专利名称：一种用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针的制备方法脱氧核糖核酸荧光原位杂交是一种可用于肿瘤、白血病等重大疾病分子诊断的方法，该方法通过荧光素标记的脱氧核糖核酸探针与其同源互补的核酸序列的结合，检测特定的一个或几个脱氧核糖核酸在染色体上的定性，半定量和相对位置以及分布的检测技术。该检测技术融合了分子生物学的技术和病理形态学的可视效果，通过体外制备若干不同光谱的荧光标记的特定脱氧核糖核酸探针，通过断层扫描后再组合的图像技术，可检测到每一个细胞内的一个或多个基因的断裂、缺失、多拷贝以及重组等异常，该技术尤其对早期诊断和局发性病灶有着其它现有技术不可比拟、不可替代的优越性。 随着人类基因组研究的深入，越来越多的疾病相关基因得到发现，荧光原位杂交技术在各种疾病尤其是肿瘤，血液病以及遗传病诊断中的应用也越来越广泛。荧光原位杂交探针可用于研究和检测各种疾病细胞的基因组不稳定性，尤其是染色体不稳定性及数值异常(非整倍体)和结构重排等病理变化，尤其对恶性肿瘤的诊断，治疗反应监测，预后估计和微小残留病灶监测起到重要作用。荧光原位杂交技术中的一个关键性的步骤是脱氧核糖核酸探针的制备和荧光素标记。脱氧核糖核酸探针来源于克隆在不同载体中的大片段基因组脱氧核糖核酸，例如柯氏质粒，酵母人工染色体或细菌人工染色体。传统的方法是做大规模(一升到几十升)的工程菌培养，然后抽提大片段的脱氧核糖核酸克隆。由于柯氏质粒，酵母人工染色体或细菌人工染色体均属低拷贝脱氧核糖核酸质粒载体，虽然采用大规模大肠杆菌培养，但仍然得率很低，脱氧核糖核酸质量和数量在不同批次实验中差异很大，难于满足荧光原位杂交探针大规模工业化生产的要求。
发明目的为了克服上述缺陷，本发明提供一种能显著增加荧光原位杂交脱氧核糖核酸探针的产量，提高荧光素标记效率，能满足荧光原位杂交探针大规模工业化生产要求的制备方法。本发明采用的技术方案，包括以下步骤I)采用微量质粒抽提法制备脱氧核糖核酸探针模版步骤a、在培养液中接种探针菌种，摄氏35-38度培养12_16个小时后，转速在16002200转/分离心沉淀菌体；b、加入含100-300毫摩尔氢氧化钠，O. 5-1. 5%十二磺基硫酸钠的碱性溶液裂解所述的沉淀菌体；C、将裂解液加入微型层析柱，去除其他蛋白质，染色体脱氧核糖核酸，核糖核酸，盐类和其他细胞碎片等，上述沉淀菌体中的脱氧核糖核酸探针被吸入所述的层析柱内；d、将所述的脱氧核糖核酸探针洗脱并溶解于中性缓冲溶液中，得到脱氧核糖核酸探针模版；3)脱氧核糖核酸探针的体外扩增步骤a、脱氧核糖核酸探针的碱变性处理取步骤d中得到的脱氧核糖核酸探针模版体积为1-10微克，溶于体积为10-100微升的中性缓冲液中，加入体积为10-100微升100-300毫摩尔的氢氧化钠溶液、体积为1-10微升的10-20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，将该混合液在室温下作用8-12分钟后，加入体积为5-10微升2-4摩尔乙酸钠和体积为5-10微升的糖原混匀，随后，加入体积为50-500微升异丙醇，离心沉淀，去除上清，让沉淀自然干燥，得到碱变性脱氧核糖核酸探针模版；b、在酸碱性为6-8体积为100-1000微升的反应缓冲液中，加入核苷酸引物、高保真脱氧核糖核酸多聚酶、上述已经碱变性的脱氧核糖核酸探针模版、腺嘌啉脱氧核糖核苷酸，鸟嘌啉脱氧核糖核苷酸，胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，尿嘧啶脱氧核糖核苷酸，在摄氏 25-35度反应3-5小时，然后在摄氏6070度8_12分钟灭活脱氧核糖核酸多聚酶；加入体积为5-50微升2-4摩尔乙酸钠、体积为5-50微升10-20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，然后加入体积为200-2000微升无水乙醇，离心沉淀后去除上清液，沉淀用60-80%乙醇洗涤，离心3-10分钟后弃上清，将所得的脱氧核糖核酸探针沉淀溶于中性溶液中。有益的效果本发明采用微量过夜培养法，小量制备用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针模版，然后采用高保真高效率脱氧核糖核酸体外滚环扩增法制备足量荧光原位杂交脱氧核糖核酸探针，从而避免了大规模制备低拷贝脱氧核糖核酸质粒的困难。在进行荧光素标记时，我们避免使用常规的切口移位法，而采用随机引物链式酶扩增法进行荧光素标记，也显著增加了荧光原位杂交探针的荧光素标记效率。对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。I.采用微量质粒抽提法制备纳克至微克级的荧光原位杂交探针模版在3-10毫升的肉汤培养液中接种大肠杆菌菌种，摄氏35-38度培养12至16个小时。每分钟1600-2200转离心沉淀菌体。加入含100-300毫摩尔氢氧化钠，O. 5-1. 5%十二磺基硫酸钠的碱性溶液裂解所述的沉淀菌体。将裂解液加入微型层析柱，脱氧核糖核酸探针被吸入柱内，而其他蛋白质，染色体脱氧核糖核酸，核糖核酸，盐类和其他细胞碎片会被去除和洗涤干净。最后，将脱氧核糖核酸探针洗脱并溶解于中性缓冲溶液中。我们的结果显示，视克隆载体的不同，脱氧核糖核酸探针的得率在1-10微克之间。其浓度和纯度可以满足下面脱氧核糖核酸探针的体外扩增和标记之用。2、荧光原位杂交脱氧核糖核酸探针的体外高保真扩增取脱氧核糖核酸探针模版质量为1-10微克，溶于体积为10-100微升的中性缓冲液中，加入体积为10-100微升100-300毫摩尔的氢氧化钠溶液、体积为1-10微升的10-20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，将该混合液在室温下作用8-12分钟后，加入体积为5-10微升2-4摩尔乙酸钠和体积为5-10微升的糖原混匀，随后，加入体积为50-500微升异丙醇，离心沉淀，去除上清，让沉淀自然干燥，得到碱变性脱氧核糖核酸探针模版；在酸碱性为6-8体积为100-1000微升的反应缓冲液中，加入核苷酸引物、高保真脱氧核糖核酸多聚酶、上述已经碱变性的脱氧核糖核酸探针模版、腺嘌啉脱氧核糖核苷酸，鸟嘌啉脱氧核糖核苷酸，胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，尿嘧啶脱氧核糖核苷酸，在摄氏25-35度反应3-5小时，然后在摄氏60-70度8_12分钟灭活脱氧核糖核酸多聚酶；加入体积为5-50微升2-4摩尔乙酸钠、体积为5-50微升10-20毫摩尔乙二胺四乙酸溶液，然后加入体积为200-2000微升无水乙醇，离心沉淀后去除上清液，沉淀用60-80%乙醇洗涤，离心3-10分钟后弃上清，将所得的脱氧核糖核酸探针沉淀溶于中性溶液中。取2-5微升用分光光度计测定脱氧核糖核酸浓度。根据脱氧核糖核酸探针的需求量，上述脱氧核糖核酸体外扩增反应体系可成比例放大。我们的结果显示，纳克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产1-10微克级的脱氧核糖核酸探针。而微克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产10-100微克级的优质脱氧核糖核酸探针，可以很好地满足荧光原位杂交探针工业化生产的需要。 3、取质量为5-50微克上述脱氧核糖核酸探针加入100-1000微升含O. 05-0. 10摩尔三羟甲基氨基甲烷，2. 5-5毫摩尔氯化镁，O. 05-0. 10毫克/毫升牛血清白蛋白和O.01-0. 04摩尔β 二巯基乙醇的标记缓冲液。再加入荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸原料，及非荧光素标记的4种脱氧核糖核酸原料。进行35-40个循环的多娶酶链式反应，每个循环的条件是94-95度15-45秒，58-62度20-60秒，68-72度15-45秒。取5_10微升标记反应液在I. 0-2. O %浓度凝胶电泳上验证，脱氧核糖核酸长度一般在O. 5-1. 5千碱基对之间。然后在反应液中加入2. 0-3. O倍体积的无水乙醇，1/4-1/3体积的2-4摩尔乙酸钠，10-100微克重复序列脱氧核糖核酸.脱氧核糖核酸沉淀可溶于30-300微升含70%的甲酰胺的杂交缓冲液中待用。根据检测需要，上述荧光素标记反应体系可成比例放大。经过这样的标记反应可生产10-100微克级的荧光素标记的荧光原位杂交脱氧核糖核酸探针。不仅可以满足小规模实验室研究的需要，也可用于大规模荧光原位杂交探针的工业化生产。而且，我们的结果显示，用此法标记的荧光原位杂交探针比用传统的切口移位法标记的探针产量高，标记效率好。


本发明涉及用于荧光原位杂交的脱氧核糖核酸探针的制备方法，采用微量质粒抽提法制备探针模版，将脱氧核糖核酸探针作碱变性处理，再加入核苷酸引物、脱氧核糖核酸多聚酶、脱氧核糖核苷酸原料，对大片段脱氧核糖核酸探针进行体外高保真滚环扩增；本发明可以根据脱氧核糖核酸探针的需求量，对脱氧核糖核酸探针产量进行成比例放大；纳克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产1-10微克级的脱氧核糖核酸探针；而微克级的脱氧核糖核酸探针模版可生产10-100微克级的优质脱氧核糖核酸探针。