白菜软腐菌HarpinEccs蛋白质与锌离子的络合方法和络合产物制作方法

吴伯骥, 吴彦

2012年11月14日

2012年5月31日

2012年5月31日

吴伯骥

A01N47/44GK102775479SQ201210175510

软腐 HarpinEccs 白菜

1.白菜软腐菌HarpinEccs蛋白质与锌离子的络合方法，HarpinEccs蛋白的原产生菌为胡萝卜软腐欧氏杆菌Erwinia carotovora subsp. carotovora白菜软腐菌变种CSDS001菌株，HarpinEccs蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID. Nol ;络合过程和条件包含 (l)HarpinEcxs蛋白质和硫酸锌的质量配比是1 I至6 I之间；(2)反应浓度HarpinEees蛋白质和硫酸锌混合、稀释为含水量80%至60% ； (3)反应PH和静置处理调节PH到6-8，静置预处理0-1小时；(4)反应温度和时间络合反应温度为30°C -40°C，络合处理时间1-2小时，络合反应时，反应混合液需要不断搅拌，搅拌速度为每分钟100-300转；(5)反应过程中，用EDTA法监测络合率，络合率保持稳定后，经红外光谱KBr测定，如果C00 (-1)和NH3(+1)的伸展振动都向低波数位移，表明C00 (-1)和NH3(+1)与加入的金属离子络合配位，作为完成络合物产物生成的指标；(6)反应完成后，进行低温真空连续干燥处理，最后收集络合产物，Harpineccs蛋白质锌络合物2.一种白菜软腐菌HarpinEccs蛋白质与锌离子的络合物，其特征在于，采用权利要求I所述的方法制得，通用表达形式是〔中心离子锌(O、N、S、C等配位原子或原子团)〕Harpinaxs非配位原子或原子团,简写为〔锌〕_HarpinEcxs,或〔Zn〕_HarpinEcxs3.根据权利要求2所述之白菜软腐菌HarpinEccs蛋白质与锌离子的络合物的用途，其特征在于，诱导以下供试植物的作用表现出更强的抗病、防虫和生长发育的促进功能，以及其它抗逆性

下面结合附图和具体实施对本发明作进一步描述从白菜软腐细菌中克隆的hrpN—基因与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp carotovora)的hrpNE基因具有90 %以上的同源性，而其表达产物 harpinEees蛋白与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的harpinEcc蛋白也有6个氨基酸的差别鉴于所分离的细菌菌株的来源不同，包括寄主植物不同和地区差异性，以及hrpN基因和Harpin蛋白质的同源性、遗传多样性和差异性，我们将所分离的白菜软腐菌菌株定名为“Erwinia carotovora subsp. carotovora strain CSDS001”,而将从该菌株中克隆出的hrpN基因及其编码产物Harpin蛋白分别定名为“hrpNEcxs基因”和“HarpinEc;c;s蛋白”2、HarpinEees蛋白的氨基酸酸序列为SEQ ID. Nol，具有以下分子属性(I)序列中共356个氨基酸残基，其中各氨基酸组成分别为Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ilel3、Lysl7、Thrl3、Aspl6、PhelO、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、HisUPro9 ； (2)分子量35. 58kda ； (3)等电点pi 5. 26 ； (4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp. carotovora)褐腐致病变种的HarpinE蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换，分别为 Ser7tl — Gly70> Gly113 — Ser113> Ala115 — Val115、Gly249 — Ala249、Arg317 — Ala317、Lys352 — Gln352 ； (5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21 %和11 %，尤其是在第I、2个突变氨基酸Gly7tl和Ser113之间，其丰度分别高达56%和28%;(6)缺乏半胱氨酸Cys ;(7)对温度特稳定，在100°C沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(8)没有四级结构3、Harpineccs相关蛋白质HarpinEcxs蛋白相关的Harpin类蛋白激发子包括(I)与Harpinaxs蛋白具有较高同源性的Harpin类蛋白质,如HarpinE、HarpinEa、HarpinEch>Harpinpst> Harpinpsg、Harpinpss等；(2)通过基因重组方式获得的具有Harpin功能活性的Harpineccs 融合蛋白及其它 Harpin 融合蛋白，如 HarpinEccs+HarpinEcc> HarpinEccs+HarpinEa>Harp i nEccs+Harp i nEch > Harp i nEcc+Harp i nEca > Harp i nEcc+Harp i nEch > Harp i nEa+Harp i nEch 等实施例I-6, HarpinEees锌络合物制备(l)HarpinEcxs蛋白质和硫酸锌的质量配比是1 I至6 I之间；(2)反应浓度HarpinEees蛋白质和硫酸锌混合、稀释为含水量80%至60% ； (3)反应PH和静置处理调节PH到6-8，静置预处理时间0-1小时；(4)反应温度和时间络合反应温度为300C -40°C，络合处理时间1-2小时，络合反应时，反应混合液需要不断搅拌，搅拌速度为每 分钟100-300转；(5)反应过程中，用EDTA法监测络合率，络合率保持稳定后，经红外光谱KBr测定，如果COO(-1)和NH3(+1)的伸展振动都向低波数位移，表明COO(-1)和NH3(+1)与加入的金属离子络合配位，作为完成络合物产物生成的指标；(6)反应完成后，进行低温真空连续干燥处理，最后收集络合产物，HarpinEcxs蛋白质锌络合物其具体工艺条件和结果如图I所示我们用HarpinEa, HarpinEcc, HarpinEccs及其锌络合物(由以上实施例取得)对拟南芥全基因表达的影响进行了对比研究，从诱导全基因的表达数量和诱导水平着手，目的是进一步从分子水平和理论上为Harpin蛋白锌络合产物优于未络合的Harpin蛋白提供依据以实施例I所获得的HarpinEccs锌络合物为例，图2结果表明，在同等条件下，经过24小时诱导,诱导表达上调2倍以上的基因数，HarpinEa、HarpinEcc、HarpinEccs锌络合物明显高于所对应的HarpinEa、HarpinEcc、HarpinEees未络合蛋白，特别是HarpinEcc、HarpinEees锋络合物明显高于对应的HarpinEcc、HarpinEees蛋白，进一步说明，HarpinEa, HarpinEcc, HarpinEccs锌络合物能提早启动或激发植物的共同的防御机制和生长机制，发挥作用的时间更长，效率更高我们可以很容易选出3号为最佳组合条件，达到了我们对产物的需求在进行Harpineccs蛋白锌络合物的制取过程中，需要注意的是，反应浓度小时(含水量高)，络合的时间可以缩短，反应浓度高时(含水量低)，络合的时间可以加长，最好选择能使反应物充分溶解的含水量(80%至60%);反应温度高时，络合的时间可以缩短，考虑到蛋白质的活性，络合反应的温度不宜过高，最好控制在30°C -40°C之间；络合反应的时间不宜过短，否则形成的络合物不稳定，最好控制在1-2小时之间，时间过长络合率不再升高而无意义；搅拌速度也不可过快，否则形成的络合物不稳定，最好控制在每分钟100-300转之间；PH值不可过低，过低影响络合物的形成，过高影响络合物的稳定性，最好控制在6-8之间我们用钾、钙、镁、铁、铜、锰的硫酸盐作络合剂，即以钾、钙、镁、铁、铜、锰作中心离子或中心原子，用上述同样的条件组合，与作为配位体的Harpin^s蛋白进行络合反应制取络合产物，也获得了〔K〕-HarpinEccs>〔Ca〕-HarpinEccs>〔Mg〕-HarpinEccs>〔Fe〕-HarpinEccs>〔Cu〕-HarpinEcxs、(Mn)-Harpineccs络合蛋白的相似结果,只是最佳组合条件有所不同，但是最佳的条件是实施例1-6公开的内容与此同时，我们用Harp i nE、Harp i nEa、Harp i nEch、Harp i npst、Harp i npsg、Harp i npss 蛋白作配位体，用上述同样的条件组合，与作为中心离子的锌进行络合反应制取络合物，也获得了〔Zn〕-HarpinEcc、〔Zn〕-HarpinEa、〔Zn〕_HarpinEch、〔Zn〕_Harpinpst、〔Zn〕_Harpinpsg、〔Zn〕-Harpinpss络合蛋白的相似结果，只是最佳组合条件有些差异，但是最佳的条件仍是实施例1-6公开的内容实施例7，Harpineccs蛋白络合物的稳定性检测我们按实施例2的方法获得的〔Zn〕_HarpinEcxs蛋白络合物与未经络合处理的Harpineccs蛋白对各种极端条件的稳定性或耐受性进行了比较，结果如下在100°C条件下，HarpinEees蛋白20分钟后基本丧失活性,而〔Zn〕-HarpinEees络合 蛋白40分钟后仍有活性，60分钟后才逐渐丧失活性裸露在自然条件下，Harpineccs蛋白3天后，电泳时已经没有HarpinEcxs蛋白带,蛋白基本解体，而〔Zn〕-Harpinaxs络合蛋白5天后，电泳时〔Zn〕-HarpinEcxs络合蛋白带还清晰可见在pH14条件下,HarpinEcxs蛋白20分钟后丧失活性,而〔Zn〕-Harpineccs络合蛋白30分钟后仍有活性，60分钟后丧失活性在pHl条件下，Harpineccs蛋白10分钟后丧失活性,而〔Zn〕-Harpineccs络合蛋白20分钟后仍有活性，50分钟后丧失活性在lOOOOLux强光照条件下,Harpinaxs蛋白60分钟后丧失活性,而〔Zn〕-HarpinEcxs络合蛋白100分钟后仍有活性，200分钟后丧失活性〔对 Zn〕-Harpinecc>〔Zn〕-Harpinea>〔Zn〕-Harpinech>〔Zn〕-Harpinpst>〔Zn〕-Harpinpsg>〔Zn〕-Harpinpss络合蛋白稳定性试验中，也获得类似结果同样，对〔K〕-HarpinEccs>〔Ca〕-HarpinEccs>〔Mg〕-HarpinEccs>〔Fe〕-HarpinEccs>〔Cu〕-HarpinEccs>〔Mn〕_HarpinEcxs络合蛋白稳定性试验中，也获得类似结果实施例8，蛋白络合物的剂型设计HarpinEcxs蛋白及相关蛋白质络合物在制备、储存和应用中的可能的剂型有原药包括固体即原粉和液体即原油；储存和应用的产品剂型包括颗粒剂、可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料或杀菌剂、杀虫剂的混合制剂等另外，HarpinEcxs蛋白及相关蛋白质络合物制剂的相关辅料和助剂，包括大量食品级的可溶性营养成分及少量关键成分由于这类蛋白络合物及其制剂无毒无公害，使用时无需特殊的防护实施例9，蛋白络合物的使用方法和要求应用Harpinaxs蛋白及相关蛋白质络合物时⑴处理植物的适宜方法包括浸种、拌种、种子包衣、蘸根、叶面喷雾、注射、花果喷涂等；(2)处理植物的适宜条件包括选择适宜的用药时间和用药时的环境气象条件；可湿性粉剂或水剂应用无氯的河水、井水、地下水或自来水配成要求的使用浓度，切忌与酸、碱混合，药品应保存在阴凉干燥处；(3)处理植物的具体要求包括整个生长季节均适于用药，一般在植物长出1-5片真叶时即可开始用药，一季作物可施药1-6次，每次间隔7-15天,植物病害发生前用药效果最佳,使用时已配制好的药液建议在24小时内用完实施例10,〔Zn〕-HarpinEccs蛋白络合物的应用举例