专利名称：一株对石斛属植物软腐病有防治作用的内生真菌的制作方法兰科植物中有很多传统名贵的中药材，比如铁皮石斛和金钗石斛等。根据2005版《中国药典》的记载，金钗石斛(Dendrobium nobile LindL.)、铁皮石斛(D. candidum Wall,ex Lindl.)或马鞭石斛(D. fimbriatum Hook,var. oculatum Hook.)及其近似种的新鲜或干燥茎可以做中药石斛使用，具有益胃生津、滋阴清热的功效，还能利咽明目，调节人体免疫功能。进入21世纪以来，特别是随着石斛夜光丸、脉络宁注射液等以石斛为主要原料的中成药的相继问世，中药石斛的用量大增，野生石斛资源面临巨大的再生压力。由于生态环境日益恶化，以及对自然资源的过度开采，铁皮石斛、霍山石斛等石斛属植物中的名贵品种已濒临灭绝。人工繁育结合大面积人工栽培是一条保护石斛属植物资源，保证石斛药材市场供应的重要途径。但是，随着各种石斛属植物人工栽培面积的扩大，植物病害的发生也日趋严重，这ー现象已经引起了普遍的关注。软腐病是ー种在石斛属植物栽培中经常发生的病害，从假鳞茎处感病时，发病部位出现水溃状病斑，褐色至黒色，最終使假鳞茎变得柔软皱缩和暗色，迅速腐烂。病害严重时，软腐病可以造成栽培作物的大面积绝收，严重制约了石斛产业的发展。目前对石斛属植物软腐病的防治主要有两种方式一是通过栽培管理，如控制苗床的湿度，通风换气，水源的消毒，栽培基质的阳光暴晒处理等，能对病害的防治起到一定的作用，但这类方式费エ费时，操作技术缺乏规范，可操控性差，对病害的防治效率不高；另ー种是通过大量、频繁地使用农药，虽然短期内能产生较好的防治效果，但容易造成病原菌产生耐药性，且农药的大量使用对环境的污染和生态平衡的破坏作用很大。近年来，用生物防治的方法来预防和处理植物病害的发生、发展越来越引起人们的关注。这类方法最显著的优点是安全、环保、成本低廉，可以大量減少农药的使用。因此，研究高效安全且经济实用的石斛属植物软腐病的防治方法就显得很有必要。
本发明的目的在于提供两株对石斛属植物软腐病具有生物防治效果的内生真菌。将它们应用于石斛属植物的人工栽培，能够降低软腐病的发病率，提高石斛的产量，缓解中药石斛市场供应的紧张状況。本发明提供的2株内生真菌经鉴定分别为菌株Dhs96为根霉(Rhizopus sp.),保藏编号为CGMCC No. 3786，菌株Dfl88为木霉(Trichoderma sp.)，保藏编号为CGMCCNo. 3787。这2株真菌于2010年4月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。2株真菌的保藏和存活证明见附件。两株真菌的培养特性分别为Dhs96 :在PDA培养基上菌落为黄棕色，圆形，绒毡状，菌丝致密，背面黄褐色，有假根形成；气生菌丝较发达，25°C生长10天的菌落直径为6. 5cm ;常规培养基上不产生孢子。Dfl88 :在PDA培养基上菌落圆形，初期菌落白色，后期正面和背面均为浅黄色，菌丝较稀疏，绒毡状；气生菌丝发达，25°C生长36小时菌落直径9cm ;分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，顶端不膨大，上着生分生孢子团，含有孢子4 12个；分生孢子球形至卵形，浅色，2. 8 4. 5X2. 2 3. 9 iim。 上述两株内生真菌菌株能在石斛属植物的根部定植，对植物没有致病性，对育苗阶段及田间栽培的多种石斛属植物的软腐病有防治作用，具有良好的应用价值。实施例3Dhs96对鼓槌石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Dhs96经PDA液体发酵培养后与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子,配制成5XlOVml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种鼓槌石斛苗时，把Dhs96固体接种剂接种到鼓槌石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dhs96后的3天和30天时在鼓槌石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的鼓槌石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在鼓槌石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均 存活率达到59. 5%，阴性对照中苗的存活率为47. 3%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dhs96能提高鼓槌石斛苗的存活率。实施例4Dhs96对齿瓣石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Dhs96经PDA液体发酵培养后与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子,配制成5X 105/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种齿瓣石斛苗时，把Dhs96固体接种剂接种到齿瓣石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dhs96后的3天和30天时在齿瓣石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的齿瓣石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在齿瓣石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到69. 3%，阴性对照中苗的存活率为46. 7%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dhs96能提高齿瓣石斛苗的存活率。实施例5Dhs96对束花石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Dhs96经PDA液体发酵培养后与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子,配制成IXlOVml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合均匀制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种束花石斛苗时，把Dhs96固体接种剂接种到束花石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dhs96后的3天和30天时在束花石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的束花石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在束花石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到58. 7%，阴性对照中苗的存活率为40. 7%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dhs96能提高束花石斛苗的存活率。实施例6Dfl88对金钗石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Df 188经PDA液体发酵培养后制成I X 107/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子，配制成5 X 105/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合均匀，制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种金钗石斛苗时，把Dfl88固体接种剂接种到金钗石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dfl88后的3天和30天时在金钗石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的金钗石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在金钗石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达 到73. 3%，阴性对照中苗的存活率为56. 7%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dfl88能提高金钗石斛苗的存活率。实施例7Dfl88对铁皮石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Df 188经PDA液体发酵培养后制成5 X 106/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子，配制成I X 105/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质均匀混合，制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种铁皮石斛苗时，把Dfl88固体接种剂接种到铁皮石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dfl88后的3天和30天时在铁皮石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的铁皮石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在铁皮石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到56. 7% (46. 7%),阴性对照中苗的存活率为43. 3%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Df 188能提高铁皮石斛苗的存活率。实施例8Dfl88对鼓槌石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Df 188经PDA液体发酵培养后制成5 X 105/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子，配制成5 X 104/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质均匀混合，制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种鼓槌石斛苗时，把Dfl88固体接种剂接种到鼓槌石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dfl88后的3天和30天时在鼓槌石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的鼓槌石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在鼓槌石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到62. 3%，阴性对照中苗的存活率为47. 3%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dfl88能提高鼓槌石斛苗的存活率。实施例9Dfl88对齿瓣石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Df 188经PDA液体发酵培养后制成I X 107/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子，配制成5 X 105/ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质均匀混合，制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种齿瓣石斛苗时，把Dfl88固体接种剂接种到齿瓣石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dfl88后的3天和30天时在齿瓣石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的齿瓣石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在齿瓣石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到60. 3%，阴性对照中苗的存活率为46. 7%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dfl88能提高齿瓣石斛苗的存活率。 实施例10Dfl88对束花石斛苗软腐病的生物防治内生真菌Df 188经PDA液体发酵培养后制成5 XlOVml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质混合制成固体接种剂。石斛软腐病病原菌终极腐霉(Pythium ultimum)经活化培养后收集孢子，配制成I X 107ml的孢子悬浮液，与麦麸固体基质均匀混合，制成固体接种剂。以树皮作为栽培基质，在栽种束花石斛苗时，把Dfl88固体接种剂接种到束花石斛苗的根部。盆栽苗放入日光温室中，温度維持在20±2°C。栽种后喷水，以利于内生真菌的生长。以后每三天喷水一次。分别于接种真菌Dfl88后的3天和30天时在束花石斛苗的周围撒病原菌固体接种剂。阴性对照为只在栽种时接入麦麸固体基质的束花石斛苗；阳性对照为在栽种时接入麦麸固体基质，井分别于移栽后的3天和30天时在束花石斛苗周围撒病原菌固体接种剂。分别于接入病原菌两个月后统计苗的存活率。两种接种处理，苗的平均存活率达到53. 3%，阴性对照中苗的存活率为40. 7%，阳性对照中没有苗存活。这ー结果表明感染软腐病病原菌后，内生真菌Dfl88能提高束花石斛苗的存活率。


本发明公开了一株对兰科石斛属植物软腐病具有生物防治效果的内生真菌菌株。它能在石斛属植物根部定植，用于石斛属植物的育苗或栽培中，能够有效地防治石斛属植物软腐病的发生。