MMP)。蛋白酶附着于特定群组取决于催化部位的结构和对其活性必不可少的氨基酸(作为组分之一)。许多蛋白酶可局部见于病毒感染的皮肤或粘膜上，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胱氨酸蛋白酶(cystin proteinase)(组织蛋白酶B、H、K、L、S)、天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶D)、凝血因子和涉及局部伤ロ愈合过程的基质金属蛋白质，例如明胶酶A (MMP-2)、明胶酶B (MMP-9)、胶原酶(MMP-I)、胶原酶3 (MMP-13)、溶基质素-1 (MMP-3)、溶基质素-3 (MMP-11)、MT- IMMP (MMP-14)、巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MMP-12)和当然许多尚未发现的其它蛋白酶。对胞外基质、皮肤上的病毒病变(例如唇疱疹)、粘膜上的病毒病变(例如生殖器疱疹)和咽喉表面上的病毒病变(例如流感病毒)中存在的不同类型的蛋白酶的分析还表明，具有特异性蛋白分解活性的组织感染部位处存在许多不同类型的蛋白酶。已十分明确，许多病毒使用蛋白酶来促进其在细胞内部的増殖，例如HIV I蛋白酶，这ー蛋白酶有助于HIV-AIDS病毒通过在适当位置裂解新合成的聚合蛋白质以产生传染性HIV病毒粒子的成熟蛋白质组分来増殖。如果没有有效HIV蛋白酶，HIV病毒粒子仍是非传染性的。因此，开发了细胞内蛋白酶抑制剂(例如沙奎那韦(saquinavir )、利托那韦(ritonavir )、茚地那韦(indinavir )、奈非那韦(nelfinavir ))和数种其它类似物来阻断HIV病毒生长。这些产物単独或组合经ロ给予(例如洛匹那韦(Liponivir )和利托那韦(Ritonavir ))来阻断HIV病毒生长。但其作为一般抗病毒剂的使用因其毒性、副作用和不良活性而高度受限。一些细胞内蛋白酶抑制剂(安吉拉司(Agenerase )、克滤满(Crixivan )、英韦拉司(Invirase )、卡乐曲(Kaletra )、Lexiva 、诺韦(Norvir )、輩力(Prezista )、锐艾妥(Reyataz )和维拉赛特(vitacept ))早已经授权用作抗蛋白酶药物且与其它抗病毒药物组合经ロ用于治疗AIDS。 令人遗憾的是，大多数这些蛋白酶抑制剂实质上是蛋白质且容易被伤口中所存在的天然蛋白酶破坏(派替克(Patick)等人，1998)，且因此其不能用于局部病毒感染。虽然所有未来抗病毒治疗还针对通过经ロ投予例如新蛋白酶抑制剂、核苷RNA复制酶抑制剂、整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和环孢素衍生物来阻止细胞内病毒复制，但归因于其细胞内作用模式，尚未设想其局部用于阻止病毒进入细胞中。归因于其在组织修复中的作用，蛋白酶的局部浓度在损伤部位处明显増加。因为局部病毒感染在皮肤或粘膜损伤之前通常检测不到，所以在所有局部病毒感染中蛋白酶的量都极高。毎年世界范围内感染超过5亿人的流感病毒，在吸入期间最初与咽喉细胞接触，对病毒膜融合糖蛋白前体无加工蛋白酶，且所述病毒不能进入细胞中。因此，这ー病毒使用呼吸道表面上存在的蛋白酶来进入和感染咽喉细胞。气道中早已鉴别至少5种不同的加工蛋白酶(胰蛋白酶样)(奇多(Kido)，2007)。最初，少量病毒粒子进入细胞中，然后数倍且数百万新病毒粒子释放于咽喉表面上。所有这些病毒粒子需要借助于蛋白酶才能进入新健康细胞中和传播感染。因此，我们的身体防御机理在上呼吸道中释放称为分泌白细胞蛋白酶的抗蛋白酶且在下呼吸道中释放肺表面活性物质来降低病毒进入细胞可利用的游离蛋白酶的量。当蛋白酶活性优于抑制性化合物活性时，不能阻止病毒感染(奇多(Kido)，2004)。近来的科学研究还表明，其它局部病毒(例如引起唇疱疹和生殖器疱疹的疱疹病毒)也借助于ー些蛋白酶来感染细胞。已显示，开放的疱疹病毒病变、MMP-2和MMP-9蛋白酶的含量在早期感染期间增加(马丁尼兹(Martinez)，2004)，某些蛋白酶抑制剂降低疱疹病毒的活性(拉 法兹(LaFrazia)，2006)，并且细胞蛋白酶涉及包膜病毒的病原性(奇多(Kido)，1996)。考虑到表面病毒糖蛋白对病毒附着宿主细胞的作用和病毒使用蛋白酶进入宿主细胞，必需寻找ー种通过同时中和病毒表面糖蛋白和相应蛋白酶来治疗局部病毒感染的方法。目前，尚无已知的阻断局部病毒进入细胞的局部抗蛋白酶抑制剂或病毒表面糖蛋白抑制剂。此可与如下事实相关因为存在许多蛋白酶，各自具有特异性活性，所以发现ー种可中和所有蛋白酶的特异性药物极其困难。在目前尚不了解局部存在的蛋白酶的精确数目和其在局部病毒感染中的作用的情况下，仅非特异性蛋白酶抑制剂可阻断所有蛋白酶。考虑到感染表面上局部存在的游离病毒粒子的量(以百万计)，有效治疗不应仅中和特异性病毒糖蛋白，而还应使促进病毒进入细胞中的蛋白酶的量降至最少。在不存在杀死继续感染新细胞的局部病毒粒子的任何特异性药物的情况下，含阿昔洛韦(acyclovir )的乳膏现也销售用于局部施用，但归因于其细胞内作用模式，阿昔洛韦(acyclovir )不能作用于局部释放于病变中且存在于细胞外部的游离病毒粒子。在所有局部病毒感染中，病变表面上存在的游离病毒粒子继续从外部攻击新健康细胞以传播感染。 还提出将ー些草本制剂局部施用于病毒病变，但任何这类草本药物本身不能广泛使用证明其效率极其受限且其不能视为特异性抗病毒药物。举例来说，提出使用大黄(Rhubarb)与鼠尾草植物提取物治疗唇疱疹，其中临床结果显示用鼠尾草乳膏，平均病变治愈时间为7. 6天，大黄-鼠尾草乳膏为6. 7天，且舒维疗(zovirax )为6. 5天(沙勒(Sailer)等人，2001)。与含阿昔洛韦(acyclovir )的舒维疗(zovirax )乳膏使疱疹病变治愈时间缩短约15%相比，这两种植物提取物的组合使疱疹病变治愈时间缩短约12%，将所述产品视为特异性局部疱疹治疗一点也不令人满意。还使用分离的活体外细胞培养物模型或对特异性病毒附着受体测试大量植物提取物，但其不足以被视为抗病毒剂而用于进一歩临床试验或进ー步开发为抗病毒药物。显示海藻硫酸化多糖干扰HIV肝素受体结合(微特维奥(Witvrouw)，1997);发现绿茶没食子酸表焙儿茶素阻断分离的细胞中的HIV-I病毒的gpl20-cd4结合(哈姆扎(Hamza), 2006);显不中药植物夏枯草(Prunella vulgaris)和 Rhizoma cibotte 的提取物可能由于单宁干扰HIV-lgp41六螺旋束形成而抑制活体外HIV-lgp41六螺旋束形成(刘(Liu),2002);发现印度植物印度当药(Swertia chirata)提取物减少活体外生长的HIV-1，表明发现ー些植物提取物具有一定的抗病毒活性，而这一局部抗病毒作用不足以将所述植物用作抗病毒药物。还提出例如蜂胶等其它天然物质抑制II型单纯疱疹病毒生长，这是因为富含苯基羧酸且缺乏类黄酮的水性提取物和富含类黄酮的こ醇提取物两者都显示HSV-2感染性降低(诺肯佩尔(Nolkemper)，2009)。因为在所有局部病毒感染中，表面皮肤或粘膜细胞最初释放大量游离病毒粒子于病变表面上且因为这ー游离病毒通常借助于各种蛋白水解酶附着新健康细胞，所以理想的局部抗病毒治疗应具有以下主要性质-应中和帮助病毒粒子进入细胞中的所有病毒糖蛋白受体以阻止新细胞感染。-应同时中和感染表面上存在的可由病毒使用以进入细胞膜中的所有蛋白酶。-应对皮肤或粘膜细胞无刺激、无毒且应价格低廉。
因此，本发明的ー个目标是提供ー种协同组合物，其能够同时中和涉及促进病毒进入宿主细胞或病毒附着于宿主细胞和涉及诱导局部感染的糖蛋白包膜病毒的病原性的蛋白酶与病毒糖蛋白。本发明的另一目标是提供ー种协同组合物，其能够中和涉及局部感染的蛋白酶与病毒糖蛋白，局部感染例如疱疹病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、腺病毒、反转录病毒和其它局部包膜病毒。本发明的另一目标是提供ー种协同组合物，其能够中和涉及局部感染的蛋白酶与病毒糖蛋白，局部感染例如唇疱疹、生殖器疱疹、病毒咽喉感染、疱疹性湿疹、人类乳头瘤、皮疹、病毒疣病变和游离病毒粒子可见于病变表面的其它病毒感染。本发明的另一目标是提供ー种协同组合物，其用作局部病毒感染的预防性或治愈性治疗。本发明的另一目标是提供ー种协同组合物，其用作治疗人体和动物体的局部病毒感染的安全、高效且廉价的化妆品或药物或医学装置。
所述提取物可使用所属领域的技术人员熟知的传统提取技术制备。具体来说，所述提取物可使用溶剂提取技术来制备。所用溶剂可为水、こ醇、甘油、こニ醇，优选为甘油。提取之前，植物可粉碎或切碎，且可为新鲜的、冷冻的、干燥的或冻干的。可连续进行数次提取直到活性成分被所用溶剂完全抽出。提取时间随用于提取的溶剂、温度和可能压カ而变化。实际上，对于可盈利的エ业开发，这ー时间可限于不到两小时。植物的任何部分都可用于制备根据本发明的植物提取物。羽衣草、积雪草、紫花紫锥菊和欧洲七叶树的提取物优选是至少ー个地上部分的提取物，且更优选是全植物提取物，而细花含羞草和儿茶的提取物是植物的树皮提取物。术语“所述植物的地上部分”打算意指植物不在地下的任何部分。植物的地上部分包含叶子、果实、花、茎、种子，优选是叶子和树枝。 术语“全植物提取物”打算意指植物整个地上部分的提取物。这些提取物可使用惠*W 卡尔曼(Huie W Carmen)撰写的综述文章(惠(Huie),2002)中所描述的不同方法来制备。取决于植物提取物和制备方法，单宁的浓度可为1%至35%、尤其2%至12%缩合单宁不等。所述含有所要数量单宁的植物提取物中的一些例如由法国法伦休(Valanjou)的马丁鲍尔公司(Martin Bauer Company)出售。单宁可视为含有足够羟基和其它适合基团(即羧基)以与大多数大分子有效形成强键的具足够高分子量的任何酚系化合物。归因于单宁的蛋白质结合性质，其自古代起即用于将皮肤制成生皮，因为其在所有死亡的皮肤蛋白质分子之间产生键以将皮肤制成皮革。根据本发明的羽衣草的提取物尤其可包含以提取物的总重量计I重量％至20重量％、优选2重量％至12重量％且更优选3重量％至8重量％的单宁，以干提取物表示。根据本发明的细花含羞草的提取物尤其可包含以提取物的总重量计I重量％至25重量％ ,优选2重量％至14重量％且更优选3重量％至12重量％的单宁，以干提取物表
/Jn o根据本发明的紫花紫锥菊的提取物尤其可包含以提取物的总重量计0，5重量％至12重量％ ,优选I重量％至8重量％且更优选2重量％至7重量％的单宁，以干提取物表不。根据ー个实施例,本发明的协同组合物包含来自紫花紫锥菊(E. purpurea)的富含单宁的植物提取物以及来自细花含羞草(M. tenuiflora)、羽衣草(A. vulgaris)、积雪草(C. asiatica)或欧洲七叶树(A. hippocastanum)的富含单宁的植物提取物,其用于治疗疱疹病毒中和。根据另ー实施例，本发明的协同组合物包含来自紫花紫锥菊的富含单宁的植物提取物以及来自山茶(C. sinensis)的富含单宁的植物提取物，其用于治疗流感病毒。根据另ー实施例，本发明的协同组合物包含来自山茶的富含单宁的植物提取物以及来自儿茶或细花含羞草的富含单宁的植物提取物，其用于治疗流感病毒。根据ー个实施例，本发明的协同组合物包含富含抗蛋白酶活性选自紫花紫锥菊或山茶的植物提取物与选自细花含羞草、羽衣草、山茶、积雪草、欧洲七叶树、鼠尾草或儿茶的提取物的能够中和病毒糖蛋白的植物提取物的协同组合。提取物的组合比率可为I : Iw/W，但这ー比率可视欲治疗的病毒感染类型而变化。协同组合物优选是用于治疗选自包含以下的群组的局部病毒感染的组合物唇疱疹或生殖器疱疹、流感、咽喉感染、乳头瘤病毒和皮肤和粘膜的其它病毒感染。如先前所定义，术语“局部”是指身体的所有外部部分，例如皮肤、口腔、咽喉、上呼吸道、鼻腔、阴道粘膜、眼表和天然体窍。因此，本发明的协同组合物涉及用于治疗表现于体表上的病毒感染的组合物，所述病毒感染例如口腔疱疹和生殖器疱疹、咽喉流感病毒感染和其它局部皮肤病毒感染。术语“局部病毒感染”打算意指病毒粒子局部存在的所有局部感染。术语“协同”打算意指组合物的富含单宁的植物提取物的组合作用高于单独使用各植物提取物的作用。
本发明还涉及本发明协同组合物的用途，其用于制造供治疗局部病毒感染的药剂或医学装置。术语“医学装置打算”意指在不影响体细胞功能的情况下主要通过其物理性质(例如与损伤腔中的蛋白水解酶或其它蛋白质结合)发挥其作用的任何产品(例如植物提取物的组合)或物品。医学装置可包括压迫绷带、水凝胶、聚合物膜、溶液、悬浮液、乳膏、凝胶剂、软膏、洗剂、缓慢释放设计或喷雾剂。本发明还涉及ー种治疗局部病毒感染的方法，其包含向个体投予本发明协同组合物的步骤。本发明还涉及本发明协同组合物的非治疗用途，其用作局部施用于病毒起源皮肤病变上的化妆产品。这些化妆产品可为溶液、悬浮液、乳膏、凝胶剂、软膏、洗剤、缓慢释放设计、膜或喷雾剂。两种植物提取物的组合在预防和/或治愈局部病毒感染中的协同抗病毒性质的证据由以下药理学、毒理学和临床研究显而易见。虽然所提供实例说明本发明，但其无论如何不应视为限制本发明的范围。本发明发明者提供的实验概要包括以下步骤-选择植物，-制备植物提取物，-选择病毒物种，-测试和分析所制备植物提取物的蛋白酶抑制活性，-测试和分析所制备植物提取物的病毒糖蛋白中和性质，-测试具有抗蛋白酶或病毒糖蛋白抑制性质的植物提取物中和病毒的协同活性，-协同组合物的临床评估和安全性评估。棺物的选择和棺物提取物的制备:选择134种富含单宁的已知植物，包括紫花紫锥菊、细花含羞草(Mimosatenuiflora/M. tenuiflora)、欧洲七叶树(Asculus hippocastanum/A. hippocastanum)、鼠尾草(S alvia officinalis/S. officinalis)> 习习衣草(Alchemilla vulgaris/A. vulgaris)、积雪草(Centella asiatica/C. asiatic)、山条(Camilla sinensis)(绿茶(Green tea))和儿茶(Acacia catechu/A. catechu)。
使用植物的含有最大量的缩合单宁的部分制备所选植物的植物提取物。因为水溶性单宁不适于局部施用，所以通过使用文献(纳菲斯(Nafisi)-莫伐格尔(movaghar)，1991)中公开的不同提取方法，植物提取物富含缩合单宁。简言之，最初在I 12固体与水的比率下，混合植物材料与水，且在200-300° F下在2-50Psi压カ下搅拌I小吋。所获得的水溶液然后经聚合膜过滤以去除大粒子。溶液通过添加3% w/w膨土纯化并通过过滤去除。提取物然后与吸附材料(填充在柱中的非离子型树脂)保持接触，且保留在吸附材料上的单宁用极性溶剂洗脱。浓单宁提取物然后通过原子化干燥，获得富含单宁的可溶性干植物提取物。取决于单宁中植物的最初富含程度和所用的植物部分，干提取物中单宁的百分比为5%至34%不等。在使用之前，这些干提取物溶解于水中(10mg/ml)作为母溶液。为进行实验，各植物提取物进ー步稀释，最終浓度为lmg/ml，且当两种植物提取物组合时，最終浓度为0，5mg/ml。参考病毒的选择:在局部病毒感染中，诱发局部唇病变和生殖器病变的疱疹病毒和引起咽喉感染的 流感病毒代表具有表面糖蛋白的主要局部病毒。因此，所有实验都采用这两种病毒作为參考病毒。测试和分析所制备植物提取物的蛋白_抑制活性:关于涉及病毒进入细胞中的蛋白酶的研究在尚不了解涉及促进病毒进入细胞中的蛋白酶的情况下，用不同蛋白酶进行最初实验以选择涉及促进抱疫和流感病韋进入细胞中的蛋白酶。所选基质金属蛋白质MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10和MMP12然后以不同组合测试以发现所有涉及特定病毒进入的 MMP。纯人类MMP(蛋白酶)和蛋白酶分析试剂盒购自美国亚培公司(AnaSpec, Inc,USA)。MMPl (间质和纤维母细胞胶原酶，Ref. 72004和71128) ,MMP 2(明胶酶A，Ref. 72005和 71151) ,MMP 3 (溶基质素-l,transinl,Ref. 72006 和 71153)、MMP7 (酶原，Ref. 72007)、MMP-9 (明胶酶 B，胶原酶 IV，Ref. 72009 和 71134)和 MMP-12 (弹性蛋白酶，Ref. 72010 和71137)、MMP_10 (溶基质素2，Ref. 72067和72024)以0. 5 y g/ml浓度与病毒悬浮液或细胞培养物一起使用，且用于定量分析。最初，Vero(非洲绿猴肾(African Green monkey kidney))和 MDCK(MadineDurby Canin Kidney)细胞在75cm2组织培养烧瓶(美国康宁(Corning,USA))中在补充有10%胎牛血清(FCS)和抗生素的杜氏改良伊氏培养基(Dulbeccc/ s Modified Eagle; sMedium, DMEM)中生长。所有细胞在37°C、5% CO2下培养。在使用无血清培养基和适当对照的于96孔组织培养板中生长的细胞培养物中进行实验。使用细胞仍暴露于外部环境的细胞培养模型来模拟局部病毒感染。使用对疱疫病毒感染敏感的Vero细胞和对流感病毒感染敏感的MDCK细胞。细胞和病毒购自美国ATCC培养中心。为确定病毒カ价和50%组织培养感染剂量(TCID5tl)或100%组织培养感染剂量(TCID100)，细胞在96孔组织培养板中与10倍病毒稀释液(m. o. i. 2)生长汇合，且在37°C下培育I小吋。接种物去除后，用PBS洗涤细胞且与新鲜培养基一起培育72小吋。用MTT活体染色评估细胞死亡。在一些情况下，对于流感病毒，从各孔取出50 Ul上清液样品，转移到新的96孔板，且用0. 5%鸡红细胞悬浮液通过血细胞凝集(HA)试验滴定病毒。利用里德(Reed)和穆彻(Muench) (1938)方法计算TCID剂量。为研究涉及病毒进入细胞中的蛋白酶，个别蛋白酶或蛋白酶组合(0. 5iig/ml)暴露于无蛋白酶无血清组织培养基中的感染TCID5tl浓度的疱疹或流感病毒的细胞培养物72小吋。然后如先前所述确定病毒生长。如果病毒生长无变化，那么MMP视为不涉及病毒进入细胞中的过程，但如果病毒生长优于相应未添加MMP的病毒对照，确定病毒生长的增加％以评估MMP涉及病毒进入宿主细胞中的程度。值表示最少3个实验的平均值(每实验，n = 16)。仅涉及疱疹和流感病毒生长的MMP的结果呈现如下(表I):


本发明涉及一种用于治疗局部病毒感染的包含富含单宁的植物提取物的协同组合物，所述植物提取物含有至少一种蛋白酶抑制剂和/或至少一种病毒糖蛋白抑制剂。