基于磁性纳米粒子检测三聚氰胺的核磁共振传感器及其制备方法和应用的制作方法[0002]传感器是一种装置，是检测或测量一种物理性质并进行记录，显示或以其他方式作出响应。传感器可以分为三类，即①物理传感器，用来测量距离、质量、温度、压力等；②化学传感器，用化学或物理响应测定化学物质生物传感器，通常应用某种生物敏感基元来检测化学物质。所有这些装置必需与某种传感装置相联接，这样才可能检测到所发生的响应。组成部件主要包括:分析质、识别单元、传导器、测量装置。[0003]核磁共振由于①MRI (核磁共振成像，或磁成像)对软组织有极好的分辨力。对膀胱、直肠、子宫、阴道、骨、关节、肌肉等部位的检查优于CT;②各种参数都可以用来成像，多个成像参数能提供丰富的诊断信息，这使得医疗诊断和对人体内代谢和功能的研究方便、有效。例如肝炎和肝硬化的Tl值变大，而肝癌的Tl值更大，作Tl加权图像，可区别肝部良性肿瘤与恶性肿瘤； ③通过调节磁场可自由选择所需剖面。能得到其它成像技术所不能接近或难以接近部位的图像。可作矢状面、冠状面、横断面成像，不像CT只能获取与人体长轴垂直的横断面；④对人体没有电离辐射损伤；⑤原则上所有自旋不为零的核元素都可以用以成像，例如氢(H)、碳(C)、氮(N)、磷(P)等，成为现在和将来最重要的检测方法。目前大多数存在的造影剂分为Tl造影剂(例如:Gd类、Mn类、)和T2造影剂(例如:Fe类)，这些具有磁性核的造影剂通过改变局部或整体Tl、T2弛豫时间来达到提高信号差异，从而实现造影增强功能。对这些造影剂修饰通过修饰靶向因子，或特定的识别单元，产生核磁共振传感器(MR Sensor)。[0004]目前核磁共振传感器已经广泛应用与生活的各各方面，比如:重金属粒子检测(Hg2+、Zn2+)、病毒检测、蛋白质、小分子、细菌等。核磁共振传感器主要依靠表面功能化的造影剂本身在不同状态(单体和聚合态)下的的磁学性质改变，引起周围水分子或质子的弛豫时间发生改变，从而达到检测的目的。例如:Hyun Jung Chung、Cesar M.Castro>Hyungsoon Lm>Hakho Lee、Ralph Weissleder合成了磁性DNA纳米系统来快速检测细菌的表型，通过数据放大直观检测磁信号的变化。同时核磁共振传感器作为一种新的、方便、简单的检测方法、其在不同模式下的的检测原理、如何更加广泛的应用还需进一步的探索和研究。[0005]三聚氰胺具有高含量氮(66 % )，经常被用来添加到乳制品中来提高氮的含量，来满足国家标准对乳制品中蛋白质含量的要求。但尤其会对婴儿和宠物产生明显的毒性。在奶粉生产过程中加入化工原料三聚氰胺，同时掺入了混在三聚氰胺当中的三聚氰酸。由于人体无法转化这两种物质，最终三聚氰胺和三聚氰酸被血液运送到肾脏，两种物质相遇，通过氢键的相互作用，以网格结构重新形成不溶于水的大分子复合物，并沉积下来，形成结石，结果造成肾小管的物理阻塞，导致尿液无法顺利排除，使肾脏积水，最终导致肾脏衰竭。[0006]本发明基于生物相容性好的磁性纳米材料，修饰特异性识别的受体单元，通过氢键与三聚氰胺结合，促使磁性纳米材料发生状态的改变，记录驰豫时间的改变实现其高效检测。目前，采用磁性纳米材料检测三聚氰胺的报道不多，本发明既丰富了三聚氰胺的检测方法，也扩大了磁性纳米材料的应用范围。
[0007]本发明的目的在于提供一种基于磁性纳米粒子的检测三聚氰胺的核磁共振传感器，同时提供上述核磁共振传感器的制备方法，并将其应用于三聚氰胺的检测。 [0008]本发明的技术方案为:
[0009]一种基于磁性纳米粒子的检测三聚氰胺的核磁共振传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)特异性受体单元的制备::1，8- 二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)与2_溴乙酸苄酯的摩尔比为1:1，三聚氰酸过量(三聚氰酸:2_溴乙酸苄酯=3:1~5:1 )，在氮气或者惰性气体的条件下，在无水DMF溶剂中，70°C恒温反应10-20h，提纯得到苄基酯，水解，酸化，用THF提取得到特异性受体单元；
[0011](2)含有特异性受体单元的Fe/Fe304的磁性纳米粒子的制备:将步骤(1)所得特异性受体单元和聚乙二醇单羧酸分别溶于吡啶，分别加入连接剂，活化0.5h~2h ;分别将溶有缩合剂和多巴胺盐酸盐的氯仿溶液加入上述活化好的溶液中，磁力搅拌4~8h，合并溶液，加入Fe/Fe304磁性纳米粒子，反应10_20h，用正己烷沉淀，离心。
[0012]所述提纯为:通过柱色谱分离提纯，CH2Cl2:Me0H=96:4。
[0013]得到的苄基酯在浓NaOH条件下水解，用浓盐酸酸化使溶液的pH值为I。
[0014]所述连接剂为N-羟基琥珀酰亚胺为；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
[0015]所述Fe/Fe304磁性纳米粒子的制备方法为:在氮气或惰性气体氛下，以十八烯为溶剂，Fe (CO) 5作为铁源，油胺为表面活性剂和稳定剂，盐酸十六胺增强结晶度，高温裂解制备Fe/Fe304磁性纳米粒子材料；所述高温的条件为180-200°C ;十八烯、Fe (CO)5、油胺和盐酸十六胺的配比为20mL:0.7mL:0.2mL:0.1mg0
[0016]由上述方法制备的基于磁性纳米粒子检测三聚氰胺的核磁共振传感器，是一种水溶性的含有特异性受体单元的磁性纳米粒子，粒径大小约为10~20nm。
[0017]本发明通过特异性受体单元对三聚氰胺的识别能力，进行三聚氰胺的靶向实验，诱导磁性纳米粒子进行自组装。在此过程中，磁性纳米粒子的自组装会改变周围水质子的弛豫率，这种改变可以被核磁共振仪检测下来，从而实现对三聚氰胺的检测；本发明的制备方法简单安全，原材料经济，易得，工艺可控性强；本发明为纳米磁共振造影剂材料的应用提供了一种新的前景一纳米磁共振传感器，丰富了纳米材料的研究领域。



[0018]图1为实施例1所制备的特异性受体单元的IH NMR谱图。
[0019]图2为实施例2所制备的磁性纳米粒子的TEM图。[0020]图3为实施例2所制备的磁性纳米粒子的DLS。
[0021]图4为实施例2所制备的磁性纳米粒子的X射线衍射图谱。
[0022]图5为实施例2所制备的磁性纳米粒子的红外谱图。
[0023]图6为实施例3所制备的含有特异性受体单元的磁性纳米粒子的TEM图。
[0024]图7为实施例3所制备的含有特异性受体单元的磁性纳米粒子的红外谱图。
[0025]图8为实施例3所制备的含有特异性受体单元的Fe/Fe304纳米粒子的DLS。
[0026]图9为实施例5中含有特异性受体单元的磁性纳米粒子加入30 μ M三聚氰胺溶液的 DLS。
[0027]图10为实施例5中含有特异性受体单元的磁性纳米粒子在0、2、4、6、8、10、12、……30 μ M的三聚氰胺的溶液中Λ Τ2值的变化率。
[0028]图11为实施例6中含有特异性受体单元的磁性纳米粒子在30 μ M尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶溶液中Λ Τ2值的变化。

[0029]下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
[0030]实施例1
[0031](I)取5.0g三聚氰酸加入到150mL的干的DMF，再加入1.15mLDBU, 1.2mL2-溴乙酸苄酯，在Ar氛围下，常温搅拌lh，然后加热到70°C，保持12h以上，反应结束后，冷却到室温，减压蒸馏除去DMF，得到的固体用THF洗涤过滤，得到的滤液浓缩，用冷水洗涤过滤并干燥，得到的固体用柱色谱(Si02，CH2Cl2/Me0H，24:l)分离提纯，得到白色的固体苄基酯。
[0032](2)取477mg NaOH溶解在15mL H2O中，混合均匀，加入661mg苄基酯，在常温下搅拌过夜，反应结束后，用36wt%HCl酸化，PH=1，减压蒸馏除去H2O,得到的物质用THF过滤提取多次，浓缩滤液，得到白色固体特异性受体单元。
[0033]本实施例所制备的特异性受体单元的1H NMR谱图如图1所示。
[0034]实施例2:
[0035]用量筒取20mL十八烯，用移液管取0.2mL油胺，用分析天平取0.1gHDA.HC1，加入到三口烧瓶中，混合均匀，磁力搅拌并排除空气，时间大约控制在lh。温度升到120°C，保持30min。加热到1801:，用队气保护，快速注射0.7mL Fe (CO) 5，保持搅拌速度最大。在180°C保持20min后，注射油酸(0.3mL，Immol )，继续保持lOmin。移除热源，冷却至室温，暴露空气。离心(12000rpm, IOmin),直至洗干净。得到的Fe/Fe304纳米粒子分散在正己烧中。
[0036]本实施例所制备的磁性纳米粒子的--Μ图如图2所示；DLS如图3所示；X射线衍射图谱如图4所示；红外谱图如图5所示。
[0037]实施例3:
[0038](I)分析天平称取受体单兀(m=16.84mg, M = 187.llg/mol, η = 0.09mmol)溶于5mL吡唳中，加入N-羟基琥拍酰亚胺25mg,反应Ih,得溶液A ;分析天平称取聚乙二醇单羧酸(m = 60mg, M = 2000g/mol, η = 0.03mmol)溶于5mL吡唳中，加入N-羟基琥拍酰亚胺IOmg,反应Ih,得溶液B。
[0039](2)分析天平称取 Dopa-HCl (m=15.2mg, M=189.68g/mol, η = 0.08mmol)、l_ 乙
基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐25mg溶于ImL氯仿中，超声使分散均匀，得溶液A’ ；分析天平称取 Dopa-HCl (m=4mg, M=189.68g/mol, n = 0.02mmol)、1_ 乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐IOmg溶于ImL氯仿中，超声使分散均匀，得溶液B’ ；溶液A’加入到溶液A中，溶液B’加入到溶液B中。
[0040](3)磁力搅拌4h，把二者合并；加入15~25mg Fe/Fe304纳米粒子，摇床过夜。用正己烷沉淀，用水离第一遍，其余用乙醇离心。
[0041]图6为本实施例所制备的含有特异性受体单元的磁性纳米粒子的TEM图；
[0042]图7为本实施例所制备的含有特异性受体单元的磁性纳米粒子的红外谱图；
[0043]图8为本实施例所制备的含有特异性受体单元的Fe/Fe304纳米粒子的DLS。
[0044]实施例4:
[0045](I)分析天平称取受体单兀(m=16.84mg, M = 187.llg/mol, η = 0.09mmol)溶于5mL吡唳中，加入N-羟基琥拍酰亚胺25mg,反应Ih,得溶液A ;分析天平称取聚乙二醇单羧酸(m = 30mg, M = 2000g/mol, η = 0.015mmol)溶于5mL吡唳中，加入N-羟基琥拍酰亚胺IOmg,反应Ih,得溶液B ；
[0046](2)分析天平称取 Dopa-HCl (m=15.2mg, M=189.68g/mol, η = 0.08mmol)、l_ 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐25mg溶于ImL氯仿中，超声使分散均匀，得溶液A’ ；分析天平称取 Dopa-HCl (m=2mg, M=189.68g/mol, η = 0.01mmol)、1_ 乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐IOmg溶于ImL氯仿中，超声使分散均匀，得溶液B’ ；溶液A’加入到溶液A中，溶液B’加入到溶液B中；
[0047](3)磁力搅拌4h,把二者合并；加入15~20mg纳米粒子,摇床过夜。用正己烧沉淀，用水离第一遍，其余用乙醇离心。
[0048]实施例5:
[0049]在含有0.032mM Fe的修饰有特异性受体单元的纳米粒子的溶液中加入三聚氰酸，使三聚氰酸的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、……30 μ M0
[0050]图9为本实施例中含有特异性受体单元的磁性纳米粒子加入30 μ M三聚氰胺溶液的 DLS。
[0051]检测由不同的三聚氰胺的浓度引起的Λ Τ2值的变化率；结果如图10所示。随着三聚氰胺浓度的增加，Λ Τ2值逐渐变大，当三聚氰胺的浓度为30 μ M时，Λ Τ2的变化率约为0.406。三聚氰胺的最低检测限约为2 μ M0
[0052]实施例6:
[0053]在含有0.032mM Fe的修饰有特异性受体单元的纳米粒子的溶液中加入30 μ M胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶，比较由具有相似结构的物质所引起的Λ Τ2值的变化，检测该磁共振造影剂传感器材料对三聚氰胺的选择性。结果如图11。
[0054] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。