一种用于诊断和治疗乙型肝炎的短肽及其应用的制作方法[0002]慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒OfepatitisBvirus，HBV)引起的、世界范围流行的重大疾病，目前全球约4亿人感染HBV。慢性乙型肝炎可随病程发展，恶化为肝硬化和原发性肝癌，引起患者死亡。虽然有报道称，已有多种抗HBV药物(如干扰素及核苷类似物)可以有效抑制病毒复制、抑制病情恶化或治愈慢性乙肝，但是由于HBV具有多种基因型和血清型，以上药物在整体治疗效果及治愈率上无法令人满意。治愈慢性乙型肝炎急需新型抗HBV药物及策略。[0003]多肽疫苗作为 一种新型生物技术疫苗，已经在多个人类疾病领域进行深入的研究。目前在慢性乙型肝炎领域，通过噬菌体展示技术筛选得到许多可以与HBV颗粒或主要抗原相结合的多肽，但其抗病毒效果欠佳。现有的HBV结合肽，大多源自噬菌体展示技术，长度约10-20个氨基酸残基，它们虽然可以结合HBV颗粒，但在细胞水平上对病毒复制增殖的影响很小。[0004]此外，由于HBV基因组结构的特殊性，通过基因重组技术标记HBV仍存在很多困难，这在很大程度上限制了 HBV感染机制的研究进展。修饰与标记的多肽系列结合HBV颗粒后，间接地标记病毒，对HBV感染机制研究具有实际的应用价值。
[0005]本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足，提供一种能结合乙型肝炎病毒(HBV)颗粒、并抑制病毒复制增殖的短肽。本发明短肽与HBV颗粒具有高度结合能力，显著地抑制了 HBV在肝细胞中的复制增殖。而且，该短肽进行多种修饰(C端酰胺化、醛基化、醇基化几N端糖基化、烷基化)和标记(N端生物素、FITC、罗丹明标记)后，不但保留了结合HBV颗粒的能力，还起到了间接标记病毒的作用，例如，该短肽经与7个精氨酸和绿色荧光标记(FITC)线性串联后形成的修饰与标记系列。[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:[0007]一种用于治疗乙型肝炎的短肽T4，其氨基酸序列为:丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸。
[0008]T4可通过本领域常规方法合成。
[0009]本发明中:
[0010]HepG2细胞:人肝癌细胞系，不能产生HBV ；HepG2.2.15细胞:与!fepG2细胞同源，可自行产生HBV颗粒；细胞穿透肽R7:为线性、连续的7个精氨酸(R)，可以携带其他多肽高效地穿透细胞膜，并且对细胞没有损伤；异硫氰酸荧光素(FITC):在分子生物学研究中常用的一种绿色荧光标记物。[0011]本发明的优点是:短肽T4与现已报道的其他HBV结合肽均不一样，其特点在于:结构更加简单、序列更加短小，仅为线性的4个氨基酸残基；可与HBV颗粒高亲和地结合；T4经标记与修饰(与7个精氨酸和绿色荧光标记形成线性串联系列)后，不仅在细胞水平上表现出抗病毒效果，而且对HBV具有标记作用。这与已知的其他HBV结合肽均不相同，在新型抗乙肝多肽药物开发和HBV感染机制研究中具有重要意义。



[0012]图1是多肽混合物T20与HBV颗粒的结合能力图，
[0013]图2是T20各组分与HBV颗粒的结合能力图，
[0014]图3是修饰的短肽T4导入H印G2细胞和H印G2.2.15细胞图，
[0015]图4是加入不同浓度修饰的短肽的病毒产量的变化图，
[0016]图5是IOmM修饰的短肽对病毒产量的抑制作用图，
[0017]图6是25mM修饰的短肽对病毒产量的抑制作用图。

[0018]实施例1:
[0019]1、合成多肽混合物T20 (由上海吉尔生化有限公司合成)，并通过ELISA方法进行验证；
[0020]①多肽混合物T20按照40 μ g/ml的浓度包被ELISA反应板，每孔包被100 μ I，4°C孵育过夜，以未包被多肽孔为空白对照，以不含HBV颗粒的H印G2细胞上清液为阴性对照，以含有HBV颗粒的H印G2.2.15上清液(HBV颗粒含量为I X 107UI/ml)为检测组，各组均设置3个重复孔弃去包被液，0.05% (v/v)PBST缓冲液洗板2次，每次5分钟；@弃去洗板液，每孔加入5% (m/v)BSA溶液，4°C封闭I小时；@弃去封闭液，0.05% (v/v)PBST缓冲液洗板3次，每次5分钟；⑤弃去洗板液，空白组各孔加入100 μ 10.05% (v/v)PBST缓冲液，阴性对照组各孔加入100 μ lHepG2细胞上清液，检测组各孔加入100 μ lHepG2.2.15上清液(含有I X IO6UI的HBV颗粒)，在37°C、缓慢震摇的条件下孵育I小时；⑥各孔均加入75 μ I辣根过氧化物酶标记的抗HBV表面抗原单克隆抗体(上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法))，在37°C、缓慢震摇的条件下孵育I小时弃去孵育液，0.05% (v/v)PBST缓冲液洗板6次，每次5分钟；弃去洗板液，各孔加入100 μ I单组份TMB显色液，37°C静置15分钟；⑧每孔加入50 μ 12Μ硫酸终止反应后，在酶标仪读取0D450nm的数值；⑨当检测组(P)数值大于阴性对照组(N)时，证明多肽可与HBV颗粒结合，数值越高结合能力越强，参见图1。
[0021]2、由I结果证明，多肽混合物T20中含有可与HBV颗粒结合的成分，参见图2.[0022]3、合成多肽混合物T20中可能存在的10种成分，参照I中ELISA方法进行检测，确定短肽T4(由上海吉尔生化有限公司合成)为可与HBV颗粒结合的多肽。
[0023] 4、通过细胞穿透肽R7 (含FITC绿色荧光标记)修饰和标记短肽Τ4，并分别导入HepG2细胞和H印G2.2.15细胞(可自主产生乙型肝炎病毒)。以无短肽培养液为细胞对照组，细胞内绿色荧光所示为短肽进入细胞，参见图3。
[0024]设置两个短肽T4浓度组(IOmM和25mM)，每天给细胞更换含有不同浓度短肽T4的新鲜培养液，并以无短肽细胞培养液为细胞对照组，FITC-R7修饰肽为无关肽对照组；
[0025]5、应用I中ELISA方法统一检测加入不同浓度短肽后I至7天，!fepG2.2.15细胞病毒产量的变化并进行统计分析，参见图4。
[0026]其中25mM的FITC-R7-T4组对病毒产量的抑制作用要优于IOmM组，具体结果参见图5和图6。
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