专利名称:含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法胰岛素,特别是重组胰岛素例如人重组胰岛素,在医药领域有广泛的应用。目前, 有两种路线用于生产重组人胰岛素-“连锁组合”路线和“胰岛素原”路线。在“连锁组合” 路线中,通过生物重组分别合成组成人胰岛素的两条肽链-A链和B链,然后再将A链和B 链混合,产生二硫键生成具有生物活性的人胰岛素。然而,在该路线中,通过直接混合两条肽链来产生具有生物活性的人胰岛素的效率相对比较低。“胰岛素原”路线现在更为常用, 在该路线中,首先在表达载体例如大肠杆菌或者酵母中表达由人胰岛素A链、B链和C链组成的人胰岛素原,将其纯化后在体外进行复性。将复性后的人胰岛素原用胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得到具有天然活性的人胰岛素。在该路线中,会产生消去B链30位苏氨酸的胰岛素副产物(DesB30-胰岛素),该副产物对胰岛素质量有不利影响。为了减少DesB30-胰岛素的产生,必须严格控制胰蛋白酶的用量、PH值和反应时间,使反应条件得难以控制。尽管进行了许多努力,还是不能完全避免DesB30-胰岛素,因为DesB30-胰岛素和胰岛素之间仅相差一个苏氨酸,将它们进行分离非常之困难。现在,普遍使用大型高效液相色谱分离胰岛素和DesB30-胰岛素,该分离过程大大加大了重组人胰岛素的生产成本,而且会产生大量的工业废物。现有技术中需要一种通过表达胰岛素原制备胰岛素的方法,避免胰蛋白酶对胰岛素原水解后消去B链30位苏氨酸。
本发明人经过大量实验发现,用保护赖氨酸代替胰岛素原中第四位(对应于胰岛素8链四位(B^))上的赖氨酸,得到的带有保护赖氨酸的胰岛素原在被胰蛋白酶和羧肽酶B水解时不会产生消去B链30位苏氨酸的胰岛素,这样的胰岛素原经复性、酶解处理后, 得到的在似9带有保护赖氨酸的胰岛素,根据不同的保护基团,在相应的条件下去保护,保护赖氨酸可转化为赖氨酸,形成具有活性的胰岛素。因此,在第一方面,本发明提供了一种第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原。在一个实施方案中,本发明还提供了一种在B^带有保护赖氨酸的胰岛素。因此,本发明的带有保护赖氨酸的胰岛素或胰岛素原比未经修饰的胰岛素或胰岛素原更稳定。为了通过生物翻译体系合成在B^带有保护赖氨酸的胰岛素或者在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原,本发明还提供了编码上述带有保护赖氨酸的胰岛素或胰岛素原的基因。对于人胰岛素原而言,所述编码带有保护赖氨酸的人胰岛素原的基因的序列为SEQ ID NO. 5。因此,在第二方面中,本发明提供了一种编码在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原的基因,所述基因是编码胰岛素原的基因,其中编码第四位氨基酸的密码子是UAG。在一个实施方案中,本发明还提供了一种编码在似9带有保护赖氨酸的胰岛素的基因,所述基因是编码胰岛素的基因,其中编码B29的氨基酸的密码子是UAG。在第三方面中,本发明还提供了一种制备在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法,包括在存在保护赖氨酰_tRNA。UA的情况下,使在编码第四位氨基酸残基的密码子为 UAG的胰岛素原基因mRNA在合适的翻译体系中翻译。在一个实施方案中,本发明还提供了一种制备在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法,包括在存在吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶、tRNACUA的情况下,在加有保护赖氨酸的培养基中,使在编码第四位氨基酸残基的密码子为UAG的胰岛素原基因在细胞的翻译体系中翻译。在一个具体实施方案中,本发明还提供了一种制备在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法,包括在存在编码吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶基因和保护赖氨酸、tRNACUA基因,使在编码第四位氨基酸残基的密码子为UAG的胰岛素原基因在翻译体系中翻译。在一些实施方案中,本发明还提供了一种制备胰岛素的方法,包括(1)将根据本发明的方法制备的在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原复性,使所述复性后的修饰胰岛素原水解成B^带有保护赖氨酸的胰岛素;(2)使步骤(1)中得到的带有保护赖氨酸的胰岛素上的保护赖氨酸转化为赖氨酸,得到胰岛素。在第四方面中,本发明还提供了在第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原或似9带有保护赖氨酸的胰岛素用于制备胰岛素的用途。在本发明的第四位带有保护赖氨酸的胰岛素原或似9带有保护赖氨酸的胰岛素及其制备方法和用途中,由于第四位或似9的保护赖氨酸阻止了酶解时消去胰岛素B链30 位苏氨酸,避免了副产物的产生,从而有效的简化了胰岛素原酶解和后续纯化的操作,从而使得到胰岛素更纯并使生产成本大大降低。图1为一些代表性的N ε取代的赖氨酸结构,它们分别是(从上至下、从左至右) N(e)-(叔丁氧碳基)-赖氨酸、N(e)-(苄氧碳基)-赖氨酸、N(e)-(邻硝基苄氧碳基)_赖氨酸、N(e)-(对硝基苄氧碳基)-赖氨酸、N(e)-(烯丙氧碳基)-赖氨酸,N(e)-(炔丙氧碳基)_赖氨酸,N(e)_(脯氨酰基)_赖氨酸,N(e)_(半胱氨酰基)_赖氨酸,N(e)_(环戊基氧碳基)_赖氨酸和N ε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][l,3] 二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_赖氨酸。图2显示了重组质粒pBK-PylRS的结构。图3显示了重组质粒pET-pylT-胰岛素-B^TAG的结构。图4为15 % SDS-PAGE凝胶电泳分析包涵体内的蛋白。图5为SDS-PAGE分析经过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化的带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的人胰岛素原。图6为SDS-PAGE分析纯化后的成熟人胰岛素。图7为带有N ε _(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素的质谱图。图8为胰岛素原的质谱图。
岛素;(4)在酸性条件下,将上述步骤(3)得到的人胰岛素上的Νε_(叔丁氧碳基)_赖氨酸转化为赖氨酸,则得到具有活性的重组人胰岛素。优选地,在上述步骤(1)中,所述在胰岛素原第四位带有终止子UAG的胰岛素原基因序列插入重组质粒pET-pylT-GFP,得到所述编码tRNAeuA(又称pylT)基因、在胰岛素原第四位带有终止子UAG的胰岛素原基因的重组质粒pET-pylT-insulin-B^TAG。实现了通过基因编码表达出在胰岛素原第四位带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的人胰岛素原。优选地,在上述步骤O)中,通过异丙基硫代半乳糖苷和N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸诱导所述宿主细胞中人胰岛素原的表达。优选地,在上述步骤( 中,所述在胰岛素原第四位带有N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸的人胰岛素原通过M-NTA琼脂糖凝胶进行分离纯化。更优选地,在胰岛素原第四位带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的人胰岛素原在其氨端带有六个组氨酸标签,这样能够通过利用M-NTA琼脂糖凝胶实现分离纯化。在上述步骤(3)中,酶解处理采用胰蛋白酶和羧肽酶B—步酶解的方法。因为 N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的侧链不带有正电荷,所以它不被胰蛋白酶识别和水解。优选地,在上述步骤中,所述人胰岛素上的Νε_(叔丁氧碳基)_赖氨酸通过三氟乙酸处理转化为赖氨酸。通过三氟乙酸处理酶解后的人胰岛素的简单操作,即得到具有活性的人胰岛素。
实施例1一、实验材料用于表达胰岛素原的生物载体-大肠杆菌变株BL21 (DE3)和用于DNA扩增的脱氧核酸多聚酶Platinum Pfx从Invitrogen公司购买;用于质粒构建的脱氧核酸内切酶-NdeI和SacI,小牛肠碱性磷酸酶-CIP,脱氧核酸连接酶-T4 DNA ligase,脱氧核酸分子标尺,和蛋白质分子标尺从NEB Biolabs公司购买;LB培养基和N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸从Sigma公司购买;用于质粒小量提取的试剂盒从Qiagen公司购买。其他未标明来源的试剂来自VWR。二、实验方法1、质粒的构建用于在大肠杆菌变株BL21 (DE3)内表达在胰岛素原第四位带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的人胰岛素原的两个质粒如图2和图3所示(质粒的构建由ChemDraw软件进行,该软件可获自PerkinElmerInformatics公司)。重组质粒pBK-PylRS带有卡那霉素抗性基因和吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶(PylRQ基因。PylRS的基因序列为SEQ ID NO. 3、氨基酸序列为 SEQ ID NO. 6。重组质粒pET-pylT-insulin-B^TAG从质粒pET-pylT-GFP转化而来。 此质粒带有氨苄抗性基因、tRNAraA基因(序列为SEQ ID NO. 4)和在胰岛素原第四位带有琥珀终止子UAG的胰岛素原基因(又称insulin-B^TAG)基因(序列为SEQ ID NO. 5),胰岛素原对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.2,在其氨端带有六个组氨酸的标签(6XHis),并且在胰岛素原第四位带有琥珀密码子UAG的无意义突变。关于pBK-PylRS和pET-pylT_GFP的详情可参见文献[The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Wang YS, Russell WK, Wang Z, Wan W, Dodd LE, Pai PJ, Russell DH, Liu WR. Mol Biosyst. 2011 Mar 1 ;7 (3) :714-7. Epub 201 IJan 14.]。重组质粒pET-pylT-insulin-B^TAG按照标准克隆方法构建,该方法使用了 Platinum Pfx脱氧核糖聚合酶。构建质粒的结构已经过测序确认。所有寡核苷酸引物购自 htegrated DNA ^Technologies,Inc. pET-pylT-insulin-B^TAG质粒的构建过程简述如下(1)使用 Insulin-NdeI-F(序列为 SEQ ID N0. 7)和 Insulin-SacI-R(SEQ ID NO. 8)作为引物对双螺旋多聚核苷酸序列为SEQ ID Ν0. 5)进行扩增,随后用内切酶NdeI和Mel进行酶切;(2)在大肠杆菌变株ToplO (来自Invitrogen)内扩增质粒pET-pylT-GFP并用质粒小量提取的试剂盒(Qiagen公司)提取,提取后的pET-pylT-GFP用内切酶NdeI和McI 进行酶切,酶切后的pET-pylT-GFP再用CIP脱去5’端的磷酸;(3)利用脱氧T4核酸连接酶将步骤(1)中得到的酶切产物插入到步骤( 酶切的质粒中,所得质粒含有Insulin-BWTAG序列,如图3所示。2、在胰岛素原第四位带有N ε _(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素原的表达为了表达在胰岛素原第四位带有N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素原, 将重组质粒pBK-PylRS和pET-pyIT-Insulin-B^TAG电转化大肠杆菌变株BL21(DE3)细胞。电转化后的BL21(DE3)细胞首先在37°C进行恢复,然后铺在带有50微克/毫升的卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂上进行选择带有pBK-PylRS和 pET-pyIT-Insul in-B29TAG两个质粒的菌落。随后,一个单菌落被转入到5毫升的LB培养基进行过夜培养。培养后的细胞被转移到含有1升LB培养基的4升震荡培养瓶中,并在转速为300转/分钟的37摄氏度恒温震荡培养箱中培养。LB培养基中加入了 50微克/毫升的卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素来维持电转化细胞内的两种质粒。当细胞长到培养瓶中的培养液在600纳米光波的吸光度(0D_)为大约0. 7时,将1毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和1毫摩尔/升的N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸加入到该LB培养液中来诱导胰岛素原的表达。12个小时后收集细胞。同时,我们在7升的发酵装置(New Brunswick BioFlo 310)内进行了大量制备细胞。简言之,我们首先准备了 121摄氏度30分钟灭菌的含5升LB培养基的7升发酵罐、121 摄氏度30分钟灭菌的250毫升消泡剂(Dow Corning Antifoam 1510)、灭菌的100毫升的 50% (体积/体积)的甘油水溶液和过滤除菌的100毫升的1摩尔/升的N ε _(叔丁氧碳基)-赖氨酸原液。为了促进N-(叔丁氧碳基)-赖氨酸的溶解,N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸被溶在一个当量的氢氧化钠中。100毫克/毫升的氨苄青霉素、50毫克/毫升的卡那霉素和1摩尔/升的IPTG分别通过使用0. 45微米的过滤膜过滤的方法除菌。在发酵前,我们在 1升的震荡培养瓶内过夜培养了 200毫升的携带pBK-PylRS和pET-pyITHnsulin-B^TAG 两个质粒的大肠杆菌BL21 (DE)细胞。过夜培养的细胞然后转入含有5升LB培养基的发酵罐内。随后加入20毫升的消泡剂原液、5毫升的氨苄青霉素原液和5毫升的卡那霉素原液。 当细胞长到培养液在600纳米光波的吸光度(0D_)为1. 0时,加入5毫升IPTG和5毫升 Νε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸到发酵罐中,诱导胰岛素原的表达。在发酵过程中,ρΗ值被设定在7.0士0.1。空气提供的速度被调节在使得溶解氧达到30%以上的饱和度。发酵罐内转子的速度为400转/分钟,以保持溶解氧达到30%的饱和度。诱导6小时后,我们加入了 100毫升50%甘油提供附加的碳原料,接着在12小时后收集细胞。3、从包涵体中纯化胰岛素原根据从包涵体内提取蛋白的传统方法提取在胰岛素B链四位对应位置带有 N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素原。简言之,首先将上一步骤收集的细胞悬浮于裂解液中。裂解液的组成50毫摩尔/升pH8. 0的Tris-HCl缓冲液、100毫摩尔/升的氯化钠、 5毫摩尔/升的乙二胺四乙酸、0. 的叠氮化钠和0. 5%的表面活性剂Triton-XlOO。然后,将悬浮在裂解液中的细胞超声裂解。将超声裂解后的混合液在超速离心机内离心沉降 (20分钟,6000X克作用力,4摄氏度)。将离心沉降后的沉淀再重新悬浮在新的裂解液中并再次进行超声裂解和离心沉降。在重复三次后,将离心后的沉淀物悬浮在洗涤液(不含 Triton-XlOO的裂解液)进行超声裂解和离心沉降两次(20分钟,6000X克作用力,4摄氏度)。然后将包涵体溶解在还原缓冲液中。还原缓冲液的组成10毫摩尔/升ρΗ 8.0的 Tris-HCl缓冲液、100毫摩尔/升的磷酸二氢钠和8摩尔/升的尿素。将在37摄氏度下不溶于还原缓冲液的杂质通过离心沉降的方法除去。离心沉降后的上清液然后和2-3毫升的M-NTA琼脂糖凝胶在4摄氏度下进行搅拌混合。两个小时后将混合液倒入空的聚丙烯柱中,并用20-30毫升的还原缓冲液(ρΗ值6. 2)洗去未与M-NTA琼脂糖凝胶结合的蛋白。 最后,用洗脱液洗脱与M-NTA琼脂糖凝胶结合的胰岛素原。洗脱液的组成50毫摩尔/升PH值为4. 5的乙酸缓冲液、100毫摩尔/升的磷酸二氢钠和8摩尔/升的尿素。将洗脱后的经过纯化的蛋白质收集并浓缩到200微克/毫升,然后用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳进行分析,结果见下文。4、胰岛素原的折叠复性和酶解处理转化成带有N ε _ (叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰
岛素为了使得M-NTA琼脂糖凝胶纯化的胰岛素原复性,我们首先通过透析的方法将胰岛素原的缓冲液转变为组成为100毫摩尔/升PH值为10. 5的TriS-HCl,100毫摩尔/ 升甘氨酸和8摩尔/升尿素的缓冲液。然后加入5毫摩尔/升的还原性的谷胱甘肽(购自 VffR)和0. 5毫摩尔/升的氧化性的谷胱甘肽并在4度下搅动过夜。然后,将胰岛素原溶液中变性的胰岛素原用逐步透析的方法转化为复性的胰岛素原。整个透析通过四步完成,每一步透析操作为M个小时。每步透析的复性缓冲液都含有100毫摩尔/升ρΗ值为10. 5 的Tris-HCl、400毫摩尔/升的精氨酸、1毫摩尔/升的乙二胺四乙酸、1毫克/升亮肽素、 0. 2豪摩尔/升的苯甲基磺酰氟和辅以浓度递减的尿素(4. 0摩尔/升,2. 0摩尔/升,1. 0 摩尔/升,和0.00摩尔/升)。-最后,将复性的胰岛素原的缓冲液透析为消化缓冲液(50 毫摩尔/升的Tris-HCl,pH值为9. 0)。将透析后的复性胰岛素原先浓缩至lmg/ml,然后加入胰蛋白酶和羧肽酶B (购自VWR)在4度下酶解消化。加入的胰蛋白酶和羧肽酶B的量为胰岛素原的六百分之一。在5小时后加入0. 5毫克/升的亮肽素终止消化反应。5、带N ε _(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素的去保护及质谱分析我们采取了简单的化学方法除去胰岛素B链四位的N ε _(叔丁氧碳基)_赖氨酸中的叔丁氧碳基来恢复赖氨酸并获得成熟的人胰岛素。简而言之,向上一步中得到的带有 N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素溶液中加入2%的三氟乙酸(购自VWR),2个小时后加入碳酸氢铵终止反应。终止反应后的溶液被直接加入到Superdex 200 10/300GL的凝胶过滤柱(购自GEHealthcare Life Science)中并使用快速蛋白液相色谱(FPLC)进行分离。 凝胶过滤柱的缓冲液为50毫摩尔/升ρΗ为7的磷酸钠和150毫摩尔/升的氯化钠。最终分离出的胰岛素被浓缩到1毫克/毫升,并在-80摄氏度的冰箱内保存。将得到的人胰岛素在用Wzip-tip处理之后进行了基体辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-T0F)分析。四、实验结果1、胰岛素原从包涵体中的分离提纯我们首先对提取的包涵体进行了 SDS-PAGE分析,如图4所示,染色用的是0. 1% 考马斯亮蓝R-250,第一个条带为蛋白分子标尺,第二个和第三个条带代表不同量的包涵体,第二个条带加入的包涵体的量为3微升,第二个条带加入的包涵体的量为4微升。在图 4中,与胰岛素原所对应的蛋白带清晰可见,表明在胰岛素原第四位带有N ε -(叔丁氧碳基)_赖氨酸的胰岛素原被成功的表达。我们在设计胰岛素原的时候在它的氨端添加了 6 组氨酸标签(6XHis),因为6组氨酸标签和Ni-NTA琼脂糖凝胶特异的结合,所以胰岛素原的提纯可以通过使用M-NTA琼脂糖凝胶完成。如图5所示(其中第二到第七个条带为同一次提纯过程中收集的连续6个样),经过M-NTA琼脂糖凝胶纯化后的胰岛素原已经相对较纯。通过对纯化后的胰岛素原进行BCA蛋白质浓度分析所测得的胰岛素原的表达量为85 毫克/升。2、胰岛素原的酶解和去保护以及质谱分析
因为N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的保护作用,B^位在胰蛋白酶酶解时不被识别成为酶切点。可以将胰蛋白酶和羧肽酶B在一步中使用,然后在不需要分离的情况下进行 N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的脱保护。脱保护后的胰岛素可以进行一步凝胶过滤柱分离纯化。图6显示的为最后成熟的胰岛素的SDS-PAGE分析,其中第二到第六条带代表加入不同量的1毫克/毫升的胰岛素(从第二到第六0. 5,2,2,4,4微升)。根据SDS-PAGE分析和后续的质谱分析,最后产生的胰岛素的纯度达到98%。表明胰蛋白酶和羧肽酶B有效的切除了胰岛素原的C链和氨端的六组氨酸标签并且用三氟乙酸成功的消去了N ε-(叔丁氧碳基)_赖氨酸的叔丁氧碳基。成熟的人胰岛素的质谱分析如图7所示,显示了相当高的纯度。成熟人胰岛素的分子量和预计值相同,预计值为5808Da。胰岛素原的质谱分析如图8 所示,分子量也和预计值相同,预计值为10733Da。通过对成熟人胰岛素进行BCA蛋白质浓度分析所测得的胰岛素原的表达量为50毫克/升。综上,通过基因编码定点引入N ε取代的赖氨酸非天然氨基酸实现简化重组人胰岛素的合成,利用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRQ和吡咯赖氨酸tRNA(pylT)组成的一组在大肠杆菌内形成正交的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(aaRS)-tRNA对,N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸被特异的编码在无意义琥珀密码子UAG上并被定点加入到胰岛素原中原第四位上。利用普通的LB培养基和大规模发酵罐来维持中性的ρΗ值,带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的胰岛素原在大肠杆菌内表达量达到85毫克/升。表达的带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的胰岛素原沉积在大肠杆菌的包涵体中。纯化的带有N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸的胰岛素原经过传统的方法折叠复性后进行酶解处理。通过对胰岛素原进行胰蛋白酶和羧肽酶B的一步酶解处理和三氟乙酸处理酶解产物的简单操作产生具有完全活性的重组人胰岛素。利用凝胶层析柱纯化的人胰岛素最终达到50毫克/升的表达量。实施例2在本实施例中,以相同操作重复实施例1的步骤,不同之处是用赭石密码子UAA 代替实施例实施例1中的琥珀密码子UAG ;用tRNAUUA代替实施例1中的tRNAeuA ;用N ε -(苄氧碳基)-赖氨酸代替实施例1中的N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸;以SEQ ID NO. 9代替SEQ ID NO. 5;以SEQ ID NO. 11代替SEQ ID NO. 4 ;并且从胰岛素上脱去N ε-(苄氧碳基)-赖氨酸的步骤如下在表达中得到的带有N ε -(苄氧碳基)-赖氨酸的胰岛素溶液中加入0. IM 的溴酸(购自VWR),2个小时后加入碳酸氢铵终止反应。该实施例的结果与实施例1的结果类似。根据SDS-PAGE分析和后续的质谱分析, 最后产生的胰岛素的纯度达到97%。通过对成熟人胰岛素进行BCA蛋白质浓度分析所测得的胰岛素原的表达量为48毫克/升。实施例3在本实施例中,以相同操作重复实施例1的步骤,不同之处是用蛋白石密码子 UGA代替实施例实施例1中的琥珀密码子UAG ;用tRNAUCA代替实施例1中的tRNAeuA ;并且用N ε -(邻硝基苄氧碳基)-赖氨酸代替实施例1中的N-(叔丁氧碳基)-赖氨酸;以SEQ ID NO. 10代替SEQ ID N0. 5 ;以SEQ ID N0. 12代替SEQ ID N0. 4 ;并且从胰岛素上脱去N ε -邻硝基苄氧碳基的步骤如下将表达得到的带有N ε -(邻硝基苄氧碳基)-赖氨酸的胰岛素溶液用365纳米的紫外光照射30分钟去掉修饰基团。该实施例的结果与实施例1的结果类似。根据SDS-PAGE分析和后续的质谱分析,最后产生的胰岛素的纯度达到98%。通过对成熟人胰岛素进行BCA蛋白质浓度分析所测得的胰岛素原的表达量为45毫克/升。 通过上述实施例1-3表明,我们验证了通过引入N ε取代的赖氨酸可以实现天然人胰岛素的合成。可以理解的是,利用相同的方法一个侧链氨基被保护的赖氨酸可以被引入到胰岛素类似物的前体来简化胰岛素类似物比如门冬胰岛素和甘精胰岛素的合成。同时,因为在B^位的N ε -(叔丁氧碳基)-赖氨酸阻止了胰蛋白酶酶解副产物的产生,本发明有效的简化了胰岛素原酶解和后续纯化的操作,从而使得生产胰岛素的成本大大的降低。
本发明涉及在29位带有保护氨基酸的胰岛素原和在B29位带有保护氨基酸的胰岛素,以及所述胰岛素原和胰岛素的基因。本发明还涉及本发明的在29位带有保护氨基酸的胰岛素原和在B29位带有保护氨基酸的胰岛素的制备方法和用途。
含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法
- 专利详情
- 全文pdf
- 权力要求
- 说明书
- 法律状态
查看更多专利详情
下载专利文献
下载专利
同类推荐
-
万为, 刘文设J·戈比克, S·驰罗匹克J·戈比克, S·驰罗匹克J·戈比克, S·驰罗匹克胡诗珠胡诗珠
您可能感兴趣的专利
-
张德贵, 贺建丽张德贵, 贺建丽胡东升, 王玉芳彭建林张兴梅葛忙根
专利相关信息
-
J·L·纳德勒杨松涛杨松涛马吉银叶大林, 夏信群