专利名称：Vla－1的单克隆封闭抗体及其在炎性病症的治疗中的应用的制作方法整合素是细胞表面蛋白复合物，它们构成一大类能介导细胞彼此间以及与它们的周围环境之间的粘附的细胞表面分子。细胞在多种发育和生理过程中需要彼此粘附并与它们的周围环境中的其它分子粘附。实例包括组织和器官的产生以及它们的完整性的维持。这些生理过程中就包括炎性病症。炎性过程中的关键步骤之一涉及细胞渗出血管，进入组织，和向感染部位移动。粘附分子在该过程中的作用常常被分割为一种三步骤模式，首先为白细胞在发炎的内皮上“滚动”，然后牢牢附着，使白细胞穿过内皮移动至发炎的组织(Hynes，R.O.，1992细胞6911-25；Springer，T.A.，1992细胞76301-314)。炎性连锁反应中的另一关键步骤，以及尚未得到深入探索的一个步骤，发生在外周组织中，在这里，浸润细胞以及固有细胞需要移动至感染部位，识别外来抗原，然后进行细胞活化以便实施它们的效应功能。为了直接评估间质粘附作用在炎症中的重要性，并与粘附作用在白细胞补充(recruitment)中的作用相区别，我们主要关注整合素家族的粘附分子和它们的片段的重要性，以及它们在炎症的动物模型，尤其关节炎模型中的作用。发明简述本发明提供了治疗受试者的炎性病症的方法。具体地，本发明提供了治疗关节炎的方法。更具体地，本发明提供了治疗受试者中炎性病症的方法，该方法包括给与所述受试者一种药用组合物，其包含有效量的α1β1功能封闭抗体或该抗体的片段，其中所述α1β1功能封闭抗体或片段能与VLA-1上包含氨基酸残基92-97，即Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg的表位结合。抗整合素抗体可选自人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段。抗整合素抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还提供治疗人或动物受试者的炎性病症的方法。以上部分所引用的所有文献，以及后文公开的引用文献，均在此引入作为参考。
图1.活化的白细胞上的胶原蛋白结合型整合素α1β1和α2β1。(A)对IL-2活化型脾细胞(第11天)上α1和α2β1整合素表达的流式细胞仪分析。细胞用抗α1mAb，抗α2mAb，或非结合型对照mAb标记(灰线)，然后用FITC-抗仓鼠免疫球蛋白标记。(B)抗α1和抗α2mAb对白细胞与胶原蛋白的粘附的影响。将105个IL-2活化的脾细胞用所述mAb处理15分钟，然后铺板至IV型或I型胶原蛋白包被孔中，37℃1小时。如实施例1所述计算粘附，表示为相对于对照mAb所处理细胞的粘附百分比。粘附试验一式3份，至少进行3个独立的实验。图中显示了一个代表实验。
图2.抗整合素mAb对迟发型超敏反应效应期的影响。SRBC致敏的小鼠腹膜内(i.p.)注射所述mAb，1小时后进行SRBC攻击。抗原攻击的20小时后测量足垫厚度，结果表示为如实施例2所述的％足垫厚度增加值±SEM。这些数据代表总共8个试验，其中n＝79(PBS)，68(对照仓鼠Ig)，68(抗-α1)，29(抗-α2)，18(抗-α1+抗-α2)，45(抗-α4)，18(抗-α5)，20(抗-α6)，和10(抗-β1)。所用mAb为Ha4/8(对照仓鼠的第二组免疫球蛋白)，Ha31/8(抗-α1)，Ha1/29(抗-α2)，PS/2(抗-α4)，5H10-27(抗-α5)，GoH3(抗-α6)，和HMβ1-1(抗-β1)。
图3.抗整合素mAb对接触性超敏反应效应期的影响。FITC致敏的小鼠腹膜内注射所述mAb，4小时后进行FITC攻击。在起点和24小时后测量耳的厚度，结果表示为如实施例3所述的％耳厚度增加值±SEM。这些数据代表总共9个试验，其中n＝74(PBS)，60(对照仓鼠Ig)，26(抗-ICAM-1)，44(抗-α1)，44(抗-α2)，38(抗-α1+抗-α2)，36(抗-α4)，16(抗-α5)，26(抗-α4+抗-α5)，24(抗-α6)，和22(抗-β1)。所用仓鼠mAb为Ha4/8(对照仓鼠的第二组免疫球蛋白)，Ha31/8(抗-α1)，Hal/29(抗-α2)，HMβ1-1(抗-β1)，3E2(抗-ICAM-1)；所用大鼠mAb为R35-95和R35-38(分别为对照大鼠IgG2a和大鼠IgG2b)，PS/2(抗-α4)，5H10-27(抗-α5)，GoH3(抗-α6)。
图4.α1缺陷型小鼠与野生型小鼠中接触性超敏反应应答的比较。FITC致敏的小鼠腹膜内注射所述mAb，4小时后进行FITC攻击。在起点和24小时后测量耳的厚度，结果表示为如实施例4所述的％耳厚度增加值±SEM。每种情况中用到4-5只小鼠，所有实验都至少实施3次。显示其中一次代表性的实验。
图5.抗α1和抗α2 mAb对巴豆油诱导的非特异性炎症的影响。小鼠腹膜内注射所述mAb，4小时后在耳部涂抹巴豆油。在起点和24小时后测量耳的厚度，结果表示为如实施例5所述的％耳厚度增加值±SEM。每种情况中用到4-5只小鼠，所有实验都至少实施3次。显示其中一次代表性的实验。
图6.抗α1和抗α2mAb对胶原蛋白mAb诱导的关节炎的影响。小鼠在第0天时腹膜内注射抗胶原蛋白mAb，第3天注射LPS。小鼠从第0天开始每3天腹膜内注射目标mAb一次。关节炎的临床症状在注射LPS后的2-3天时出现，持续数周。每隔3天，如实施例6所述分别给各肢按0-4级评分，结果表示为所有各肢在第9天至第15天之间的平均关节炎评分(±SEM)。这些数据代表4次实验的总结，其中每一实验由每种情况下的3-4只小鼠组成。
图7.给与抗α1或抗α2mAb抑制了DTH应答期间白细胞向足垫中的浸润。实验如图2所述进行。抗原攻击的20小时后，切下足垫，组织切片用苏木精和伊红染色。组织切片来自未受攻击的小鼠(A)或用SRBC攻击后的SRBC-致敏小鼠(B-H)。小鼠在接受攻击的1小时前用PBS(B)、对照仓鼠的Ig(C，G)、抗-α1(D)、抗-α2(E)或抗-α1与抗-α2mAb的组合(F，H)处理。放大倍数×100(A-F)，×400(G-H)。
图8.在DTH应答期间，α1β1在足垫中的浸润白细胞上表达。抗原攻击的20小时后，对未接受处理但已发炎的足垫中浸润的白细胞进行免疫组化染色。(A)直接用Alexa488偶联的对照mAb和抗α1mAb染色的系列切片。(B)用Alexa488偶联的抗α1mAb和藻红蛋白(PE)偶联的细胞谱系特异性mAb进行的双免疫荧光染色。所用PE偶联的mAb特异性针对粒细胞/单核细胞(抗CD11b)、中性粒细胞(抗Ly6G/Gr-1)、和T淋巴细胞(抗CD3)。放大倍数×400。
图9.抗α1和α2mAb对胶原蛋白mAb诱导型关节炎的影响。(A)小鼠用抗α1或抗α2mAb进行预防性处理降低了关节炎评分。小鼠在第0天用抗胶原蛋白mAb处理，然后在第3天用LPS处理。第6天出现关节炎并持续数周。小鼠从第0天开始每3天用目标mAb处理一次。每隔3天分别给各肢按0-4级评分。结果表示为所有各肢在第9天至第15天之间(最大评分为16)的平均关节炎评分(±SEM)。每种情况下，每组使用4只小鼠；显示了12项试验的均值。(B)α1缺陷型小鼠与抗α1mAb处理的野生型小鼠相比，关节炎评分降低。实验细节和评分如上概述。每种情况下，每组使用4只小鼠；显示了2项试验的均值。
图10.抗α1mAb处理对患有关节炎的关节的免疫病理的影响。抗α1mAb处理减少了白细胞的浸润，细胞向关节表面的粘附，和以蛋白聚糖丢失为表现的软骨损伤。正常小鼠(A-D)或接受对照仓鼠Ig(E-H)或抗α1mAb处理(I-L)的关节炎小鼠(第8天)的后肢。对所述后肢拍照(A，E，I)并切下，组织切片用苏木精/伊红(B-C，F-G，J-K)或甲苯胺蓝染色以检测蛋白聚糖(D，H，L)。放大倍数×16(B，F，J)；×160(C，G，K)；×200(D，H，L)。
图11.关节炎的进展因淋巴细胞的缺乏而延迟，抗α1mAb对关节炎的抑制作用因淋巴细胞的缺乏而发生。野生型B6，129或RAG-1-缺陷型B6，129小鼠在第0天用抗胶原蛋白mAb处理，然后在第3天用LPS处理。第6天出现关节炎并持续数周。小鼠从第0天开始每3天用目标mAb处理。每隔3天分别给各肢按0-4级评分。结果表示为每一肢的平均关节炎评分(最大评分为4)。每种情况下，每组使用4只小鼠。
图12.抗α1mAb对关节炎的抑制作用的剂量应答。野生型Balb/c小鼠在第0天用抗胶原蛋白mAb处理，然后在第3天用LPS处理。第6天出现关节炎并持续数周。小鼠从第0天开始每3天腹膜内注射目标剂量的Ha4/8(同种型对照)或Ha31/8(抗α1)mAb。每隔3天分别给各肢按0-4级评分。结果表示为每一肢的平均关节炎评分(最大评分为4)。每种情况下，每组使用4只小鼠。
图13.用抗α1mAb进行治疗性处理降低了关节炎评分。野生型Balb/c小鼠在第0天用抗胶原蛋白mAb处理，然后在第3天用LPS处理。第6天出现关节炎并持续数周。小鼠从第4天开始每3天腹膜内注射mAb(250μg)或Ig融合蛋白(200μg)。小鼠接受mAb(Ha4/8同种型对照或Ha31/8抗α1)，或Ig融合蛋白(同种型对照Ig或TNF-R55-Ig)，或二者的组合(250μgHa31/8和200μgTNF-R55-Ig)。每隔3天分别给各肢按0-4级评分。结果表示为每一肢的平均关节炎评分(最大评分为4)。每种情况下，每组使用4只小鼠。
图14.定位抗α1I结构域封闭性mAb的表位。A.大鼠(上)和人(下)的α1-I结构域的氨基酸序列。含有MIDAS(金属离子依赖性粘附位点)基元的残基用粗体表示。取代了相应大鼠残基的人类氨基酸(RΔH)表示在方框区内大鼠序列的下面。为表示清楚，文本部分的残基编号与该图一致。B.浓度不断增加的mAb AJH10(ATCC保藏号＿＿)与包被了30μg/ml人类(圆形)，大鼠(三角)或RΔH(方形)的α1-I结构域的平板结合。所示数据为三次实验的代表。
图15.人类α1-I结构域的氨基酸序列。
图16.α1-I结构域的封闭性mAb的鉴定。A.浓度不断增加的mAbAEF3(三角)或AJH10(ATCC保藏号＿＿)(圆形)与包被了30μg/mlα1-I结构域的平板结合。B.α1-I结构域用浓度不断增加的mAb AJH10(ATCC保藏号＿＿)(钻石型)或mAb BGC5(方形)处理，并结合至IV型胶原蛋白(2μg/ml)包被的平板。C.K562-α1细胞用浓度不断增加的mAb AEF3(三角)或AJH10(ATCC保藏号＿＿)(圆形)处理，并结合至IV型胶原蛋白(5μg/ml)包被的平板。每孔中所加细胞的45-50％与IV型胶原蛋白粘附。数据为三项独立实验的代表。
图17.封闭性mAb的物种交叉反应性。A.(1)绵羊血管平滑肌、(2)人类白血病K562-α1细胞或(3)纯化的RΔH GST-I结构域；(4)大鼠GST-α1I结构域；以及(5)人类GST-α1I结构域的去污剂裂解物用10-20％SDS-PAGE在非还原条件下分离，然后用功能封闭性mAb AJH10(ATCC保藏号＿＿)进行免疫印迹。分子量标志示于左侧；非还原性α1β1整合素迁移至～180kDa；GST-I结构域迁移至～45kDa。B.大鼠血管平滑肌细胞与mAb AJH10(ATCC保藏号＿＿)(下)或鼠IgG对照(上)一起保温，然后用荧光活化细胞分拣仪(FACS)进行分析。
图18.α1-I结构域与胶原蛋白结合。A.浓度增加的人类α1-I结构域与已包被了1μg/ml I型胶原蛋白(方形)或IV型胶原蛋白(圆形)的平板结合。所示值已用与BSA结合的本底校正。B.2μg/ml人类α1-I结构域与浓度增加的抗人α1整合素抗体5EgD9(方形)或抗人α2整合素抗体A2IIE10(圆形)混合，然后结合至已用1μg/ml IV型胶原蛋白包被的平板上。C.平板用1μg/mlIV型胶原蛋白或3％BSA包被。α1-I结构域(2μg/ml)随后在有1mM Mn2+，1mM Mg2+，或5mM EDTA存在的情况下，与已包被的平板结合。所示数据为三项独立实验的代表。
发明详述本发明发现，整合素抗体及其片段，尤其α1整合素亚单位，能封闭前炎性白细胞与细胞外基质成分，包括但不限于胶原蛋白、层粘连蛋白、和纤连蛋白的相互作用。虽然并非将本发明限制在任何单一的作用机制上，但已提出，整合素及其片段与外周基质之间相互作用的中断可能减少了前炎性细胞因子的表达。还提出，整合素抗体及其片段可能通过作用于抗原特异性T细胞的水平而调节炎性应答的效应期。此外，已提出整合素抗体及其片段可能通过破坏细胞在组织中的迁移和/或对组织中的细胞引发和活化产生影响而发挥作用。
这一发现阐述了整合素家族的粘附分子，尤其α1β1，在与炎症相关的情况中在组织外环境中的重要性。它还通过强调富含基质的组织外环境对免疫应答的重要性，而将整合素家族以及它们的片段在炎症中的作用扩展至白细胞粘附和在内皮界面的外渗以外，它还揭示了外周组织可作为基于粘附的治疗的一个新介入点。
本发明的方法包括对整合素抗体的使用，其中所述整合素包括下述分子，它们含有与α链(包括但不限于α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9，α10，αV，αL，αM，αX，αD，αE，αIIb)非共价结合的β链(包括但不限于β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，β8)。本发明所用各种整合素的实例包括，但不限于
α1β1，α2β1，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α7β1，α8β1，α9β1，α10β1，αVβ1，αL1，αMβ1，αXβ1，αDβ1，αIIbβ1，αEβ1；α1β2，α2β2，α3β2，α4β2，α5β2，α6β2，α7β2，α8β2，α9β2，α10β2，αVβ2，αLβ2，αMβ2，αXβ2，αDβ2，αIIbβ2，αEβ2；α1β3，α2β3，α3β3，α4β3，α5β3，α6β3，α7β3，α8β3，α9β3，α10β3，αVβ3，αLβ3，αMβ3，αXβ3，αDβ3，αIIbβ3，αEβ3；α1β4，α2β4，α3β4，α4β4，α5β4，α6β4，α7β4，α8β4，α9β4，α10β4，αVβ4，αLβ4，αMβ4，αXβ4αDβ4，αIIbβ4，αEβ4；α1β5，α2β5，α3β5，α4β5，α5β5，α6β5，α7β5，α8β5，α9β5，α10β5，αVβ5，αLβ5，αMβ5，αXβ5，αDβ5，αIIbβ5，αEβ5；α1β6，α2β6，α3β6，α4β6，α5β6，α6β6，α7β6，α8β6，α9β6，α10β6，αVβ6，αLβ6，αMβ6，αXβ6，αDβ6，αIIbβ6，αEβ6；α1β7，α2β7，α3β7，α4β7，α5β7，α6β7，α7β7，α8β7，α9β7，α10β7，αVβ7，αLβ7，αMβ7，αXβ7，αDβ7，αIIbβ7，αEβ7；α1β8，α2β8，α3β8，α4β8，α5β8，α6β8，α7β8，α8β8，α9β8，α10β8，αVβ8，αLβ8，αMβ8，αXβ8，αDβ8，αIIbβ8，αEβ8；本发明的方法还包括针对整合素片段的抗体的应用，所述片段包括如单独的β链(其包括但不限于β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，β8)，以及单独的α链(其包括但不限于α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9，α10，αV，αL，αM，αX，αD，αE，αIIb)。此外，本发明还包括针对整合素片段的抗体的应用，如针对α链的I结构域，包括但不限于α1β1(Bresewitz等，1993，生物学化学杂志2682989)；α2β1(Takada和Hemler，1989，细胞生物学杂志109397)；αLβ2(Larson等，1989，细胞生物学杂志108703)；αMβ2(Corbi等，1988，生物学化学杂志26312403)；αXβ2(Crobi等，1989，EMBO J 64023)；αDβ2(Grayson等，1988，实验医学杂志1882187)；αEβ7(Shaw等，1994，生物学化学杂志2696016)的I结构域的抗体。在一优选实施方案中，α1-I结构域抗原决定簇包含至少6个连续氨基酸的序列，其中所述连续序列可在图15的序列中找到。而且，在一优选实施方案中，该连续序列为Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg。
产生本发明所用整合素的方法为本领域技术人员已知(参见如Springer等，1990，自然346425-434)。
本发明的实施方案还包括抗整合素多克隆和单克隆抗体。本发明优选的实施方案包括一种单克隆抗体，如抗α1单克隆抗体。
本文中α1β1功能封闭抗体指与α1-I结构域，具体是图15的残基92-97结合，并阻断α1β1功能的抗体。所述阻断可通过它们抑制k562-α1依赖性粘附至IV型胶原蛋白的能力来检测(见实施例15)。
用于治疗，尤其人类治疗的优选抗体和同系物包括人类抗体同系物、人源化抗体同系物、嵌合抗体同系物、Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)抗体片段，以及抗体重链或轻链的单体或二聚体或其混合物。因此，针对整合素分子及其片段的单克隆抗体是本发明方法中的优选结合剂。
本文中术语“抗体同系物”包括由免疫球蛋白重链和轻链经二硫键连接而成的完整抗体。术语“抗体同系物”还包括含有选自下组的一或多种多肽的蛋白质，所述组包括免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链及其能结合一或多种抗原(即含α1、α2、α6或α-I结构域的整合素亚单位)的抗原结合片段。由一种以上多肽组成的抗体同系物中的多肽组分可任选经二硫键连接或经其它方式共价交联。
相应地，“抗体同系物”包括完整的IgA，IgG，IgE，IgD，IgM型免疫球蛋白(以及它们的亚型)，其中免疫球蛋白的轻链可以为κ型或λ型。
“抗体同系物”还包括完整抗体中保留了抗原结合特异性的部分，如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体、由一条重链和一条轻链组成的二聚体、等。因此，衍生自上述抗体的抗原结合片段以及全长二聚体或三聚体多肽本身均有效。
本文中“人源化抗体同系物”是通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中人类免疫球蛋白轻链或重链中非抗原结合所必需的部分或全部氨基酸被非人类哺乳动物免疫球蛋白轻链或重链的相应氨基酸取代。
本文中“嵌合抗体同系物”是通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链和/或重链的铰链区和恒定区的全部或部分已被另一种免疫球蛋白的轻链或重链的相应区取代。在另一方面，本发明的特征是一种嵌合分子变体，其包括(1)整合素靶向部分；(2)任选地，第二肽，如增加整合素靶向部分的可溶性或体内寿命的肽，如免疫球蛋白超家族成员或其片段或部分，如IgG的部分或片段，如人类IgG1重链恒定区，如CH2和CH3铰链区；以及毒素部分。嵌合分子可用于治疗对与上皮细胞如毛囊等增生相关的疾病易感的受试者，如人类。
本文中“人类抗体同系物”是通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链或重链的所有氨基酸都来自人类。
本文中“炎性病症”包括，但不限于皮肤相关疾病，如牛皮癣、湿疹、烧伤和皮炎。可用本发明方法治疗的其它炎性病症包括但不限于对哮喘、支气管炎、痛经、腱炎、滑囊炎的治疗，对疼痛和头痛的治疗，或作为退热剂用于治疗发烧。本发明的方法还可用于治疗胃肠道疾病如炎性肠疾病、Crohn’s病、胃炎、过敏性肠综合征及溃疡性结肠炎，还可用于预防结直肠癌。本发明的方法可用于治疗下述疾病中的炎症，所述病症如脉管疾病、偏头痛、结节性动脉炎、甲状腺炎、再生障碍性贫血、Hodgkin’s病、风湿热、I型糖尿病、重症肌无力、多发性硬化症、结节病、肾综合征、Behcet’s综合征、多肌炎、牙龈炎、超敏反应、结膜炎、伤后肿胀、心肌缺血等。本发明的方法还可用于治疗过敏性鼻炎、呼吸窘迫综合征、内毒素休克综合征、以及动脉粥样硬化。
在优选的实施方案中，本发明的方法可用于治疗关节炎，包括例如类风湿性关节炎和骨关节炎。
“有效量”是足以实现有利或所需临床结果的量。有效量可一次或分多次给与。就治疗炎性病症而言，抗整合素抗体的“有效量”是足以减轻、改善、稳定、逆转、减缓或延迟一种炎症相关症状的进展，并达到针对所治病症或针对美容目标的临床可接受水平的量。对效力的指标的检测可用多种现有诊断方式进行，所述方式包括但不限于生理检查如验血、肺功能检查、和X光胸透；CT扫描；支气管镜检；支气管肺泡灌洗；肺活检和CT扫描。
产生单克隆抗体，包括如抗整合素单克隆抗体的技术是已知的。如参见Mendrick等，1995，Lab.Invest.72367-375(鼠抗α1β1和抗α2β1mAb)；Sonnenberg等，1987，生物学化学杂志26210376-10383(鼠抗α6β1mAb)；Yao等，1996，细胞科学杂志1093139-50(鼠抗α7β1 mAb)；Hemler等，1984，免疫学杂志1323011-8(人α1β1 mAb)；Pischel等，1987，免疫学杂志138226-33(人α2β1 mAb)；Wayner等，1988，细胞生物学杂志1071881-91(人α3β1 mAb)；Hemler等，1987，生物学化学杂志26211478-85(人α4β1 mAb)；Wayner等，1988，细胞生物学杂志1071881-91(人α5β1 mAb)；Sonnenberg等，1987，生物学化学杂志26210376-10383(人α6β1 mAb)；A Wang等，1996，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15664-672(人α9β1 mAb)；Davies等，1989，细胞生物学杂志1091817-26(人αVβ1 mAb)；SanchezMadrid等，1982，美国国家科学院学报797489-93(人αLβ2 mAb)；Diamond等，1993，细胞生物学杂志1201031-43(人αMβ2 mAb)；Stacker等，1991，免疫学杂志146648-55(人αXβ2 mAb)；Van der Vieren等，1995，免疫(immunity)3683-90(人αDβ2 mAb)；Bennett等，1983，美国国家科学院学报802417-21(人αIIbβ3 mAb)；Hessle等，1984，分化(differentiation)2649-54(人α6β4 mAb)；Weinacker等，1994，生物学化学杂志2696940-8(人αVβ5 mAb)；Weinacker等，1994，生物学化学杂志2696940-8(人αVβ6 mAb)；Cerf-Bensussan等，1992，欧洲免疫学杂志22273-7(人αEβ7 mAb)；Nishimura等，1994，生物学化学杂志26928708-15(人αVβ8 mAb)；Bossy等，1991，EMBO J 102375-85(人α8β1多克隆抗血清)；Camper等，1998，生物学化学杂志27320383-20389(人α10β1多克隆抗血清)。
通常，将永生化细胞系(常为骨髓瘤细胞)与已用表达指定抗原如整合素的全细胞免疫的哺乳动物的淋巴细胞(常为脾细胞)融合，筛选所得杂交瘤细胞的培养上清中针对所述抗原的抗体。主要参见Kohler等，1975，自然265295-497，“能分泌具有预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养”。
免疫可用标准方法完成。单位剂量和免疫方案取决于所免疫的哺乳动物的种类、其免疫状态、该哺乳动物的体重等。通常，给免疫动物放血，用相应筛选试验分析每份血样之血清中的特定抗体。例如，抗整合素抗体可通过对整合素表达细胞的125I-标记的细胞裂解物进行免疫沉淀来鉴定。抗体，包括如抗整合素抗体，还可通过流式细胞仪鉴定，如通过测量抗体表达细胞与被认为能识别整合素分子的抗体一起保温后的荧光染色来鉴定。用于产生杂交瘤细胞的淋巴细胞通常分离自已免疫且已用这类筛选试验证实其血清含有整合素抗体的哺乳动物。
通常，所述永生化细胞系(如骨髓瘤细胞系)来自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。优选的永生化细胞系为敏感于含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT”培养基)的小鼠骨髓瘤细胞系。通常，将HAT敏感型小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞用分子量1500的聚乙二醇(PEG 1500)融合。然后用HAT培养基筛选该融合所得杂交瘤细胞，在所述培养基中，未融合和生长特性不相符的骨髓瘤细胞被杀死(未融合的脾细胞7天后由于不能转化而死亡)。能产生所需抗体的杂交瘤通过筛选杂交瘤培养上清来检测。例如，为产生抗整合素抗体而制备的杂交瘤，可通过检验杂交瘤培养上清中分泌抗体的结合重组整合素表达细胞系的能力来进行筛选。
为了产生完整免疫球蛋白形式的抗体同系物，包括如抗整合素抗体同系物，可将上述筛选中检验为阳性的杂交瘤细胞在营养培养基中于适当条件下培养足够长的时间，以使所述杂交瘤细胞将单克隆抗体分泌至培养基中。适用于杂交瘤细胞的组织培养技术和培养基是已知的。可收集经调整的杂交瘤培养上清，并可任选用已知方法进一步纯化抗整合素抗体。
或者，可通过将杂交瘤细胞注射至未免疫小鼠的腹腔中来产生所需抗体。杂交瘤细胞在腹腔中增殖，分泌抗体并积累在腹水中。可用注射器从腹腔中抽取腹水，从而收获抗体。
针对例如整合素的纯人类单克隆抗体同系物是本发明方法中另一种可阻断抗原的优选结合剂。在它们的完整形式中，它们可用体外引发的人类脾细胞制备，如Boerner等，1991，免疫学杂志14786-95，“由体外引发的人类脾细胞产生抗原特异性人类单克隆抗体”所述。
或者，它们可通过如Persson等，1991，美国国家科学院学报882432-2436，“通过对所有组成成分的克隆产生各种高亲和力人类单克隆抗体”，以及Huang和Stollar，1991，免疫学方法杂志141227-236，“不经体外刺激而从人类外周血淋巴细胞构建代表性的免疫球蛋白可变区cDNA文库”所述的对所有组成成分的克隆来制备。美国专利5，798，230(1998年8月25日，“制备人类单克隆抗体的方法及其应用”)描述了从人类B细胞制备人类单克隆抗体。根据该方法，能产生抗体的人类B细胞通过Epstein-Barr病毒或其能表达Epstein-Barr病毒核抗原2(EBNA2)的衍生物感染而永生化。EBNA2功能(是永生化所必需的)随后关闭，导致抗体产生的增加。
在另一产生纯人类抗体的方法中，美国专利5,789,650(1998年8月4日，“产生异源抗体的非人类转基因动物”)描述了能产生异源抗体的非人类转基因动物和具有灭活的内源性免疫球蛋白基因的非人类转基因动物。内源性免疫球蛋白基因通过反义多核苷酸和/或通过针对内源性免疫球蛋白的抗血清来抑制。异源抗体由该种非人类动物的基因组中通常不具有的免疫球蛋白基因编码。将含有非重排型异源人类免疫球蛋白重链序列的一或多种转基因导入非人类动物，从而产生转基因动物，该动物能功能性重排转基因免疫球蛋白序列，并产生由人类免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体的所有组成成分。这些异源人类抗体在B细胞中产生，然后B细胞通过与永生化细胞系如骨髓瘤融合而永生化，或通过用其它技术操作这些B细胞而制备一种能产生单克隆异源性纯人类抗体同系物的永生化细胞系。
另一种能在本发明方法中封闭整合素抗原或其片段的优选结合剂是能与整合素蛋白或其片段结合的人源化抗体同系物。在制备嵌合抗体的早期方法之后，EP 0239400(Winter等)描述了一种新方法，其中通过将一种抗体的互补决定区(CDR)用另一种的相应区代替而改变抗体。该方法可用于，例如将人类重链和轻链Ig可变区结构域的CDR用来自鼠的可变区结构域的另一种CDR取代。随后使这些已改变的Ig可变区与人的Ig恒定区组合，产生除取代的鼠CDR以外，完全由人的成分组成的抗体。预计这些CDR-取代型抗体相对于嵌合抗体较不易于激发人类的免疫应答，因为CDR-取代型抗体只含有很少量的非人类成分。经由CDR“移植”而产生人源化单克隆抗体的方法被称为“整形(reshaping)”(Riechmann等，1988，自然332323-327，“对人类抗体进行整形以用于治疗”；Verhoeyen等，1988，科学2391534-1536，“应用单克隆抗体中的CDR移植使人类抗体整形”)。
通常，将鼠的抗体的互补决定区(CDR)移植在人类抗体中相应区上，因为所述CDR(抗体重链上3个，轻链上3个)是小鼠抗体上的特异性抗原结合区。可通过基因工程移植CDR，其中CDR DNA序列通过克隆鼠重链和轻链可变区(V区)基因片段来测定，然后通过定点诱变转移至相应人的恒定区。在该方法的最后阶段，添加具有所需同种型的人类恒定区基因片段(通常为CH的γI型和CL的κ型)，使人源化重链和轻链基因在哺乳动物细胞中共表达，以产生可溶性人源化抗体。
向人的抗体转移这些CDR使该抗体具备了来源鼠抗体的抗原结合特性。鼠抗体上的6个CDR安装在V区的“框架区”上。CDR-移植成功的原因是，小鼠与人的抗体框架区可能具有非常相似的三维结构，且具有相似的CDR附着点，使得CDR可以互相交换。这类人源化抗体同系物可通过如Jones等，1986，自然321522-525，“用小鼠抗体的互补决定区替代人类抗体中的相应区”；Riechmann，1988，自然332323-327，“对人类抗体进行整形以用于治疗”；Queen等，1989，美国国家科学院学报8610029，“与白细胞介素2受体结合的人源化抗体”和Orlandi等，1989，美国国家科学院学报863833，“通过聚合酶链反应克隆免疫球蛋白可变区以便表达”。
尽管如此，框架区中某些氨基酸被认为可与CDR反应并影响整个抗原结合亲和力。直接从鼠抗体转移CDR来产生人源化抗体，而不对人的V区框架作任何修饰，常常导致结合亲和力的部分或完全丧失。在多个例子中，改变受体抗体的框架区中的残基对获得结合活性似乎是关键的。
Queen等，1989，美国国家科学院学报8610029-10033，“与白细胞介素2受体结合的人源化抗体”和WO90/07861(Protein Design Labs Inc.)已描述，通过使鼠mAb(抗-Tac)的CDR与人的免疫球蛋白框架区及恒定区组合可制备在受体抗体的框架区中包含修饰的残基的人源化抗体。他们已证实了不修饰人的V区框架残基而直接转移CDR常导致的亲和力丢失问题的一种解决方法；其包括两个关键步骤。第一，用计算机分析与来源鼠抗体(此例中为抗-Tac MAb)V区框架具有最佳同源性的蛋白序列，由此选择人的V框架区。第二步，利用计算机作出该鼠V区的三级结构模型，以便观察框架中最可能与鼠CDR作用的氨基酸残基，然后将这些鼠氨基酸残基重叠在人的同源框架上。他们这种利用带假定鼠接触残基之人类同源框架的方法可获得具有与来源鼠抗体相似的结合亲和力的人源化抗体，如白细胞介素2受体特异性抗体(Queen等，1989，出处同上)，以及疱疹病毒(HSV)特异性抗体(Co等，1991，美国国家科学院学报882869-2873，“用于抗病毒治疗的人源化抗体”)。
根据以上在WO 90/07861中所述的两步法，Queen等总结了设计人源化免疫球蛋白的几个关键。第一个关键是，用通常同源于将被人源化的非人类供体免疫球蛋白的特定人类免疫球蛋白的框架作为人类受体，或用来自多种人类抗体的框架作为共有框架。第二个关键是，如果人类受体的残基是不常见的，而框架中特异性残基处的供体残基是人类序列中常见的，则优选用供体氨基酸而不是受体氨基酸。第三个关键是，在紧邻CDR的位点使用供体框架的氨基酸残基而不用受体的。
也可用另一种方法(参见Tempest，1991，生物技术9266-271，“对人类单克隆抗体进行整形以抑制人类呼吸道合胞病毒的体内感染”)，和作为标准，利用分别衍生自NEWM和REI重链和轻链的V区框架在不随机导入小鼠残基的情况下进行CDR移植。利用Tempest等，1991的方法构建基于NEWM和REI的人源化抗体，其优势是，NEWM和REI可变区的三维结构已通过X线晶体成像分析得知，并因此可构建CDR与V区框架残基的特异性相互作用的模型。
本发明的处理方法对具有这些情况的人类和动物受试者均有效。可应用本发明的动物受试者包括作为宠物驯养或为商业目的驯养的动物和牲畜。实例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪和山羊。
本发明方法中，抗体(包括如抗VLA-1抗体)可通过非胃肠道途径给药。本文中“非胃肠道”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤内和颅内注射或灌注技术。
本发明的药用组合物包括本发明的任何化合物，或其可药用的衍生物，以及任何可药用的载体。本文中“载体”包括已知的可接受的佐剂和载体。
根据本发明，药用组合物可以为无菌注射制剂，如无菌可注射的水性或油性悬浮液。这种悬浮液可根据本领域已知技术利用适当分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。
本发明的药用组合物可口服。如果口服，可为口服能接受的任何剂型，包括但不限于胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液。
局部应用时，可将药用组合物配制为适当的膏剂，其中含有悬浮于或溶解于一或多种载体中的活性成分。
本发明的药用组合物还可通过气溶胶形式鼻内给药，或通过喷雾器、干粉吸入器或计量型药剂吸入器的使用而吸入给药。
本发明化合物能有效产生所需效应的剂量和用药频率取决于多种因素，如抑制剂的特性、受试者的个体大小、治疗所要达到的目标、所治疗的病理特性、所用的具体药用组合物、以及施治医生的判断。活性成分化合物每日剂量在约0.001-约100mg/kg体重时有效，优选约0.1-约50mg/kg体重/天。最优选抗体同系物以约0.1-约20mg/kg体重/天，优选约0.1-约10mg/kg体重/天的剂量每隔1-14天给药一次。在另一优选实施方案中，抗体以约0.3-1mg/kg体重腹膜内(I.P.)给药。在另一优选实施方案中，抗体以约5-12.5mg/kg体重静脉内(I.V.)给药。优选给与有效量的抗体组合物以便能提供至少1μg/ml的血浆抗体水平。
本领域技术人员可轻易检验本发明的拮抗剂是否具有所需效应。例如，可利用能检测所给试剂的第二试剂来体外(或离体)检测患者上皮样品中所含细胞是否含有所述试剂。该第二试剂可以是，例如荧光染料标记的特异性针对所给试剂的抗体，其然后可以用标准FACS(荧光活化的细胞分拣术)分析来测量。或者，可通过患者细胞不能与被标记(如被荧光染料标记)的所给试剂结合或结合能力降低来体外(或离体)检测所给试剂的存在。优选的剂量应能使绝大多数刺猬状阳性细胞产生可检测的包被。优选当使用抗体同系物时所述包被可维持1-14天。
除非另外指明，本发明的实施可利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学、和免疫学的常规技术，它们均落在本领域技术人员的范围内。这些技术文献中有述。例如，参见，分子克隆实验室手册，第二版(Sambrook，Fritsch和Maniatis编)，冷泉港实验室出版社，1989；DNA克隆，第I和II卷(D.N.Glover编)，1985；寡核苷酸合成(M.J.Gait编)，1984；美国专利4683195号(Mullis等)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编)，1984；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins编)，1984；动物细胞的培养(R.I.Freshney编)，Alan R.Liss，Inc.，1987；固相化细胞和酶，IRL出版社，1986；分子克隆实用指南(B.Perbal)，1984；酶学方法，第154和155卷(Wu等编)，学院出版社(Acedemic Press)，纽约；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(J.H.Miller和M.P.Calos编)，1987，冷泉港实验室；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Mayer和Walker编)，学院出版社，伦敦，1987；实验免疫学手册，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)，1986；小鼠胚的操作，冷泉港实验室出版社，1986。
以下实施例旨在举例说明本发明，不应理解为对本发明的限制。
实施例化学试剂异硫氰酸荧光素(FITC)购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。巴豆油购自ICN Biochemicals(Aurora，OH)。Alsevers溶液中的全羊血获自East AcresBiologicals(Southbridge，MA)。I型大鼠尾部胶原蛋白和IV型小鼠胶原蛋白分别购自Collaborative Research Inc.(Bedfbrd，MA)和Gibco(Gaithersburg，MD)。
6-8周龄的Balb/c雌性小鼠购自Taconic(Germantown，NY)，基于Balb/c背景的α1β1整合素缺陷型小鼠如前述(3)。
实施例1单克隆抗体。制备不含叠氮钠且只含少量内毒素的针对鼠抗原的功能封闭性mAbHa3 1/8(仓鼠抗-CD49a；整合素α1)(Mendrick等，1995，Lab.Invest.72367-375)，Hal/29(仓鼠抗-CD49b；整合素α2)(β1)(Mendrick等，1995，Lab.Invest.72367-375；Mendrick D.L.和D.M.Kelly，1993，Lab.Invest.69690-702)，仓鼠II组对照mAb Ha4/8(仓鼠抗-KLH)(Mendrick D.L.和D.M.Kelly，1993，Lab.Invest.69690-702)，和PS/2(大鼠抗-CD49d；整合素α4β1链)(Miyake等，1991，J.Exp.Med.173599-607)。此外，以下针对鼠抗原的功能封闭性mAb是作为无叠氮钠/低内毒素毒性制剂购自Pharmingen(SanDiego，CA)HM β1-1(仓鼠抗-CD29；整合素β1链)(Noto等，1995，Int.Immunol.7835-842)，Ha2/5(仓鼠抗-CD29；整合素β1链)(Mendrick D.L.和D.M.Kelly，1993，Lab.Invest.69690-702)，3E2(仓鼠抗-CD54，ICAM-1)(Scheynius等，1993，免疫学杂志150655-663)，5H10-27(大鼠抗-CD49e；整合素α5)(Kinashi，T.和T.A.Springer，1994，血细胞2025-44)，GoH3(大鼠抗-CD49f；整合素α6)(Sonnenberg等，1987，生物学化学杂志26210376-10383)，和大鼠同种型对照mAb R35-95(大鼠IgG2a)和R35-38(大鼠IgG2b)。
粘附试验。将Balb/c小鼠脾细胞用20ng/ml IL-2培养7-12天。细胞对I型和IV型胶原蛋白的粘附如前所述(Gotwals等，1996，临床研究杂志，972469-2477)。简短说，96孔Maxisorp板(Nunc，Napierville，IL)用10μg/mlIV型胶原蛋白或5μg/ml I型胶原蛋白包被，非特异性位点用1％BSA封闭。IL-2活化的脾细胞用2μM BCECF[2’，7’-双(羧乙基)-5(6)羧基荧光素五乙酰氧甲基酯](Molecular Probes，Eugene，OR)标记，并与10μg/ml所选mAb一起保温15分钟。然后在包被孔中加入105细胞的0.25％BSA-RPMI溶液，37℃保温60分钟。未结合的细胞通过用0.25％BSA-RPMI洗涤3次而除去。粘附用CytoFluor 23 50荧光读板仪(Millipore，Bedford，MA)定量。测定已结合的细胞与所输入细胞的总数之比，并计算相对于用对照mAb处理的细胞(设定为100％标准)的粘附百分率。减去仅用BSA包被的孔中细胞粘附的本底值。
α1β1和α2β1在活化白细胞上的表达以及功能封闭。由于白细胞在炎症中所起的关键作用，我们决定检验抗α1 mAb和抗α2 mAb是否能封闭白细胞对胶原蛋白的粘附。为了获得对α1和α2都能高水平表达的白细胞，将小鼠T细胞用IL-2体外刺激7-12天。这些细胞高水平表达α1和α2(图1A)，并与IV型和I型胶原蛋白包被的表面很好地结合(图1B)。对IV型胶原蛋白的粘附在单用抗α1 mAb时被部分抑制，单用抗α2 mAb时不受抑制。相反，对I型胶原蛋白的粘附被抗α2 mAb完全抑制，单用抗α1 mAb时仅显示部分抑制。抗β1 mAb以及抗α1和α2 mAb的组合可完全抑制对I型和IV型胶原蛋白的粘附。在证实α1β1和α2β1整合素表达于活化T细胞上，和抗α1和α2 mAb能功能性封闭白细胞对胶原蛋白的粘附之后，我们使用这些mAb来研究所述整合素在炎性病症的动物模型中的体内作用。
实施例2用抗整合素mAb抑制DTH应答。利用此前已公开的方案(Hurtrel等，1992，细胞免疫学142252-263)获得SRBC-诱导的迟发型超敏反应(DTH)应答。简短说，小鼠于第0天背部皮下(s.c.)接种2×107SRBC的100μl PBS溶液。第5天于右后足垫皮下注射1×108SRBC的25μl PBS溶液对小鼠进行攻击。抗原攻击的20小时后用工程卡尺(Mimtoyo/MTI，Paramus，NJ)测量足垫的厚度，并计算足垫肿胀的程度。结果表示为足垫厚度的平均增长百分率±SEM，计算公式是％增长＝[1-(抗原攻击的20小时后右足垫的厚度/抗原攻击的20小时后未处理的左足垫的厚度)]×100。为了阻断SRBC-诱导的DTH应答的效应期，在第5天于抗原攻击的1小时前，腹膜内(i.p.)给与用实施例1所述方法制备的治疗性mAb或对照mAb(100μg)。
SRBC-诱导的DTH是一种明确定性的炎症(尤其牛皮癣)的体内模型，其已用于证实各种细胞因子和粘附分子在炎症中的重要性(Tedder等，1995，实验医学杂志1812259-2264，Terashita等，1996，免疫学杂志1564638-4643)。SRBC-敏感型小鼠在足垫抗原攻击的1小时前接受抗整合素mAb，20小时后通过测量增加的足垫厚度来评估炎症。PBS处理的小鼠和对照仓鼠Ig处理的小鼠显示，抗原攻击的20小时后足垫厚度增加60-70％(图2)。与对照仓鼠Ig的处理相比，抗α1 mAb或抗α2 mAb分别导致对足垫厚度的68％和60％抑制。抗α1和α2 mAb的组合导致71％抑制，证实相比于单用抗α1 mAb或抗α2 mAb几乎没有加成效应。用其它抗整合素mAb进行处理也能有效抑制DTH效应应答。用各种mAb处理显示的抑制程度为49％(抗α4)，23％(抗α5)和57％(抗α6)。最后，能封闭共有β1整合素亚单位的mAb(mAb HMBI-1)使效应物DTH应答被抑制67％。
实施例3用抗整合素mAb抑制CHS效应物应答。如前述(Gaspari等，1991，在《免疫学最新方法》，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，和W.Strober编，John Wiley&Sons，纽约。4.21节)评估对FITC的接触性超敏反应(CHS)。简短说，小鼠于第0天在已去毛的背部涂抹0.5％FITC的1∶1丙酮/二丁基邻苯二甲酸酯溶液100μl，使小鼠致敏。10天后，通过在每只耳的双侧应用5μ1 0.5％FITC来攻击小鼠。于抗原攻击时(第10天)和24小时后，用工程卡尺(Mitutoyo/MTI，Paramus，NJ)测量耳的厚度以确定耳肿胀应答，结果表示为基线耳厚度的平均增长百分率±SEM，耳厚度的增加的计算公式是％增长＝[1-(抗原攻击的24小时后耳的厚度/抗原攻击时耳的厚度)]×100。为了阻断CHS应答效应期，在第10天于抗原攻击的4小时前，腹膜内给与治疗性mAb或对照mAb(250μg)。经抗原致敏且仅用载体攻击耳部的小鼠(载体对照)或耳部未经事先致敏而接受攻击的小鼠(刺激剂对照)用作阴性对照(耳部厚度的增加从未超过2％)。
由于CHS具有与DTH不同的机制并涉及不同的效应细胞，我们研究了抗整合素mAb对CHS应答效应期有何影响。在小鼠已去毛的背部应用FITC，使小鼠被半抗原致敏，10天后用FITC攻击耳部导致在第二天发生炎性应答。FITC致敏小鼠经证实在抗原攻击的24小时后厚度增加60-70％(图3)。与已公开的结果(Scheynius等，免疫学杂志，150655-663)一致，抗ICAM-1 mAb处理导致耳部肿胀被抑制51％。与对照仓鼠mAb相比，小鼠在抗原攻击的4小时前用抗α1或抗α2 mAb处理导致耳部肿胀分别被抑制37％和57％(图3)。抗α1和抗α2 mAb的组合导致对耳部肿胀的稍强抑制作用(65％)。用针对β1整合素的其它mAb进行的处理表明，虽然抗α4和抗α5 mAb与对照大鼠mAb相比，对FITC诱导的CHS效应物应答无抑制作用，但用抗α6 mAb处理导致对效应物应答的86％抑制。最后，能封闭共有β1整合素亚单位的mAb使CHS效应物应答被抑制74％。用不同小鼠品系(C57/BL6，129/Sv)和另一种致敏剂(噁唑酮)得到类似的CHS结果(数据未显示)。与在SRBC-诱导的DTH模型中所见结果相似，对发炎的耳朵的组织学分析表明，水肿形成和白细胞浸润均被抗α1和抗α2 mAb的处理抑制。
与α1β1和α2β1可在IL-2活化的脾细胞上表达的发现一致，对抗原致敏小鼠(FITC或噁唑酮)的淋巴结的分析表明，α1β1和α2β1仅在CD44hiLFA-1hi活化的CD4+和CD8+T细胞上表达(数据未显示)。用抗α1和抗α2mAb处理小鼠未导致这些细胞的删除，表现为CHS模型中应答抗原致敏的脾脏和淋巴结中活化T细胞数未受影响。此外，效应细胞未出现功能性缺失，因为抗α1和抗α2mAb对抗原致敏型小鼠的延长处理(10-16天)未能影响第20天时小鼠对抗原攻击的炎性应答(数据未显示)。
实施例4CHS效应应答在α1β1缺陷型小鼠中减少。α1β1在FITC介导型CHS之效应应答中的抑制作用可能由mAb介导，为排除这种可能性，在野生型小鼠和α1β1整合素缺陷型小鼠中进行实验(图4)。野生型小鼠中效应期的MAb抑制作用与此前的结果一致，用抗α1可导致耳部厚度被抑制56％，用抗α2为56％，用抗α1和抗α2的组合为62％。未处理的α1β1缺陷型小鼠与未处理的野生型小鼠相比，CHS效应期显著减弱(耳部厚度分别增加30％和71％)。如所预计，未处理的α1β1缺陷型小鼠耳部肿胀的水平等价于抗α1 mAb处理的野生型小鼠中的耳部肿胀水平。最后，能封闭α2β1的mAb在α1β1缺陷型小鼠中仅导致对耳部肿胀的略微增加的抑制作用，其与在接受抗α1和抗α2 mAb组合的处理的野生型小鼠中所见一致。
实施例5
DTH和CHS炎症模型中所见的抗整合素mAb的抑制效应可能由抗α1和抗α2 mAb介导的总抗炎效应所致，为进一步排除这种可能性，研究了这些mAb在刺激性皮炎中的效应。
为评估刺激性皮炎，在小鼠的每只耳朵的双侧涂抹0.8％巴豆油的丙酮溶液5μl。在应用该刺激剂的4小时之前给与治疗性抗体或对照抗体。24小时后如上述测量耳部肿胀，并与应用巴豆油之前的耳部厚度比较。结果表示为如上所述的基线耳部厚度的平均增长百分率±SEM。仅涂抹了丙酮的小鼠(载体对照)作为阴性对照。
24小时后，用巴豆油处理的小鼠当与仅接受载体(丙酮)的小鼠相比时显示耳部厚度的显著增加(48％)。用抗α1或抗α2 mAb预处理的小鼠与PBS处理鼠或对照mAb处理鼠相比，巴豆油所致毒性耳部肿胀未受显著影响(图5)。对巴豆油处理的耳的组织学检查表明，用抗α1或抗α2 mAb处理的小鼠与对照mAb处理鼠或PBS处理鼠相比，浸润细胞的数量或类型或水肿的形成没有差异(数据未显示)。
实施例6α1β1和α2β1对关节炎的抑制。由于α1β1在关节炎患者滑膜中的浸润细胞上良好表达，我们决定检查抗α1或抗α2 mAb是否在前述关节炎加速模型(Terato等，1992，免疫学杂志1482103-2108；Terato等，1995，自身免疫22137-147)中具有抑制作用。
Arthrogen-CIA抗体试剂盒购自Stratagene(La Jolla，CA)，关节炎用现有成熟技术(Terato等，1992，免疫学杂志1482103-2108；Terato等，1995，自身免疫22137-147)诱导。简短说，关节炎通过第0天腹膜内(i.p.)注射4种抗II型胶原蛋白mAb(各lmg)的混合物，然后于第3天腹膜内注射50μgLPS来诱导。在随后的3-4天中，小鼠腕关节、踝关节和趾逐渐肿胀。于第0天注射抗胶原蛋白mAb的4小时前，腹膜内给与治疗性mAb或对照mAb(250μg)，在第3天给与LPS的4小时前，再次给与相同制剂，然后在整个实验期间以3天的间隔持续给药。从第3天开始，评估小鼠的关节炎进展。对每一肢的关节炎严重程度用一个四点系统评分0＝正常；1＝轻度红肿，踝关节或腕关节的轻微肿胀；2＝踝关节或腕关节的中度肿胀；3＝包括部分趾、踝关节以及足部的严重肿胀；4＝最严重的红肿。
Balb/c小鼠中，严重的关节炎在LPS注射的72小时后出现并持续3周以上。仅注射抗胶原蛋白mAb或仅注射LPS都未诱导关节炎。接受对照mAb处理的小鼠与用PBS处理的小鼠显示相同严重程度的关节炎(图6)。相比之下，单用抗α1 mAb处理导致关节炎显著减轻(78％)并持续实验全程。单用抗α2 mAb处理也出现有利效果，导致关节炎评分比对照mAb处理鼠的评分降低32％。抗α1和抗α2 mAb的组合导致与单用抗α1 mAb所得相似程度的抑制作用。
实施例7抗α1和抗α2 mAb处理对炎性细胞浸润的效应的组织学分析。对SRBC-诱导的DTH应答的进一步组织学分析证实了抗α1和抗α2 mAb处理对所激发的炎性应答的调节能力(图7)。SRBC-致敏小鼠的未受攻击的足垫(图7A)当与同一小鼠的SRBC-攻击的足垫(图7B)相比时，未显示任何炎性细胞浸润。抗α1和抗α2 mAb分别或组合所处理的SRBC-致敏小鼠，当与对照mAb处理的小鼠相比时，在SRBC攻击的足垫中找到的这些浸润细胞的数量大大减少(图7C-F)。对浸润细胞的仔细检查表明，大多数细胞为中性粒细胞，还有部分单核细胞和淋巴细胞，还证实抗α1和抗α2 mAb处理大大减少了这些细胞的数量(图7G-H)。
实施例8对炎性细胞浸润中α1表达细胞的免疫组化测定。实施免疫组化以便更精确测定浸润细胞的特征以及它们是否表达能与胶原蛋白结合的整合素(图8)。检查未处理小鼠的发炎足垫中的浸润细胞是否表达α1β1整合素和细胞谱系标志物(图8)。发现α1β1整合素在多种浸润白细胞上表达(图8A)。用双免疫组化鉴定浸润细胞的特性以及α1β1表达的分布(图8B)。利用细胞谱系标志物发现浸润物中绝大部分为粒细胞/单核细胞(Mac-1+)，其中很多为中性粒细胞(Gr1+)，还有少数T淋巴细胞(CD3+)(图8B)。发现α1β1整合素在所有三种细胞亚型中表达，其中α1表达于Mac-1+粒细胞/单核细胞亚型，Gr1+中性粒细胞亚型，以及绝大多数浸润的CD3+T淋巴细胞上(图8B)。详细地免疫组化分析表明，尽管抗α1和抗α2 mAb处理减少了浸润细胞的数量，但浸润物的细胞组成未变(数据未显示)。用FITC抗仓鼠mAb进行的免疫组化染色证实，抗α1和抗α2 mAb能定位于发炎的足垫中(数据未显示)。
实施例9
抗α1β1 mAb和抗α1β2 mAb对关节炎的抑制以及在α1缺陷型小鼠中对关节炎的抑制。由于α1β1在关节炎患者滑膜中的浸润细胞上良好表达，我们决定检查抗α1或抗α2 mAb是否在前述关节炎加速模型(Terato等，1992，免疫学杂志1482103-2108；Terato等，1995，自身免疫22137-147)中具有抑制作用。该模型涉及给小鼠注射抗II型胶原蛋白mAb的混合物，然后给与LPS，导致随后3-7天中关节炎的进展。小鼠从第0天每隔3天给与mAb，并以3天的间隔评估关节炎进展。严重的关节炎在LPS注射的72小时后在所有小鼠中出现并持续3周以上。仅注射抗胶原蛋白mAb或仅注射LPS都未诱导关节炎。接受对照mAb处理的小鼠与用PBS处理的小鼠显示相同严重程度的关节炎(图9A)。相比之下，单用抗α1 mAb处理导致关节炎显著减轻(79％或更高)并持续实验全程。单用抗α2 mAb处理也出现有利效果，导致关节炎评分比对照mAb处理鼠的评分降低37％。抗α1和抗α2 mAb的组合导致与单用抗α1 mAb所得相似程度的抑制作用。所有小鼠用抗α1 mAb处理都导致关节炎评分的下降，比用其它数种基于mAb的关节炎处理效果好，所述其它mAb如可溶性TNF受体Ig融合蛋白(Mori等，1996，免疫学杂志，1573178-3182)、抗-Mac-1(Taylor等，1996，免疫学88315-321)、抗α4(Seiffge，1996，风湿病学杂志(J.Rheumatol.)232086-2091)、和抗-ICAM-1(Kakimoto等，1992，细胞免疫学142326-337)(图9A)。与显示α1β1在关节炎中重要性的基于mAb的数据一致，未处理的α1缺陷型小鼠当与野生型小鼠比较时显示关节炎评分的显著降低(图9B)。
实施例10抗α1 mAb处理对患关节炎之关节的免疫学的影响。接受对照mAb或抗α1 mAb处理的野生型关节炎小鼠(第8天)的关节与正常未处理小鼠的关节经目测比较并进行组织学比较(图10)。根据目测结果，对照mAb处理鼠显示整个足部包括脚趾红肿，而抗α1 mAb处理鼠即使在任一关节或脚趾有任何炎症，其症状也很轻微。组织学检查显示，对照mAb处理的关节炎关节有重大改变，滑膜下(subsynovial)组织有炎性细胞的广泛浸润，关节表面有细胞粘附，并有以蛋白聚糖损失为表现的显著软骨破坏(图10)。与此前的报道(Terato等，1992，免疫学杂志1482103-2108；Terato等，1995，自身免疫22137-147)一致，该模型中的绝大多数浸润细胞为中性粒细胞。小鼠经抗α1 mAb处理大大减少了炎性浸润物的量以及软骨破坏的程度(图10)。
实施例11关节炎的发生因缺乏淋巴细胞而被延迟，抗α1 mAb对关节炎的抑制在缺乏淋巴细胞的情况下发生。为测定哪种细胞类型可能在胶原蛋白mAb诱导型关节炎模型中很重要，我们比较了野生型B6-129小鼠和RAG-1-缺陷型B6-129小鼠发生关节炎的能力(图11)。RAG-1(重组活化基因-1)基因的遗传缺失导致成熟T和B淋巴细胞的完全丢失(Mombaerts等，1992，细胞68869-877)。野生型小鼠和RAG-1-缺陷型小鼠均发生关节炎，但在RAG-1-缺陷型小鼠中诱导动力学显著减慢(图11)。这些结果提示，尽管淋巴细胞与这种关节炎模型相关，但它们并非该疾病的发生和进展所必需。已公开的关于检查RAG-1-缺陷型小鼠在其它关节炎模型中的效应的报道也发现，T和B淋巴细胞的丢失推迟了关节炎的发生(Plows等，1999，免疫学杂志1621018-1023)。用抗α1 mAb处理野生型小鼠或RAG-1-缺陷型小鼠彻底抑制了关节炎(图11)。这些结果证实，抗α1 mAb在该模型中的效应并不依赖于淋巴细胞的存在，而且正如此前的实验(图9)所提示，抗α1 mAb在预防疾病方面的效应可能是通过它对表达α1的其它细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞的作用而实现。
实施例12抗α1 mAb对关节炎的剂量依赖性抑制。由于抗α1 mAb处理在预防关节炎方面的惊人效果，我们进一步将研究深入至剂量应答分析(图12)。从第0天开始每3天腹膜内给与不同剂量的mAb。与较早的数据一致，250μg抗α1 mAb导致几乎完全阻止关节炎。低至100μg的抗α1 mAb在抑制该模型的关节炎方面仅部分有效，更低的剂量对关节炎评分无任何可辨别的影响(图12)。
实施例13用抗α1 mAb治疗可降低关节炎评分。由于抗α1 mAb在预防关节炎中的效应，我们尝试对正在发展疾病的小鼠进行治疗。通过在第0天给小鼠注射抗II型胶原蛋白mAb的混合物，然后在第3天给与LPS而诱导关节炎。然后用抗α1 mAb或可溶性TNF受体Ig融合蛋白从第4天开始治疗小鼠。在于第4天开始接受抗α1 mAb的小鼠体内，当与自第4天开始接受对照仓鼠mAb的小鼠相比时，关节炎的进展被彻底阻断(图13)。抗α1 mAb治疗性给药所见抑制程度很彻底，且与抗α1 mAb预防性给药(自第0天始)所见水平相同(图13)。相比之下，自第4天开始的TNF受体Ig融合蛋白的治疗与对照Ig融合蛋白相比仅导致对关节炎评分的60-70％抑制(图13)。抗α1 mAb和TNF受体Ig融合蛋白的联合处理能彻底抑制关节炎评分，由于抗α1 mAb单独处理对关节炎的彻底抑制效应，这并不奇怪。总之，这些结果表明，抗α1 mAb的治疗性处理可有效抑制关节炎评分，比TNF拮抗剂的治疗性处理效果好。
实施例14α1-I结构域的克隆和诱变。从全长cDNA(Kern等(1994)生物学化学杂志269，22811-22816；Ignatius等(1990)细胞生物学杂志111，709-720)经聚合酶链反应(PCR)(PCR CORE试剂盒；Boehringer Mannheim公司，德国)扩增人和大鼠α1β1整合素结构域I的序列，所用人特异性引物为5’-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3’[正向]；5’-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3’[反向]，大鼠特异性引物为5’-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3’[正向]；5’-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3’[反向]。将所得PCR扩增产物纯化，连接至pGEX4t-i(Pharmacia)，转化至感受态DH5α细胞(Life Technologies)中。筛选氨苄青霉素抗性菌落中～45kDa谷胱甘肽S-转移酶-结构域I融合蛋白的表达。选出用于进一步鉴定的克隆的质粒DNA中插入子的序列通过DNA测序证实。
制备大鼠/人嵌合α1-I结构域(RΔH)(MORPH诱变试剂盒；5引物-3引物)，将大鼠的残基G92、R93、Q94和L97(图14)分别替换为人的相应残基V、Q、R、和R。携有RΔH结构域I的克隆通过诊断性Stu 1限制酶位点的丢失而鉴定，插入子通过DNA测序证实。人的α1-I结构域的氨基酸序列示于图15。
实施例15α1-I结构域特异性mAb的产生。已证实单克隆抗体在研究整合素亚单位的结构和功能关系时是非常有效的探针。例如，mAb已广泛用于研究β1亚单位中与活化构象相关的区域(Qu，A.和Leahy，D.J.(1996)结构4，931-942)。因此，为鉴定可用于α1-I结构域构象变化的潜在探针，我们制备了针对人的α1-I结构域的一组mAb。
抗α1-I结构域单克隆抗体的产生。雌性Robertsonian小鼠(Jackson Labs)用经完全弗氏佐剂(Life Technologies)乳化的25μg纯化人型α1β1腹膜内免疫(Edwards等(1995)生物学化学杂志270，12635-12640)。经腹膜内给与以不完全弗氏佐剂(Life Technologies)乳化的25μgα1β1而加强免疫3次。显示了最高抗α1-I结构域滴度的小鼠在融合前腹膜内给与100μgα1β1而加强免疫一次，并在融合的前一天静脉给与50μg α1β1。使脾细胞与FL653骨髓瘤细胞以1∶6的比例融合，并以100,000和33,000/孔铺板于96孔组织培养板中。
通过单色FACS评估上清结合α1β1整合素的能力。在FACS分析之前，使上清与未转染的K562细胞一起保温以便去除仅与β亚单位结合的IgG。随后，将悬浮于FACS缓冲液(1％胎牛血清(FCS)的PBS，含0.5％NaN3)中的、用α1整合素亚单位转染的3-5×104K562细胞(K562-α1)与上清一起于4℃保温45分钟，洗涤后，与偶联至藻红蛋白的抗小鼠IgG一起保温。细胞用FACS缓冲液洗涤两次后，在Becton Dickinson流式细胞仪上分析。
筛选所得杂交瘤上清结合α1-I结构域的能力。简短说，96孔板(Nunc)每孔加入30μg/ml人型α1-I结构域-GST融合蛋白的PBS溶液50μl，4℃包被过夜。平板用PBS洗涤，用1％BSA-PBS封闭，将杂交瘤上清与结构域I室温保温1小时。用含0.03％吐温20的PBS充分洗涤后，加入碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)反应1小时。末次洗涤后，加入lmg/m1对硝基苯磷酸(ρNPP)在0.1M甘氨酸、1mM ZnCl2、和1mMMgCl2中的溶液室温静置30分钟，然后读取平板的O.D.405。
检测所选上清在抑制K562-α1依赖性对IV型胶原蛋白的粘附中的能力。将K562-α1细胞用含0.25％BSA的DMEM中的2mM 2’，7’-(双-2-羧乙基-5和6)羧基荧光素五乙酰氧甲基酯(BCECF；Molecular Probers)37℃标记30分钟。已标记的细胞用结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4；0.9％NaCl；和2％葡萄糖)洗涤，再重悬于添加了5mM MgCl2的结合缓冲液中，终浓度为1×106个细胞/ml。将50μl上清与等体积的2×105K562-α1细胞在96孔板的各孔中一起保温。然后将平板离心，除去上清。将细胞重悬于结合缓冲液中，转移至胶原蛋白包被板的孔中，37℃保温1小时。保温后，通过用结合缓冲液洗3次而除去未粘附的细胞。粘附的细胞在Cytofluor(Millipore)上分析。
我们最初鉴定了19个杂交瘤，它们的上清可与表达α1β1整合素的人类白血病K562细胞(K562-α1)结合并与α1-I结构域结合。分别从这些杂交瘤纯化免疫球蛋白，并检验它们封闭K562-α1或α1-I结构域与IV型胶原蛋白结合的能力。这些mAb可分为两类能封闭α1β1功能的和不能封闭α1β1功能的。例如，克隆AEF3、BGC5和AJH10产生的mAb与α1-I结构域结合(图16A，BGC5的数据未显示)，但仅有AJH10可抑制α1-I结构域依赖性IV型胶原蛋白粘附(图16B)或K562-α1对IV型胶原蛋白的粘附(图16C)。
对互补决定区的测序。为确立该组mAb的克隆起源，我们通过PCR扩增了12-19种抗体的CDR并进行了测序(数据未显示)。
将分离自107个杂交瘤(FastTrack mRNA分离试剂盒，Invitrogen)的2μgmRNA用以下引物各25pM进行逆转录(Ready-To-Go You Prime First StrandKit，Pharmacia Biotech)重链VH1FOR-2(Michishita等(1993)细胞72，857-867)；轻链，VK4FOR，其限定4种不同寡聚物(Kem等(1994)生物学化学杂志269，22811-22816)。对每种杂交瘤而言，重链和轻链在分别4次PCR反应中用以下寡聚物的各种组合来扩增1)重链VH1FR1K(Kamata等(1995)生物学化学杂志270，12531-12535)、VH1BACK、VH1BACK(Baldwin等(1998)结构6，923-935)、VHfrla、VHfrlb、VHfrle、VHfrlf、VHfrlg(Ignatius等(1990)细胞生物学杂志111，709-720)、或VH1FOR-2(Michishita，M.，Videm，V.，和Arnaout，M.A.(1993)细胞72，857-867)；2)轻链VK1BACK(Baldwin等(1998)结构6，923-935)、VK4FOR、VK2BACK寡聚物(Kern等(1994)生物学化学杂志269，22811-22816)、或VKfrla、VHfrc、VHfrle、VHfrlf(Ignatius等(1990)细胞生物学杂志111，709-720)。对产物进行扩增(95℃5分钟，然后以94℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟进行50轮，最后72℃10分钟)，凝胶纯化(QIAquick，Qiagen)，然后直接用所列各种寡聚物在ABI377测序仪上测序。
产生功能封闭性mAb的克隆的序列在所有互补决定区(CDR)和间隔框架区中几乎都相同，表明这些杂交瘤是克隆相关的。
实施例16免疫印迹和FACS分析。非封闭性抗体的可变区序列显著不同于封闭抗体中发现的克隆相关家族的序列。由于封闭抗体似乎起源于一个克隆，我们选择一个(AJH10)进行进一步鉴定。
免疫印迹。切自绵羊主动脉的平滑肌细胞层，以及K562-α1细胞用在50mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，20μg/ml抑蛋白酶肽，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)中的1％Triton-X100提取。样品在4-20％梯度胶上进行SDS-PAGE，然后电转移至硝酸纤维素膜上。印迹用TBS中的5％干奶粉封闭；用含0.03％吐温20的TBS洗涤，然后与抗体在含0.05％NaN3的封闭缓冲液中保温2小时。然后如前述洗涤印迹膜，使之与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG一起保温1小时，再次洗涤，然后用ECL试剂(Amersham)处理。再使印迹膜于胶片(Kodak)上曝光30-60秒，然后显色。
免疫印迹(图17A)和FACS分析(图17B)证实，AJH10与人、家兔和绵羊的α1β1整合素反应，但不与大鼠的α1β1整合素反应，提示封闭性mAb与进化保守的线性表位结合。非封闭性mAb在免疫印迹中无反应，也不与除人类以外的其它物种反应。
实施例17α1-I结构域对胶原蛋白的结合为二价阴离子依赖型A.α1-I结构域的纯化α1-I结构域在大肠杆菌中表达为GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白，其在序列连接处含有凝血酶切割位点。细胞在PBS中裂解后，将澄清的上清上样至已用PBS充分洗涤过的谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱(Pharmacia)。α1-I结构域-GST融合蛋白用50mM Tris-HCl，pH 8.0，5mM谷胱甘肽(还原型)洗脱。在变性研究中，结构域I用50mM Tris，pH 7.5中的凝血酶裂解，并从GST融合配对物上纯化出来。添加DTT至2mM，将样品上样至谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱。将流通级分和洗涤级分汇总，上样至Q Sepharose FF柱(Pharmacia)。α1-I结构域用50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM 2-巯基乙醇，75mM NaCl洗脱。纯化的结构域I通过电喷射电离质谱分析(ESI-MS)来展示其预定质量(Lee等(1995)结构3，1333-1340，871 Da)，其在SDS-PAGE上作为一条带迁移，该蛋白在Superose 6 FPLC柱(Pharmacia)上的大小排阻层析中以相应大小的单个峰形式洗脱。
B.功能分析96孔板用1μg/ml IV型胶原蛋白(Sigma)或I型胶原蛋白(CollaborativeBiomedica)4℃包被过夜，用Triton缓冲液(0.1％Triton X-100；1mM MnCl2；25mM Tris-HCl；150mM NaCl)洗柱，用25mM Tris-HCl；150mM NaCl(TBS)中的3％牛