专利名称：骨修复组合物的制作方法脱矿质骨基质(DBM)是指通过将骨 加入到酸中而除去其中矿物质的骨。脱矿质骨基质主要由高度交联的胶原蛋白组成，包括其余的非胶原蛋白如TGF-P、TOGF、骨质素、骨连接素、骨形成蛋白(BMP)等。当脱矿质骨基质被并入(填充到)小鼠肌肉中，在并入位点观察到异位成骨。该实验证明，为了使骨生长，骨基质中应存在能诱导成骨细胞群中未分化的细胞进行分化的材料。BMP是这样一种存在于骨基质中的蛋白物质(Urist，MR, Strates, BS，骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein), J. Dental Res. 50 :1392-1406,1971)。BMP 可以从骨豁中分离出来，或通过基因重组技术制备。BMP是一组属于TGF-P超家族的蛋白，并基于它诱导骨形成的能力进行分类(ffozney, JM,科学(Science) 242 :1528-1534,1988)。BMP 家族可分为 BMPs，如 BMP-2 和BMP-4 ;成骨蛋白(OPs)，如 0P-1 (或 BMP-7)、0P_2 (或 BMP-8)、BMP_5、BMP_6 和 Vgr-I ;软骨源性形态发生蛋白(CDMPs)，如CDMP-I、BMP-14和⑶F-5，生长/分化因子(⑶Fs)，如⑶F-I、⑶F-3、⑶F-8、⑶F-II、⑶F-12和⑶F-14 ;以及亚家族，如BMP-3、成骨素、BMP-9、⑶F-2和BMP-10。各种组合物已被用于医治受损的骨组织。它们可作为框架支持新骨生长，并提供诱导新骨生长的生长因子。美国专利No. 4，394，370，Jefferies公开了一种包括重组胶原蛋白、脱矿质骨基质和BMP的组织愈合组合物。美国专利No. 4，440，750，Glowacki等公开了一种由重组胶原蛋白和脱矿质骨基质组成的保湿组合物。然而，这些组合物的骨修复疗效差，因为骨生长因子在早期阶段不释放，而是陷在脱矿质骨基质的高度交联的胶原蛋白网中，并随着胶原蛋白成分的降解而缓慢释放。作为这种缓慢释放的替代方案，(美国专利No. 7，132，110)提出一种从脱矿质骨基质中分离骨生长因子的方法。然而，该分离方法需要如提取、纯化、与分散溶剂混合或与另一种载体结合等诸多步骤。此外，它的缺点是在分离过程中造成骨生长因子和胶原蛋白的损坏。此外，当单独使用粉末状态的脱矿质骨基质时，它不可能被注入，且难以保持和修饰(modify)其形状，因此，处理存在问题。因此，为了提供更好的可注射性以及保型和修饰属性，已提出与其它物质组合使用。到现在为止，已报道与有机聚合物的组合产品如明胶、甘油、泊洛沙姆和透明质酸，但它们并没有满足全部的可注射性、保型(处理(handling))、含量和生物相容性。因此，亟需开发出能在早期阶段释放骨生长因子，对人体无害且可提高脱矿质骨基质的可注射性和保型(处理)的骨修复组合物。
技术问题本发明人对可解决上述常规组合物所引起问题的新型骨修复组合物进行持续研究。结果，他们发现如果向非超细化脱矿质骨基质中加入超细化脱矿质骨基质和保湿材料制备组合物，由此制备的组合物与常规的仅含非超细化脱矿质骨基质的组合物相比，由于超细化脱矿质骨基质较大的表面积和骨生长因子的较早释放，本发明的骨修复组合物更易于注射和保型(处理)，并显示出优异的骨修复效果，由此完成本发明。技术方案为了解决上述技术问题，本发明提供一种包 括超细化脱矿质骨基质、非超细化脱矿质骨基质和保湿材料的骨修复组合物。有益效果本发明的骨修复组合物。与常规的仅含非超细化脱矿质骨基质的组合物相比，由于超细化脱矿质骨基质较大的表面积和骨生长因子的较早释放，其更易于注射和保型(处理)，并显示出优异的骨修复效果。由于未使用合成材料，它还显示出生物相容性和对人体无害的优势。此外，由于不需要另外从脱矿质骨基质中分离骨生长因子，无需考虑在常规分离过程中可能对骨生长因子和胶原蛋白造成的损害。图I显示了对本发明实施例I和对比例1-3的碱性磷酸酶(ALP)的测定结果。在用于本发明骨修复组合物的脱矿质骨基质中，残余的钙含量一般为0.01-8%。如果含量超过8%，可能会导致抑制生长因子从脱矿质骨中释放的问题。因此，残余的钙含量优选8%或以下，更优选2%或以下。本文中使用的术语“超细化(micro-pulverized) ”是指研磨颗粒,使50%或以上的颗粒粒径为约250 y m或以下。因此，本文中使用的术语“超细化脱矿质骨基质”是指已被粉碎的脱矿质骨基质，使50%或以上的粒径为约250 或以下。另一方面，术语“非超细化脱矿质骨基质”是指50%或以上的粒径为约250 u m或以上的脱矿质骨基质。在本发明的骨修复组合物中，超细化脱矿质骨基质的合适粒径是0. 05-500 U m，优选0. 05-250 u m。非超细化脱矿质骨基质的合适粒径是100-2000 u m,优选250-2000 y m，更优选 250-710 iim。
本发明骨修复组合物的特征在于，除了所述超细化脱矿质骨基质和非超细化脱矿质骨基质以外，还包括保湿材料。任何可商业获得的保湿材料均可用于本发明的组合物中。优选地，选自蒸馏水、盐溶液、浓盐溶液和离子溶液中的一种或多种可用于保湿材料。在一个实施方案中，所述保湿材料可含有液态多羟基化合物，其实例包括甘油或甘油酯。在另一个实施方案中，所述保湿材料可含有生物相容性粘合剂。生物相容性粘合剂的优选实例为选自纤维蛋白胶、纤维蛋白原、凝血酶、贻贝粘合蛋白、蚕丝、弹力蛋白、胶原蛋白、酪蛋白、明胶、白蛋白、角蛋白、甲壳素和壳聚糖中的一种或多种。生物相容性粘合剂的其它优选实例为选自淀粉、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚二氧环己酮、聚己内酯、聚碳酸酯、聚氧酯(polyoxoester)、聚氨基酸、聚酐、聚轻基丁酯、聚轻基戍酯、聚(丙二醇-富马酸共聚物)、基于酪氨酸的聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、乙基纤维素和羧甲基纤维素中的一种或多种。在另一个实施方案中，保湿材料可另外含有选自抗生素、维生素、葡萄糖胺、细胞因子和生长因子中的一种或多种。在本发明的骨修复组合物中，所述超细化脱矿质骨基质非超细化脱矿质骨基质保湿材料的重量比为0. 1-20 I 0. 1-20，优选0. 1-3 I 1-10，更优选0.5-1 I 3-5。如果基于I重量份的非超细化脱矿质骨基质，超细化脱矿质骨基质的含量低于0. I重量份，那么所述组合物粘度会下降，导致易碎且成形差。然而，如果该含量大于20重量份，那么组合物会迅速降解，导致骨形成不完全。此外，如果基于I重量份的非超细化脱矿质骨基质，保湿材料的含量低于I重量份，那么所述组合物粘度会下降，导致易碎且成形差。然而，如果该含量大于20重量份，那么组合物变得不粘稠，导致成型差且易流动。除了所述超细化脱矿质骨基质、非超细化脱矿质骨基质和保湿材料以外，本发明的骨修复组合物可进一步包含有助于骨修复的辅料。任何可商业获得的有助于骨修复的辅料均可用于本发明的组合物中。特别优选地选自松质骨片、密质骨片、羟基磷灰石(HA，Ca10(PO4)6(OH)2)、碳酸磷灰石(CA，Caltl(PO4)6CO3)、磷酸三钙(TCP, Ca3 (PO4)2)、焦磷酸钙(Ca2P2O7)、无机骨、牙釉质、文石、方解石、珍珠质、石墨、热解碳、基于硅酸钙的生物玻璃、Al2O3和ZrO2中的一种或多种。碱性磷酸酶(ALP)分布于全身许多器官，如肝、骨、肾、小肠和胎盘中，除孕妇除夕卜，血清ALP主要来自于骨骼和肝脏。骨ALP由成骨细胞分泌，是骨形成中最普遍使用的标记。由于ALP与成骨细胞的活化有关，它随骨修复的发生而增加，如骨生长期和骨折恢复期。为了确定本发明骨修复组合物的骨修复效果，本发明人将所述组合物加入到C2C12细胞系(cell lines)(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国)，即小鼠成肌细胞系中。采用相同方法培养后，测定ALP的浓度。结果观察到在培养的早期阶段(第3天和第5天)，本发明组合物的ALP值显著高于对比例组合物的值。该高ALP值表示成肌细胞已分化为成骨样细胞。根据这一结果认为，脱矿质骨基质的超细化粉碎过程以及用保湿材料进行保湿的过程可以使骨生长因子较早地从脱矿质骨基质中释放，同时加大了脱矿质骨基质的表面积，从而使骨修复效果得到 改善。基于以上描述，本发明的骨修复组合物可用于各种骨折、骨坏死病或骨修复。常规脱矿质骨粉在移植之前需另行再保湿，而本发明的骨修复组合物无需再保湿的过程，可直接注入到骨质流失区或用手聚集(mass)并填充该区。下面将参考以下实施例和实验例详细描述本发明。所述实施例和实验例仅用于帮助理解本发明而不应解释为对本发明范围的限制。实施例实施例I从I月龄兔中分离得到大腿骨，并根据Russel等人的方法制备(Russell等，骨科(Orthopedics) 22 (5) 524-531,1999)获得脱矿质骨基质。在脱矿质骨基质中，以其中粒径为250-710 的作为非超细化脱矿质骨基质。此外，粉碎所述脱矿质骨基质，以其中粒径为1-250 u m的作为超细化脱矿质骨基质。以蒸馏水作为保湿材料。1-250 u m的脱矿质骨基质、250-710 iim的脱矿质骨基质和蒸馏水以0.8 I 3. 8的重量比混合，制备组合物。实施例2将实施例I中制备的1-250 u m的脱矿质骨基质和250-710 u m的脱矿质骨基质与蒸馏水按0.1 I I的重量比混合，制备组合物。实施例3将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质与蒸馏水按0.3 I 3. 8的重量比混合，制备组合物。实施例4将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质与蒸馏水按0.3 I 5的重量比混合，制备组合物。实施例5将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质与蒸馏水按0.8 I I的重量比混合，制备组合物。实施例6将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质与蒸馏水按0.8 I 5的重量比混合，制备组合物。实施例7
将实施例I中制备的1-250 u m的脱矿质骨基质和250-710 u m的脱矿质骨基质与蒸馏水按3 I 5的重量比混合，制备组合物。实施例8将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质与蒸馏水按3 I 10的重量比混合，制备组合物。对比例I将实施例I中制备的1-250 u m的脱矿质骨基质和250-710 u m的脱矿质骨基质按0.8 I的重量比混合，制备组合物。对比例2将实施例I中制备的1-250 U m的脱矿质骨基质和250-710 U m的脱矿质骨基质按I 3. 8的重量比混合，制备组合物。对比例3将对比例I中获得的组合物在121°C高压灭菌20min，制备组合物。实验例I制备实施例1-8和对比例1-2的各组合物共十份样品。每种组合物以相同的量置于注射器中，用手指将活塞推入注射管，挤出组合物。根据挤出的难易以及挤出的组合物的形状来确定可注射性。此外，用手聚集(mass)该挤出的组合物后，确定保型(处理)。根据下表I中所示的5个级别对可注射性和保型(处理)进行评价，结果如下表2所示。表I[表]


本发明涉及一种包括超细化脱矿质骨基质、非超细化脱矿质骨基质和保湿材料的骨修复组合物。与常规的仅含非超细化脱矿质骨基质的组合物相比，本发明的骨修复组合物由于超细化脱矿质骨基质较大的表面积和骨生长因子的较早释放，更易于注射和保型(处理)，并显示出优异的骨修复效果。由于未使用合成材料，它还显示出生物相容性和对人体无害的优势。