专利名称：抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂的制备方法 自从Kohler和Milstein报告用杂交瘤技术研制鼠单克隆抗体(mMcAb)成功以来，杂交瘤技术在世界范围内得到广泛应用。杂交瘤技术已成为生物高技术的基本方法之一。人们已研制出种类繁多的mMcAb，得到了广泛的应用，形成了巨大的高技术产业。mMcAb用作人体内的治疗制剂，由于是异种蛋白，可引起严重的不良反应，所以受到很大限制。因此，自上世纪80年代以来，人单克隆抗体(hMcAb)的研究受到医学生物界的高度重视，认为hMcAb能够加强和改善对传染病的治疗，而人血清免疫球蛋白作为一种治疗模式，历史上的迫切性强烈赞成发挥hMcAb的潜力。由于hMcAb的研究难度大，发展相对缓慢，但hMcAb可用于人体内对癌症的诊断、治疗和预防，特别是各种传染因子所致的各种传染病。所以，自上世纪80年代以来，hMcAb的研究日趋高涨，至上世纪90年代初在世界范围内已获得一大批不同种类的hMcAb，特别是在恶性肿瘤的诊治和传染病的治疗和预防方面最为突出。1991年，欧洲经济共同体颁布了关于“hMcAb的生产与质量管理指南”的文件，为生产hMcAb及质量控制提供了依据，文件强调人体内使用hMcAb诊断，治疗和预防疾病有重大价值。国内自上世纪80年代中期以来，陆续有几家研制hMcAb成功，如中国医科院顾方舟的脊髓灰质炎病毒的hMcAb，第四军医大学崔运昌的抗流行性出血热病毒的hMcAb，北京病毒研究所陈伯权的抗乙型脑炎病毒的hMcAb等把我国hMcAb的研究更向前推进了一步。当前国际上研制在技术上的发展主要表现在DNA重组技术研制“人源性抗体”，国内也开展了这方面的研究，但基因工程法研制“人源性”的单克隆抗体(McAb)，在技术上尚不完善，研制出来的抗体活性和亲和性上还存在一定的问题，同时，无论是工程菌还是工程细胞对抗体的表达上都不太理想。“基因工程抗体活性低及表达能力差是当前国内基因工程人源性单克隆抗体研究中的两大瓶颈”，离广泛的研制人源性单克隆抗体实际应用尚需相当时间。从上世纪80年代中期国外就有抗乙肝病毒人单克隆抗体(抗HBV hMcAb)研究的报告。抗HBV hMcAb的研究之所以重要，是因为它在乙型肝炎的防、治和诊断方面具有巨大的应用潜力。众所周知，乙型肝炎(HB)是世界上，特别是东亚、东南亚、南亚及中东一带广泛传播流行的疾病，仅中国而言，带病毒者约1.3亿，HB患者约3000万。HB发病时间长，有慢性化倾向，有相当大的部分患者转为慢性肝炎、肝硬化，甚至转为肝癌，对人类的健康危害极大。有的患者不仅丧失大部分劳动能力，还要化巨资治疗，加上不良的预后，其精神压力也是不可忽视的。如果有一种制剂能使HB的治疗率增加30％，传染率降低30％，其巨大的社会效益和经济效益就是难以估量的。目前治疗HB的药物不少，市场出售的HB药物繁多，但对HB的疗效远未达到理想的要求，对HB的防治仍存在相当大的困难。虽有HB疫苗的使用，但HB仍未有减少的趋势，更何况有8-20％的人对HB疫苗反应很差或无反应，即使广泛使用HB疫苗仍控制不住HB的继续发生，更何况世界尚上有大量HB患者，疫苗对他们无能为力。目前，在HB的治疗药物中，效果比较好的，国内外医药界所公认的，也是研究的深入透彻的HB治疗药物就是干扰素(IFN)，它通过干扰病毒的核酸代谢清除病毒，还可通过调节机体的免疫机能，提高机体的抗病毒能力。但IFN是一种非特异性药物，在干扰病毒的同时，对人体的正常细胞也有干扰作用。因此，长期大量应用IFN对人体产生不利影响。
本发明的目的是提供一种将抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体与干扰素相交联形成靶向干扰素制剂的制备方法。本发明的目的是这样实现的该方法包括以下步骤(1)、分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体异种杂交瘤工程细胞系的构建取以外科手术摘除的抗乙肝表面抗原抗体(抗-HBs)阳性，术前一周肌注乙肝疫苗的人脾皮质组织，从脾组织匀浆分离出脾淋巴细胞(SL)与鼠浆细胞瘤细胞系P3-X63/Ag8-653细胞融合，获得异种杂交瘤细胞，融合后将融合细胞加入96孔板进行培养，融合成功，有部分或全部培养孔就会有细胞克隆生长，杂交瘤细胞不断增殖，到融合后12-14天，用ELISA检测抗体阳性孔(抗-HBs阳性孔)，将细胞生长好，抗体滴度高的孔中的细胞进行克隆，采用有限稀释法进行克隆，每孔1个细胞的克隆可反复进行3-4次，达到培养板100％的抗体阳性孔，此时已单克隆化，并已稳定，如果培养一段时间不够稳定，可再反复克隆几次，就可获得稳产高产的分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞系。
(2)、抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的制备a、用裸鼠生产抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体(抗HBV hMcAb)将分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞接种在用降植烷处理的裸鼠腹腔，每鼠接种的杂交瘤细胞数为5×106，经15天饲养后，收集含抗HBV hMcAb的腹水，用EILSA测定腹水效价，效价在1×106以上时从中可分离出大量抗HBV hMcAb，收集腹水，将腹水低温离心，收集上清，用AnSO4沉淀上清中的蛋白、将AnSO4沉淀物低温离心去上清，将沉淀物溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析平衡，将平衡好的AnSO4沉淀物经凝胶柱层析、经PBS洗脱，收集洗脱液、浓缩、过滤，获得抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体。
b、用细胞培养法生产抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体用无血清培养基在生物反应器中对分泌抗HBV hMcAb的杂交瘤细胞进行大量培养，经过一个培养周期(4天)，培养上清经分离纯化，获得纯度98％的抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体。
(3)、将所获得的抗乙肝病毒人单克隆抗体用戊二醛作为交联剂与α-干扰素相交联①、取抗HBV hMcAb与α-IFN充分混合后装入透析袋中，经磷酸盐缓冲液(PB)透析平衡，在室温下边搅拌边滴加5％的戊二醛进行交联，三种物质加入量的分子数比为抗HBV hMcAb∶α-IFN∶戊二醛＝1∶1∶1；
②、将交联物装入透析袋，4℃下对生理盐水透析；③、从透析袋中取出交联物用生理盐水稀释，膜滤除菌；④、交联物加入注射液辅加剂按常规生物制品注射液加工工艺制成注射液冻干制剂保存，即为抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂。
本发明的优点是本发明将抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体以戊二醛作为交联剂与α-干扰素相交联，制备成“抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂”。该制剂提高了乙型肝炎的治愈率，疗效为α-干扰素的189％，与目前乙肝治疗药物α-干扰素相比，该制剂的剂量仅为α-干扰素的三分之一，价格是单纯使用α-干扰素的50％。


图1是本发明异种杂交瘤细胞融合工艺流程图。
图2是本发明靶向制剂的制备工艺流程图。

实施例一、分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤工程细胞系的构建1、各种细胞的准备1)抗-HBs阳性人脾淋巴细胞(SL)的制备脾供者，拟外科手术摘除脾的中年男性，有慢性乙肝病史，经血化验抗HBs阳性，术前一周肌注乙肝疫苗。手术取出脾时，立即无菌取脾皮质组织，将脾组织匀浆分离出脾细胞，用无血清培基(RG)离心洗涤2次，再用RG悬浮SL，以台盼兰排斥法计数活细胞，取所需数量备用。
2)鼠浆细胞瘤细胞系P3-X63/AG8-653的制备取生长旺盛的P3-X63/AGS-653细胞，接种RGS(完全培养基)培养基中，浓度4×104/ml的情况下，培养4天，在细胞浓度可达1×106//ml以上，活力达98％，按需要量准备瘤细胞。
3)饲养细胞的制备将BALB/C小鼠拉颈处死，用70％酒精浸泡3分钟，在腹中部剪一横向切口，将皮肤向两侧拉开，尽量露出腹壁。向腹腔内注入5mlRG，按摩腹部1分钟，再将原液抽回。抽出液每ml约含腹腔细胞100万以上，按需制备小鼠腹腔细胞，用台盼兰排斥法计数。
2、细胞融合设置的有关参数SL653＝1×108∶5×107
融合剂PEGMW＝4000PEG配置浓度C＝50％一次融合用量＝0.7ml培养板6块96孔培养板，每孔0.2ml培基每孔融合后的细胞数以SL为准，1.66×105/孔饲养细胞BALB/C小鼠腹腔细胞，4×104/孔融合后当日就用含20％胎牛血清选择培基(HAT)培养。
3、细胞融合按附图1“异种杂交瘤细胞融合工艺流程”所示工艺流程进行细胞融合。将抗HBs阳性人脾淋巴细胞(SL)与鼠浆细胞瘤细胞系P3-X63/AG8-653的细胞进行细胞融合，从96孔板杂交瘤生长阳性孔，检出抗-HBs阳性孔。经对抗体阳性孔杂交瘤细胞克隆，获得稳产高产的异种杂交瘤细胞系。
4、抗体阳性孔杂交瘤细胞的克隆融合后将融合细胞加入96孔板进行培养，如果融合成功，有部分或全部培养孔就会有细胞克隆生长，杂交瘤细胞不断增殖，到融合后12-14天生长阳性孔细胞可达1-2×104/孔，此时可用ELISA检测该孔上清中有无抗-HBs。检出抗体阳性孔，将细胞生长好，抗体滴度高的孔中的细胞进行克隆。
采用有限稀释法进行克隆，克隆时，第一次克隆平均每孔10个细胞，2次克隆每孔5个细胞，3次克隆每孔2个细胞，4次克隆每孔1个细胞。每孔1个细胞的克隆可反复进行3-4次，达到培养板100％的抗体阳性孔，此时已单克隆化，并已稳定。如果培养一段时间不够稳定，可再反复克隆几次，就可获得稳产高产的分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞系。
5、经对异种杂交瘤细胞进行系统鉴定，证明所获得的异种杂交瘤细胞系均分泌IgM(μ)类hMcAb，与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有亲和性和特异性。具体表现在(1)、在抗-HBs方面a、经ELISA检定，异种杂交瘤细胞均分泌IgM类hMcAb，与人μ链相匹配的是人“λ”轻链，即μ(λ)；b、异种杂交瘤细胞分泌的hMcAb对HBsAg有特异性；
c、与其他乙肝标志及其他一些病毒无交叉反应。
(2)、核型分析异种杂交瘤细胞系细胞含有两物种的染色体，即有鼠染色体(多数，端着丝点)，也有人染色体(少数，中间着丝点)。说明异种细胞杂交产生的杂交细胞是为异核型细胞。它产生的是结构完整的人IgM单体分子，所以它的染色体含有人的14，22和X染色体。
(3)、对异种杂交瘤细胞的生长与抗体分泌的动力学检测异种杂交瘤细胞的生长与抗体的分泌有正相关性。
(4)、异种杂交瘤细胞生长的稳定性要好，细胞的生长力强，传代稳定，在传代接种浓度4×104/ml，连续培养4天，细胞数可达到1×106/ml以上。
(5)、杂交瘤产生的抗体稳定性连续传代培养，间断地测定其培养上清抗体ELISA OD值，连续观察3～5月以上，杂交瘤产抗体应是稳定的。
(6)、杂交瘤细胞的遗传稳定性对异种杂交瘤细胞进行克隆时，抗体阳性克隆100％。应保持在三个月以上。
(7)、培养上清抗HBV hMcAb的ELISA效价在1.5×212以上。
二、抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体(抗HBV hMcAb)的制备将获得的异种杂交瘤细胞系，通过裸鼠或细胞培养的方法生产抗HBVhMcAb，两种抗体的制备方法如下1、用裸鼠生产抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体(1)、将分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞接种于用降植烷处理的裸鼠腹腔，每鼠接种杂交瘤细胞数为5×106。产生含抗HBVhMcAb的腹水，所得到的腹水抗-HBs hMcAb ELISA效价测定，效价达1×106以上。
(2)、从腹水中分离纯化抗HBV hMcAb材料①、含抗HBV hMcAb的腹水；②、Protein A-Sepharose Cl-4B干品；提纯①、将腹水6000Rpm低温离心20分钟，去油去渣，收上清；②、用40％饱和度的AnSO4沉淀上清中的蛋白，4℃过夜；③、将AnSO4沉淀物6000Rpm低温离心30分钟，去上清；④、将沉淀物的蛋白溶于0.1M PH 8.3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，装入透析袋，对0.1M PH 8.3的PBS透析平衡24小时(中间换液3次，1000mlPBS/次)；⑤、凝胶溶胀将凝胶Protein A-Sepharose Cl-4B，室温平衡后加入0.1M PH7.4的PBS中溶胀过夜；⑥、将溶胀好的凝胶装入一直径1.5cm，高7cm的层析柱，用0.1M PH8.3的PBS平衡柱子；⑦、上样将平衡好的AnSO4沉淀物上柱，用紫外检测仪检测洗脱液的吸收值(OD280)；⑧、用0.1M PH4.0的PBS洗脱，1个洗脱峰，将峰值洗脱液调PH至7.4；⑨、收集洗脱峰洗脱液抗体，浓缩到一定体积，使抗体浓度达到5.2mg/ml以上；⑩、将抗体经0.22μm膜滤过，分装无菌瓶中，-30℃保存。
(3)、电泳鉴定于10％SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上进行非还原电泳，于12％SDS-PAGE上进行还原电泳，结果表明纯化蛋白分子量为180KD，纯度98％以上，该纯化蛋白与HBsAg有强特异反应。
2、细胞培养法生产抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体用无血清培养基在生物反应器中对分泌抗HBV hMcAb的杂交瘤细胞进行大量培养，经过一个培养周期(4天)，培养上清经分离纯化，获得纯度98％的抗HBV hMcAb。
三、乙型肝炎病毒人单克隆抗体与α-干扰素交联制备“抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂”的制备方法1、抗HBVhMcAb与α-IFN的交联(1)、用戊二醛作为抗HBV hMcAb与α-IFN的交联剂。
(2)、在交联中有关参数的计算和运用a、人单体IgM的分子数的计算1个单体IgM的分子质量1.8×105×1673.559453×10-27＝3012.407015×10-22克；1μg人单体IgM的分子数＝1×10-6克/(3012.407015×10-22克)＝3.32×1012；b、α-IFN分子数的计算α-IFN的近似分子量2×104；α-IFN的分子量人单体IgM的分子量＝1∶9；因知1IgM的分子数＝9×3.32×1012＝3.0×1013；c、戊二醛分子数的计算戊二醛分子量100；戊二醛分子量IFN的分子量＝1∶200；因知1μg戊二醛的分子数＝200×2.0×1013＝6×1015；d、在交联液系统中，人单体IgM∶α-IFN∶戊二醛，三种成分的分子数比为1∶1∶1。
10mgIFN(活性比108μ/mg)分子数3.00×1017；100mg人单体IgM子数3.32×1017；50μg戊二醛的分子数3.00×1017。
2、结果按上述交联方案所得交联率25-30％，交联后抗体和α-IFN活性无明显改变。交联后液体的外表特征微显黄绿色，澄清透明，微显乳光。按生物制品常规注射液工艺和质量要求制成注射液或冻干制剂，成品无毒、无菌、无热源。冻干品用生理盐水溶解良好，无浑浊，无沉淀。成品保存在4℃下2年，各种效价无改变。


本发明建立了抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂的制备方法。本发明将抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体以戊二醛作为交联剂与α－干扰素相交联，制备成“抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂”。该制剂提高了乙型肝炎的治愈率，疗效为α－干扰素的189％，与目前乙肝治疗药物α－干扰素相比，该制剂的剂量仅为α－干扰素的三分之一，价格是单纯使用α－干扰素的50％。