专利名称：基于重组修饰的安卡拉痘苗(mva)病毒的通用流感疫苗的制作方法基于重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒的通用流感疫苗发明领域本发明涉及新的通用流感疫苗以及包含它的新剂型。具体来说，本发明涉及重组修饰的安卡拉(Ankara)痘苗(MVA)病毒，其包含并能够表达流感病毒、特别是H5N1禽流感病毒的外来基因的新组合 ，优选是在单一表达盒中。流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae),并分成甲、乙、丙三种类型。甲型流感病毒能够感染禽类以及哺乳动物，而乙型和丙型流感病毒只能感染人类。它们是带包膜病毒，具有由8段单股负链RNA节段构成的分节段基因组。水禽是甲型流感病毒的天然储库(Webster等，1992)。已知这些病毒跨过物种屏障，并在哺乳动物包括人类中引起短暂感染或建立起永久谱系(Ludwig等，1995)。20世纪最具破坏性的流感病毒，S卩1918年的西班牙流感大流行(HlNl)、1957年的亚洲流感大流行(H2N2)和1968年的香港流感大流行(H3N2)，都是禽类来源的(Lipatov等，2004)。引起通常所说的“禽流感”的H5N1亚型高致病性禽流感病毒，是在家禽中高度传染性和致死的病原体。从2003年后期起，H5N1在家禽中已达到动物流行病水平，并席卷几乎半个世界。然而，到目前为止，它向人类群体的传播还是有限的。1997年在香港报道了人类中H5N1感染的第一个病例(Claas等，1998 ；Subbarao等，1998)。在目前为止报告的几乎所有病例中，证据显示是鸟类到人类的传播，尽管有一份来自泰国的报告显示了直接的人类到人类传播(Ungchusak等,2005)。流感大流行由“抗原性转变”引起，其是指在HA/NA或这两个基因中的重大变化导致形成了目前未在人类中流行的新的甲型流感病毒亚型。负责结合宿主细胞受体的主要病毒蛋白红细胞凝集素(HA)的变化，是H5N1病毒为了在人类中建立感染而必须发生改变的关键蛋白之一(Gambaryan 等,2006 ;Stevens 等,2006 ;Yamada 等,2006)。随后，用于病毒高效复制的病毒聚合酶复合物中的蛋白必须发生突变，以便感染能够维持(Almond，1977 ；Subbarao 等，1993 ;Hatta等，2001 ;Maines 等，2005 ；Li Z 等,2005 ;Subbarao 等，1998 ；Katz等，2000)。如果H5N1病毒与在人类中的复制潜力相关的受体特异性发生改变或发生与已经流行的人类流感病毒的重配，那么不能排除永久性人类谱系的建立。由于新的流感大流行的隐约风险，利用资源进行大流行前的准备是有意义的。这包括开发有效疫苗的尝试。目前的流感疫苗通过肠胃外途径或通过鼻内途径使用。肠胃外流感疫苗自从1940年代引入含有来自于受感染的含胚卵的灭活病毒材料的灭活流感疫苗以来，感染的风险和过程以及在老年人中的死亡率已经降低。存在三类灭活疫苗全病毒、裂解(使用醚或三丁基磷酸酯化学破坏)和亚单位(纯化的表面糖蛋白)灭活疫苗。这些疫苗可以肌肉内或皮下给药。由于副作用水平高，全病毒灭活流感疫苗目前已不使用。季节性流感疫苗(裂解和亚单位)是三价的，包含H3N2、HlNl甲型流感病毒和乙型流感病毒各一株。在过去几年中，由于抗原性漂移，每年必须改变至少一种组分。BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和 FLUSHIELD 产品是裂解疫苗。FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和 INFLUVAC 产品是亚单位疫苗。灭活的流感疫苗预防发病和死亡的有效性为60%至100%，但是在青年人和老年人中观察到的有效率较低。2003年6月，FDA批准了由Medimmune Inc.开发的冷适应性减毒流感病毒活疫苗Flumist 在年龄为5-17岁的健康儿童和青少年以及年龄为18-49岁的健康成年人中用于季节性流感。 最近的研究报道了使用反向遗传工程生产带有修饰基因以减弱毒力的疫苗株(Subbarao 等，2003)。鼻内流感疫苗:以前，M. L. Clements等在1986年已报道分泌型IgA和血清IgG两者都参与对流感病毒的免疫性。此外，在小鼠中，大量已发表的研究证实了呼吸系统IgA对于抵御流感病毒感染的重要性。还已发现，刺激对流感病毒的局部IgA应答的优点在于它通常比血清应答具有更广的特异性，因此能够提供针对具有与疫苗中存在的红细胞凝集素分子不同的病毒的交叉保护性。因此，引发局部IgA和血清抗红细胞凝集素应答两者的流感疫苗，将提供比当前疫苗更优越的免疫性。然而，如果先前没有黏膜暴露(例如感染)，则肠胃外疫苗接种(肌肉内、皮下等)对于引发局部IgA生产来说效率不高。为了刺激黏膜免疫系统，疫苗必须局部施加到黏膜表面。流感疫苗的黏膜给药与传统的肠胃外免疫接种方案相比具有许多优点。其中最重要的是更有效刺激呼吸道的局部黏膜免疫系统，以及由于减少与注射相关的恐惧和不适而使疫苗摄入率增加的可能性。因此，已经进行了大量开发黏膜流感疫苗的尝试。然而，缺点在于灭活的疫苗在黏膜给药时经常免疫原性不良。为了克服这个问题，正在评估不同的方法以提高通过口服或鼻内给药的流感疫苗的免疫原性。一些这样的尝试包括使用霍乱毒素的B亚单位(CTB)作为佐剂、将疫苗囊化在各种微球中以及使用减毒的流感病毒活毒株。用于季节性流感的可商购鼻内疫苗于2003年9月在美国上市。MedImmune的FluMist是减毒活疫苗，其通过鼻喷剂给药于年龄在5至49岁之间的患者。这种疫苗没被批准用于“有风险”人群。用于该疫苗的病毒也在鸡胚卵上生长，并且是通过鼻喷剂递送的减毒活制剂。除了每年能够制造的药剂量的限制之外，该疫苗未被批准用于最需要防御流感的青年和老年群体。有许多用于鼻内给药的其他候选疫苗目前正在进行临床评估。然而，这些现有技术的参考文献都丝毫没有提示本发明的抗原组合和方法。GlaxoSmithKlinePharmaceuticals的专利No. EP1214054B1具体涉及非活性裂解鼻内流感疫苗。SanofiPasteur正与Avant Immunotherapeutics合作，使用他们的Micromer递送系统开发鼻内流感疫苗。Micromer是利用聚磷腈的水基聚合物，用于疫苗的微囊化和黏膜递送。目前它正处于临床前阶段。Symbigene Inc.的专利No. W02003063785宣称了一种有潜力治疗流感的基于重组酵母的疫苗。该疫苗可以通过口或鼻内给药。该疫苗的临床前研究正在美国进行。Acambis已中止了正在评估用于流感预防的鼻内疫苗的开发。该疫苗掺有灭活流感病毒抗原和壳聚糖。Biovector Therapeutics使用其Biovector递送技术开发对抗流感病毒的鼻内黏膜疫苗的项目已被中止。BioSante Pharmaceuticals正在开发非注射的鼻内疫苗，其包含来自流感病毒H5N1毒株的抗原与BioSante的基于磷酸钙纳米粒子的疫苗佐剂的组合，用于H5N1流感病毒感染的治疗。NanoBio Corporation正在开发一种用于流感的黏膜疫苗NB006。NB006的临床前研究正在进行，并且在2007年第一季度提交了 IND。I期试验已在2007年第四季度开始。Archimedes Pharma(以前的West PharmaceuticalServices Inc.)的专利No. US7323183涉及使用了该公司专有的ChiSys鼻递送技术的流感病毒定向疫苗。在英国(West, 2004年3月)进行的I期评估已经完成。Green HillsBiotechnology (GHB)的PCT申请W02009007244涉及FluVacc，一种活的减毒的复制缺陷型流感病毒疫苗。该疫苗缺少致病性因子NS1，在Veix)细胞中生产，并使用喷雾装置鼻内给药。FluVacc的I期试验已在奥地利启动。ID Biomedical Corp.正开发一种有治疗流感潜力的鼻内疫苗FluINsure (专利号US6743900)。该疫苗是基于ID Biomedical专有的疫苗递送/佐剂技术蛋白体(Proteosome)与包括红细胞凝集素的流感病毒蛋白的纯化制备物的组合。I期研究已在加拿大开始，以研究其鼻蛋白体流感疫苗在人类中的安全性和免疫原性。NasVax Ltd.正在开发用于流感预防的疫苗，其利用了它专有的聚阳离子脂类技术CCS。CCS起到佐剂的作用，并且也允许疫苗的鼻内给药。在140位健康志愿者中进行的I/II期试验已经在以色列完成，并且公司计划提交申请，寻求批准在2007年中在欧洲开始III期试验。BioDiem Ltd.正在开发用于季节性流感病毒感染的鼻内递送的单剂、冷适应性、减毒的流感病毒活疫苗。该疫苗是基于由圣彼得堡(St. Petersberg)(俄罗斯)的实验医学研究所(Institute of Experimental Medicine)从1993年起已在俄罗斯和CIS销售 的疫苗。该疫苗的临床前评估正在欧洲和美国进行。开发H5N1疫苗的尝试:Medimmune Inc.正在开发冷适应性H5N1疫苗。MedImmune使用诸如反向遗传学和经典重配的方法，将具有大流行可能性的红细胞凝集素基因放置在减毒的人类流感病毒中。MedImmune Inc.的研究团队通过将源自于毒性H5N1流感病毒的修饰蛋白与来自于使用反向遗传学人工弱化(减毒)的流感毒株的蛋白相组合，产生了三种候选疫苗。毒性H5N1病毒从1997和2003年香港以及2004年越南(A/Vietnam/1203/04)的人类病例中分离。减毒的流感病毒株，其也用作Medlmmune’s FluMist 流感疫苗的基础，在实验室中在逐渐变冷的温度下生长(“冷适应性”)，以防止产生的疫苗病毒扩散到相对凉的上呼吸道之夕卜。在鸡卵中生长了大量得到的冷适应性病毒。在2006年6月，MedImmune启动了 I期人类志愿者研究，以评估减毒的H5N1活疫苗的安全性和免疫原性。研究的结果还不能得到。(www. medicalnewstoday. com/articles/51701, php)USFDA批准的由Sanofi Pasteur在2007年4月推出的H5N1疫苗是一种灭活疫苗，并打算仅用于紧急情况下(www.fda.gov/bbs/topics/NEWS)。Sanofi Pasteur所使用的重配候选疫苗毒株NIBRG-14从使用反向遗传学开发该毒株的英国国家生物标准品研究所(National Institute for Biological Standard, UK)获得。Sinovac Biotech Ltd.(中国)目前正在使用从英国国家生物标准品研究所获得的重配候选疫苗毒株NIBRG-14开发灭活的 H5N1 疫苗(www. medicalnewstoday. com/articles/51392. php)。病毒在卵中生长，并在灭活后与佐剂一起给药。该疫苗正在进行II期临床试验(www. bio-medicine.org/medicine-technology-1) o 意大利的 Chiron Vaccines/Novartis vaccines 正在使用Vietnam 2004毒株开发基于卵的添加MF59佐剂的灭活疫苗。Chiron Corporation将使用与用于其已上市的流感疫苗Fluvirin相同的生产方法生产疫苗。该疫苗的II期临床试验在 2006 年结束。(www. ifpma. org/Inf luenza/content/pdf s/TabIe_Avian_Pandemic_Influen za_RnD_170ct06.pdf)。DelSite Biotechnologies Inc.正在使用其专有的GelVac递送系统开发针对H5N1病毒株的灭活的鼻粉末疫苗。GelVac鼻粉末疫苗递送系统是基于该公司的一种新型多糖、即GelSite聚合物技术，其在与鼻液接触后从粉末转变成凝胶，引起疫苗抗原的受控释放和增加的鼻停留时间。DelSite Biotechnologies Inc与Invitrogen Corporation的F1D-Direct服务合伙开发能够使基于细胞的H5N1全病毒粒子抗原用于鼻递送的方法° (www. biospace, com/news story, aspx NewsEntityId = 34335)现有疫苗的局限性:灭活/裂解/冷适应性疫苗存在许多局限性一最主要的局限性是候选毒株必须根据当时的流行毒株每年改变。此外，鉴定到的毒株必须适应于在含胚卵中生长至高滴度。后者的使用引起某些挑战，例如高质量的无特定病原体卵的全年供应的可行性。这种卵的使用是必须的，因为卵中外源因子的存在可能危害流感病毒疫苗的制备。在鸟类中流行流 感的情况下，用于培养流感病毒的无特定病原体的卵的供应将变得稀少。这将影响用于人类灾祸的疫苗的可获得性。此外，在大量人群中发生由于卵蛋白引起的超敏反应。通过福尔马林灭活病毒也引起抗原性表位的变性，从而可能降低效能。此外，由于引发局部IgA和细胞毒性T细胞应答的能力有限，这些疫苗的效能不是最优的。因此，传统的裂解/亚单位疫苗的保护效果非常有限。备选的流感疫苗在减少目前制造的流感疫苗的缺点的尝试中，目前正在开发几种生产疫苗的备选方法。基于细胞培养物的疫苗:使用基于细胞培养物的系统可能是正在进行的领域中研究得最深入的。正在试验的两种主要细胞系是 MDCK (Palache 等，1999)和 Vero (Halperin 等，2002 和 Nicolson,2005)。Baxter International Inc.在2007年开始了它的H5N1 (A/Vietnam/1203/04)灭活全细胞疫苗的III期临床试验。它正在使用其专有的用于培养病毒的Vero细胞技术(www.medicalnewstoday. com/articles/66602, php)。在这些细胞中生长的用于疫苗中的病毒的灭活程序，与用于卵生产的病毒的程序相同。因此，该病毒仍然用有可能损伤抗原上的表位的化学物质灭活。尽管使用细胞培养物的方法避免了使用含胚卵，但是存在新的法规障碍(清除外源因子)，以及由于方法相似而引起的传统生产的卵疫苗的局限性。重组疫苗:已经在小鼠激惹模型中评估了编码流感病毒的HA和NP基因的DNA疫苗(Williams 等，2002 ；KembIe 和 Greenberg, 2003)。用编码 NP 基因的 DNA 接种引起了针对异源流感病毒株激惹的防御作用(Montgomery等，1993)。在小鼠中，在用编码HA的DNA接种后，实现了针对同源病毒激惹的防御作用。用DNA接种诱导的抗体应答在小鼠中产生长存的滴度(Ulmer等，1993)。美国专利4，357，421公开了合成的流感病毒红细胞凝集素基因的生产，所述基因是给定的特定流感病毒vRNA的双链互补DNA(cDNA)拷贝，并且其能够插入到工程化改造过的细菌质粒中，以确保被插入DNA的完整翻译和起到流感疫苗作用的多肽的表达。DNA疫苗显然不依赖于卵或哺乳动物细胞培养物。然而，大多数研究只在小鼠中表现出令人鼓舞的结果(Montgomery等，1993 ；Ulmer等，1993 ;和Williams等,2002)。很难发现在较大型动物中有希望的结果的报道。在小鼠中作用良好的M2-NP DNA，在猪模型中激惹后使疾病恶化(Heinen等，2002)。尽管DNA疫苗用于流感的可能性存在，但仍然有安全性问题，这对于这种接种方法一直成问题。基于DNA的疫苗的一些实例如下所述 VGX已开发了 VGX-3400，一种基于DNA的通用流感疫苗，其靶向可变流感病毒HA基因[111、112、113和册(禽)]以及NA和M2e-NP基因的保守区。所有构建物使用SynCon 技术制造。临床前评估已经在宾夕法尼亚大学(美国)开始，并在2008年5月提交了 IND申请。 转让给Vical的专利W02005116270公开了含有H5N1禽流感病毒A/Vietnam/1203/04的红细胞凝集素基因和不那么易于突变的基因——核蛋白、NP和基质蛋白、或M2e基因的DNA疫苗。它使用Vicals的VAXFECTIN技术配制。在2007年8月，Vical在美国的健康志愿者中开始了疫苗的I期试验。该专利没有建议在基因构建物中使用PB2基因。 Novartis正在使用其专有的药物递送技术开发用于预防流感的基于基因的疫苗(该技术以前由Powderject开发。它具有气体驱动的装置，用于将包被有遗传物质的粒子加速到靶中，专利US5865796)。该疫苗将利用编码可变和保守基因抗原的多载体策略。这目前正在临床前阶段。 转让给Pfizer的专利W02005035771涵盖了提供异源编码序列在哺乳动物宿主细胞中的增强表达的核酸构建物(载体)(以前由PowderMed开发)。Pfizer正在开发基于DNA的疫苗PF 4522625，用于预防季节性流感病毒感染。该疫苗包含克隆在PowderMed(现在为Pfizer)的疫苗载体PPJV1671中的来自于A/Panama/2007/99流感毒株的HA基因，并被设计成使用PowderMed(现在为Pfizer)专有的无针式粒子介导的表皮递送系统来给药。I期评估正在进行中。局限性在于疫苗只含HA基因。 转让给Dynavax Tech Corp的专利US7479285公开了一种通用流感疫苗。它涉及通过一种抗原与免疫刺激性多核苷酸的联合给药来调节针对另一种抗原的免疫应答的 方法。该疫苗将免疫刺激性DNA序列(ISS)与关键的流感病毒抗原核蛋白(NP)相连，该抗原在不同年份的病毒株中变化很小。NP-ISS与基质蛋白2的细胞外结构域M2e相连。正在美国进行临床前研究。 转让给Lipoxen的W02004004758公开了使用该公司专有的脂质体技术ImuXen产生的流感疫苗，该技术将质粒DNA与其相关蛋白一起掺入到脂质体中。流感疫苗脂质体含有表达流感病毒蛋白的DNA加上共同配制在同一粒子中的抗原的蛋白形式。该制剂能够递送多种疫苗毒株，其中每个脂质体起到单价疫苗的作用。临床前评估正在英国进行。作为许多常规疫苗的解决方案，已经提出了重组亚单位蛋白疫苗。重组蛋白生产允许所有疫苗组分的严格质量控制以及批次间变异的更直接定量。这种技术基础也已被研究用于流感疫苗。利用了基于大肠杆菌(E. coli)、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达系统。因为消除了对生长病毒的需要，开发流感的重组亚单位蛋白疫苗是有吸引力的选项。大量研究报道了关于在动物模型中对重组亚单位蛋白疫苗候选物的测试，但仅有少数已经在人类临床试验中测试。两个主要问题阻碍了基于重组蛋白的流感疫苗的开发。许多时候，蛋白以其天然形式表达往往是困难的，并且表达水平也低。例如，流感疫苗的主要组分HA已被证明是难以作为重组体表达的蛋白。已报道了在毕赤酵母中表达无膜锚定的HA分子(Saelens等，1999)。尽管根据抗体结合判断表达的HA蛋白具有适合的结构，并且在小鼠中产生部分保护作用，但产品在性质上不完全均一。由于可变的加工导致N-端是可变的，并且糖基化样式也是非均质的。尽管声明毕赤酵母表达的HA蛋白具有作为疫苗候选物的潜力，但没有表示这种尝试已在人类中进行测试。还已调查了杆状病毒表达系统作为用于生产重组流感病毒蛋白疫苗的系统。关于使用杆状病毒表达系统表达全长HA的早期报道产生了定位于昆虫细胞表面上的HA (Kuroda等，1986)。其它研究报道了从杆状病毒表达系统表达可溶性HA (Valandschoot等，1996)。关于杆状病毒表达的可溶性HA的这种报道确定了尽管蛋白具有一些类似天然的性质，但是它大部分是聚集的 。因此它在小鼠模型中不能提供任何保护作用。由ProteinSciences Corporation开发的杆状病毒表达的重组HA蛋白(PSC Meriden,美国专利US6224882)，代表了到目前为止最先进的重组流感病毒蛋白疫苗(Flubloc)。由PSC表达的HA代表全长分子，并导致HA蛋白在昆虫宿主细胞上的定位。所述HA在从膜提取后通过一系列步骤进行纯化。基于这种方法学的H5-HA疫苗已在人类临床试验中进行评估(Treanor等，2001)。重组H5疫苗在高剂量下具有有限的免疫原性。这项研究的结果表明杆状病毒表达的H5HA能够在以前未暴露于H5病毒的个体中诱导功能性抗体，但是需要进一步研究以提高疫苗的免疫原性。还已经调查了流感抗原的基于病毒的递送。转让给匹兹堡大学(University ofPittsburg)的PCT申请W02006063101提供了基于E1/E3缺失的5-血清型腺病毒的载体，其表达来自于A/Vietnam/1203/2004流感病毒的密码子优化的HA基因。它目前处于临床前阶段。然而，该构建物只含HA基因。另一种被广泛评估的病毒表达载体是痘苗病毒。W02008061939(Paul Ehrlich)公开了使用MVA、更具体是来自于H5N1毒株的MVA来制备流感疫苗。该发明涉及优选包含H5N1禽流感病毒A/Vietnam/1194/04株的HA、NA、M1、M2和NP基因的流感疫苗。权利要求涉及A/Vietnam/1203/04。在一个优选实施方案中，DelIII处的MVA中的异源基因序列可以是HA、NA、NP、Ml、M2的任何组合。Pll启动子是在该发明中使用的优选启动子之一。然而，该申请没有公开在所述构建物中使用流感病毒聚合酶基因，也没有具体公开克隆在MVA的DelIII位点中的所有基因。用于流感疫苗的其他备选方法包括 已经报道了在杆状病毒表达系统中产生的病毒样粒子(VLP) (Latham和Galzara, 2001)。Novavax目前正在奉行这种方法。转让给Novavax的专利US20070184526涵盖了包含流感病毒M1、HA和NA蛋白的VLP以及它们的制剂。Novavax开发了针对H5N1A/Indonesia/05/2005病毒的基于VLP的疫苗，已完成的I//IIa期人类临床试验显示出有利的结果。 转让给 Vaxinnate 的专利 W02006/069262 宣称了来自 A/Vietnam/1203/04 的M2e与作为TLR5 (Toll样受体5)的配体的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)鞭毛蛋白(fljB)之间的融合蛋白。临床前研究正在美国进行。然而，使用TLR激动剂作为疫苗佐剂，至少在产生T细胞应答方面是令人失望的。 转让给Antigen Express的专利US7179645公开了表达特异性流感病毒HA(H5N1)抗原以及增强抗原呈递的杂合多肽。该疫苗可用于引发针对重组H5红细胞凝集素蛋白的T辅助细胞应答，或者可用作独立疫苗。它目前正处于临床前阶段。局限性在于疫苗只含HA基因。Acambis正在开发名为ACAM-FLU-A的通用流感疫苗。它是使用乙肝病毒核心蛋白递送M2e-离子通道蛋白的细胞外结构域M2e的重组疫苗。该疫苗含有AntigenicsInc.的QS 21佐剂。在健康受试者中进行的疫苗的美国I期试验在2007年7月开始。 转让给Alphavax Inc.的W02008085557公开了用于增强免疫系统对同时给药的HA抗原的应答的甲病毒复制子粒子(ARP)制剂。AlphaVax正在开发使用其甲病毒疫苗(alphavaccine)(甲病毒载体)技术的流感疫苗。该项目中的疫苗含有来自单一流感病毒株的红细胞凝集素基因。该公司已经启动了几个临床试验中的第一个，以评估用于流感的甲病毒疫苗。第一种用于流感的甲病毒疫苗含有来自于A/Wyoming H3N2流感毒株的红细胞凝集素基因。后续的试验将测试用于可能大流行的流感毒株的其他疫苗候选物。 VLP Biotech正在开发通用流感疫苗。疫苗是基于流感病毒M2蛋白与专有的VLP疫苗平台的组合。临床前研究正在美国进行。 国立过敏症与传染病研究所(The National institute of Allergy andInfectious Disease) (NIAID)正在开发预防甲型流感病毒感染的疫苗,其正处于临床前研究中。所述疫苗是带有突变的碱性聚合酶2 (PB2)基因的减毒的活的重配甲型流感病毒。Vaxin Inc.正在开发鼻内H5N1流感疫苗，其通过非复制型腺病毒载体将HA基因递送到鼻黏膜。Vaxin使用荷兰生物技术公司CrucelI 授权的PER. C6 细胞系作为制造基质来生产以腺病毒作为载体的疫苗。该H5N1流感疫苗的I期临床试验已经完成。curevents. com/vb/showpost. php p = 616437&postcount = 107)。这种基于腺病毒的疫苗的局限性是需要每年根据当时的流行毒株保持改变克隆的HA基因。此外，a)腺病毒接纳异源DNA的容量有限，因此不能容纳几个抗原，并且b)在60-80%的人群中预先存在对腺病毒的免疫性将限制以腺病毒作为载体的疫苗的效能。尽管进行了所有这些尝试，然而还不清楚使用基于病毒内部蛋白例如核蛋白或基质蛋白的流感疫苗完全取代全然基于表面蛋白(HA和NA)的传统流感疫苗是否可行。这主要是因为针对病毒表面蛋白的中和抗体在阻止感染的建立中发挥关键作用，而针对病毒内部蛋白的细胞毒性T淋巴细胞将清除已经感染的细胞。因此，在疫苗构建物中包括病毒表面和内部蛋白两者，将是适合的。尽管关于在疫苗构建物中使用高度保守的PB2抗原已有报道，但现有技术都没有提出本发明的抗原组合和方法。为了迎接下一代流感疫苗的挑战，我们开发了新的流感疫苗，其将把表面蛋白和保守的病毒内部蛋白两者合并在能够在各易犹得的细胞培养物系统中生广的病毒载体中。本发明的疫苗超越现有技术的一部分突出优点是I.不需要每年并入来自正流行的病毒株的抗原，因为本发明制造了能够防御不同流感病毒株的用于季节性和大流行流感的“通用疫苗”。为此目的，将禽流感病毒的两个内部基因、即M2胞内结构域基因和PB2基因合并到MVA中。M2蛋白的细胞外部分是非常保守的。自从1933年分离到第一个人类甲型流感病毒株以来，还没有发现M2蛋白的细胞外结构域中的氨基酸改变。2.基于MVA的疫苗将克服基于卵的疫苗的所有缺点，因为重组MVA病毒生长在BHK21细胞中而不是卵中。
3.因为在本发明中使用了复制缺陷型载体，因此避免了抗原性表位的福尔马林失活和变性问题。4.基于MVA的疫苗的递送将通过鼻内和肌肉内途径两者进行，通过鼻内途径引发并通过肌肉内途径加强或反之，以便产生全身和黏膜免疫应答两者。发明概沭本发明提供了制备通用流感疫苗的组合物和方法。本发明涉及基于重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒的通用流感疫苗。
根据这些以及其他目的，本发明涉及包含并能够同时表达来自流感病毒、特别是禽流感病毒的至少4个外来基因的表达盒的重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中所述基因被插入到MVA基因组内的非必需位点、优选为DelIII处，其中每个所述外来基因在相同启动子或多个启动子的各自单个拷贝或多个拷贝的转录控制之下。在另一个实施方案中，本发明涉及包含并能够同时表达来自流感病毒、特别是禽流感病毒的不少于2个外来基因的表达盒的重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中所述基因被插入到MVA基因组内的非必需位点、优选为DeIIII处，其中所述外来基因在单个启动子的各个拷贝的转录控制之下，前提是至少一个外来基因是PB2或M2e。本发明还涉及包含启动子的流感病毒基因表达盒、包含所述表达盒的载体以及药物组合物。附图简述图I :1%的琼脂糖凝胶，显示了质粒P8、4、7中商业合成的HA、NA和PB2基因的存在(双消化)。图2 :1%的琼脂糖凝胶，显示了质粒P5和6中商业合成的M2e和EGFP基因的存在(双消化)。图3 :1 %的琼脂糖凝胶，显示了 MVA基因组DNA的条带。图4 :转移质粒p2. BRC/V/A9的构建示意图。图5 :1%的琼脂糖凝胶，显示了在转移质粒中所克隆的撤、嫩、1^、？8236 、右侧和左侧基因的存在，以及通过SnaBI消化切除了流感基因表达盒。图6 :通过PCR验证在转染后获得的混合子代病毒中重组MVA(具有H5N1的HA、NA.M2e.PB2基因)的存在。(第I道1Kb序列梯；第2、4、6、8道从野生型MVA分别进行的 HA、NA、M2e、PB2 的 PCR ;第 3、5、7、9 道从重组 MVA 分别进行的 HA、NA、M2e、PB2 的 PCR)。图7 :该图显示了在小鼠中以I. OxlO8Pfu/小鼠肌肉内接种RecMVA后第28、43、71和85天时，血清样品中抗流感病毒IgG的滴度。图8 :该图显示了在小鼠中以I. OxlO8Pfu/小鼠鼻内接种Rec MVA后第43、71和86天时，血清样品中抗流感病毒IgG的滴度。图9 :该图显示了在小鼠中以I. OxlO8Pfu/小鼠接种Rec MVA后，支气管肺泡灌洗液中的抗流感病毒IgA。

图10 :在小鼠中以I. OxlO8Pfu/小鼠接种Rec MVA后，对细胞介导的免疫的淋巴组织增生测定。发明描述本发明涉及流感疫苗，其由将流感病毒基因的组合合并到修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒的基因组中而产生。本发明的构建物在本技术领域中尚未报道过。正如相关技术领域的普通专业人员所认识到的，本发明不限于本文中公开的具体方法步骤和材料，而是扩展到其等效物。应该理解，在本文中使用的术语仅仅是用于描述具体实施方案的目的，而不打算是限制性的。定义
修饰型安卡柃疴苗(MVA)病毒修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒是177kb dsDNA正痘病毒。它是通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中> 570次连续传代而产生的高度减毒的痘苗病毒株，在此传代过程中，它经历了总计31000个碱基对的6次主要DNA缺失(被称为缺失I、II、III、IV、V和VI) (Antoine等，1998)。缺失III (DelIII)位点是在MVA基因组中最常用的位点之一，用于插入和表达外来序列。修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒的完整基因组序列以及与其他正痘病毒的比较，可见于Virology 244:365-396。作为连续传代的結果，MVA病毒已变得宿主细胞严格限于禽类细胞，并且在人类和大多数其他哺乳动物细胞中复制不良。由于极端减毒，即使在将高剂量MVA给药于免疫缺陷的非人类灵长动物时，也没有报道不利效应(Stittelaar等，2001)。使用MVA有着详尽的临床经验，其用于超过120，000人的初次接种以对抗天花。在包括高风险患者的大范围研究期间，没有与使用MVA疫苗相关的副作用(Mayr等，1987 ；Stickl等，1974)。尽管MVA被高度减毒，但它仍維持良好的免疫原性。(Meyer等，1991)。在人类细胞中没有观察到MVA复制，因为在感染后没有发生成熟的感染性病毒粒子的组装。然而，MVA表现出甚至在非受納细胞(哺乳动物细胞系)中也以高水平表达病毒和重组基因，因此被当作有效和格外安全的基因表达载体(Sutter和Moss，1992)。为了进ー步开发MVA的用途，通过DNA重组将外来基因导入到MVA毒株中，而不改变MVA病毒的基因组。Blu-MVABlu-MVA是重组MVA病毒，在其基因组中具有插入到Del III位点中的P -gal基因。幼仓鼠肾细胞系(BHK21)当在本文中使用时，BHK21细胞系(幼仓鼠肾细胞)是源自于仓鼠肾脏的成纤维细胞系，其在1961年由I. A. Macpherson和M. G. P. Stoker建立。BHK21细胞系对痘苗病毒、水泡性ロ膜炎病毒、人类腺病毒25、呼肠孤病毒3和人类脊髓灰质炎病毒2易感。该细胞系被用作宿主，使用含有所需基因和标志物DNA的表达载体进行转染。增强型绿色荧光蛋白当在本文中使用吋，EGFP是指增强型绿色荧光蛋白，其是用于监测基因表达、蛋白质定位和蛋白质-蛋白质相互作用的强有力的报告分子。现在可以获得GFP的几种突变变体，它们在吸收、发射光谱和量子产率上不同。增强型GFP (EGFP)是这样的GFP突变体之一，含有Phe-64-Leu和Ser-65-Thr突变。因为它与野生型GFP相比在蓝光激发后提供更高强度的发射，因此被广泛使用。EGFP作为用于荧光活化细胞分拣和其他研究的理想分子而出现。(Canella 等，2000)。启动子启动子是促进特定基因转录的DNA区域。启动子典型位于它们调控的基因附近，在同一条链上并位于上游(朝向有义链的5’区域)。为了在修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒中表达异源基因，必须使用痘病毒启动子，因为细胞和其他病毒的启动子不被MVA转录器件识别。当希望在MVA中进行高水平表达时，强的晚期启动子例如Pll或pCAE是优选的。Kozak 序歹 1丨Kozak序列是用于在脊椎动物中启动翻译的共有序列。mRNA分子中的该序列被核糖体识别为翻译起始位点，从此位点起蛋白被所述mRNA分子编码。修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒的非必需区域本发明的非必需区域可以选自(i)MVA基因组中与痘苗病毒的基因组相比天然发生的缺失位点，或(ii)MVA基因组的基因间区域。术语基因间区域优选是指病毒基因组中位于两个相邻基因之间、包含既非编码也非调控序列的部分。然而，用于并入本发明的异源核酸的插入位点(非必需区域)不限于这些优选的插入位点，因为可以在病毒基因组中任何位置进行整合，只要可以获得能够在至少ー种细胞培养物系统中扩增和繁殖的重组体即 可，这属于本发明的范围内。因此，非必需区域也可以是ー个或多个非必需基因，其功能可以由用于MVA繁殖的细胞系统来补充。通用流感疫苗通用流感疫苗是指打算针对引起季节性以及大流行流感的病毒提供保护作用的流感疫苗。因此，将禽流感病毒的两个内部基因、即M2胞外结构域基因和PB2基因合并到MVA基因组的非必需区域中。这种重组病毒被用于制备通用流感疫苗。利用该疫苗，不必需要每年并入来自当时流行的病毒株的抗原来制造用于制备流感疫苗的重配体。本发明为了迎接下一代流感疫苗的挑战，我们开发了新的流感疫苗，其将把表面蛋白和保守的病毒内部蛋白两者合并在能够在容易获得的细胞系中生产的重组病毒载体中。用于本发明的细胞系MVA能够在鸡胚成纤维细胞、BHK21细胞、非洲绿猴肾细胞系CV-I和MA104中繁殖。MVA的最高滴度从鸡胚成纤维细胞获得，但是CEF的制备是繁琐的，并需要特殊的细胞培养经验。CV-I和MA104细胞最多产生与CEF细胞相比约十分之一的病毒量。BHK21细胞比CV-I和MA104更允许MVA繁殖。BHK21 (C13)是本发明的最优选细胞系。疫苗根据本发明，流感病毒基因可以选自H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N3和H9N2序列。优选，基因来自于H5N1。其中优选的流感病毒基因是红细胞凝集素，HA是在流感病毒表面上发现的抗原性糖蛋白，并负责病毒与正被感染的细胞的结合。存在至少16种不同的HA抗原。这些亚型被标记为Hl到H16。前三种红细胞凝集素HI、H2和H3在人类流感病毒中发现。这种附着是流感病毒基因有效转移到细胞中所需要的。各种流感病毒株显示物种选择性的能力主要是由于红细胞凝集素基因中的变异。红细胞凝集素基因中引起单个氨基酸取代的遗传突变能够显著改变病毒红细胞凝集素蛋白与宿主细胞表面上的受体结合的能力。禽流感病毒HA结合a 2-3唾液酸受体，而人类流感病毒HA结合a 2-6唾液酸受体。猪流感病毒具有与这两种类型的唾液酸受体结合的能力。红细胞凝集素受体蛋白的223位氨基酸的突变增加了病毒与人类受体结合的能力，并降低其对家禽受体的亲和性，使具有该突变的毒株更适合于感染人类。HA的受体结合袋的226、227和228位氨基酸残基似乎决定了与细胞表面受体的结合亲和性，并影响病毒与禽类(唾液酸-2，3-NeuAcGal)或人类(唾液酸-2，6-NeuAcGal)细胞表面受体的选择性结合。人类A/HK/212/03和A/HK/213/03分离株保留了与禽类受体结合相关的特征，但是它们在受体结合袋内具有独特的氨基酸取代(Ser227Ile)。研究人员发现，在HA基因中被鉴定为182和192位的两个位置处的突变，允许病毒与鸟类和人类受体两者结合。H5N1病毒的HA中的単一 E190D突变能够潜在地将它的结合偏好性从a 2-3唾液酸(禽类特异性)切換到a 2-6唾液酸(人类特异性)。1918年西班牙流感病毒发生的情况正是如此，该病毒在226和228位氨基酸处不具有任何突变，因此具有禽类特异性受体结合袋，但只是190位氨基酸的単一突变将其受体特异性改变成a 2-6唾液酸(人类特异性)。HA提供中和抗体应答。 神经氨酸酶，NA是在流感病毒表面上发现的抗原性糖蛋白酶。它帮助从被感染的细胞释放子代病毒。NA是诱导流感病毒特异性免疫应答、即抗体和T细胞的靶抗原，其可能有助于针对不同病毒变体或亚型的交叉保护作用。M从同一 RNA区段使用不同的阅读框编码基质蛋白Ml和M2。Ml是与病毒RNA结合的蛋白。M2起到离子通道蛋白的功能，在病毒粒子在内体中脱壳期间允许质子从内体流入病毒粒子内部以促进从RNP上移除Ml蛋白。M2蛋白的细胞外部分(M2e)非常保守。自从1933年分离到第一个人类甲型流感病毒株以来，还没有发现M2蛋白的细胞外结构域中的氨基酸改变。M2e通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制提供保护。聚合酶(PBI、PB2 :碱性聚合酶I和2，PA :酸性聚合酶)。PBl是三种P蛋白中性质得研究最清楚的蛋白；它含有所有RNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性DNA聚合酶共有的5个序列区块。PBl编码PBl蛋白和PB1-F2蛋白。PBl蛋白是病毒聚合酶的关键组分。PB1-F2蛋白由PBl RNA区段的可变开放阅读框编码，并对病毒致病性有贡献。PB2具有病毒mRNA合成所必需的帽结合和核苷酸内切活性。PA对于正链拷贝RNA和vRNA的正确合成是必不可少的，但是还没有为其指定在这些过程中的具体功能。核蛋白，NP编码核蛋白，其主要功能是包裹病毒基因组，用于RNA转录、复制和包装的目的。NS编码两种非结构蛋白——NSl和NEP。NSl (非结构蛋白I)在病毒感染的细胞中抑制干扰素响应，致使病毒生产不受损害。NSl蛋白绕过宿主的防御，允许病毒基因转录发生。H5N1 NSl的特征为92位处的单ー氨基酸变化。通过将氨基酸从谷氨酸改变成天冬氨酸，研究人员能够废除H5N1 NSl的效应。NSl基因中的该单ー氨基酸变化极大地増加了H5N1流感病毒的致病性。NEP是核外运蛋白，以前被称为NS2蛋白，介导vRNP的外运。本发明的一个实施方案涉及可用作针对流感病毒的通用疫苗的重组MVA病毒。具体来说，本发明涉及针对H5N1流感病毒的疫苗的生产。本发明的通用疫苗还涉及包含井能够表达H5N1禽流感病毒抗原的新组合的MVA病毒。根据本发明的一个实施方案，将编码来自H5N1病毒的ー些抗原的核苷酸序列导入到MVA的基因组中，其可以用作疫苗。使用的基因可以选自但不限于来自于A/Vietnam/1203/04 H5N1病毒的HA、NA、PB2和M2e基因。本发明可以不限于H5N1病毒。从流感病毒克隆的基因可以置于任何适合的启动子控制之下。基因可以在相同或不同启动子的单个或多个拷贝的控制之下。Pll是流感病毒基因可以在其控制之下表达的最优选启动子。在优选实施方案中，所有基因在它们各自的Pll启动子控制之下。根据本发明的另ー个实施方案，重组MVA病毒还可以具有与流感病毒基因一起克隆的标志基因。在优选实施方案中，使用的标志基因可以是增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。标志基因可以在控制流感病毒基因调节的ー个Pll启动子的控制之下。在优选实施方案中，EGFP标志物可以在各自的Pll启动子控制之下。所有这些基因，包括来自流感病毒的基因以及标志基因，可以克隆在ー个转移质粒中。克隆可以通过本技术领域中已知的方法来进行。转移质粒还可以具有来自于MVA病毒的序列，其帮助将转移质粒同源重组到MVA病毒基因组中任何天然发生的缺失处。本发明的一个优选实施方案涉及含有流感病毒基因、标志基因和来自MVA病毒的DelIII位点的“左側”和“右側”序列的转移质粒，所述“左側”和“右側”序列帮助转移质粒同源重组在MVA的DelIII位点处。因此，来自于流感病毒的基因可以克隆在任何非必需位点中，例如在MVA病毒的病毒基因组中天然发生的缺失位点中，以产生可以用作疫苗的重组MVA病毒。优选，来自于 流感病毒的基因可以克隆在病毒基因组的DelIII位点中，以产生用作疫苗的重组MVA病毒。根据本发明的优选实施方案，提供了新的质粒，其保藏在......保藏号
为.......本发明的另ー个优选实施方案提供了新的质粒，其包含来自于流感病毒、特别是禽流感病毒的至少两个基因，其中至少ー个基因是PB2和/或M2e。根据更优选的实施方案，本发明的新质粒包含来自于流感病毒、特别是禽流感病毒的红细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、聚合酶PB2和基质(M)蛋白的细胞外部分(M2e)。在本发明提供的另ー个优选实施方案中，这些基因可以在各自的Pll启动子控制之下。本发明的另ー个优选实施方案涉及包含并能够同时表达来自于流感病毒、特别是禽流感病毒的不少于两个外来基因的表达盒的重组MVA病毒，其中所述基因被插入到MVA基因组内DelIII位点处，并且外来基因在单个启动子的转录控制之下，前提是至少ー个外来基因是PB2或M2e。本发明的另ー个优选实施方案涉及包含并能够同时表达来自于流感病毒、特别是禽流感病毒的至少四个外来基因的表达盒的重组MVA病毒，其中所述基因被插入到MVA基因组内DelIII位点处，并且所述外来基因在单个、多个启动子或同一启动子的多个拷贝(asingle, multiple or multiple copies of the same promoter)的转: 控制Z下。根据本发明的一个优选实施方案，所述流感病毒基因可以在各自的Pll启动子的控制之下。重组MVA病毒的制备可以在各种系统中进行。BHK21细胞是用于制备重组MVA病毒的最优选的系统。根据本发明的优选实施方案，提供了制备重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒的方法，所述方法包含下列步骤a)培养哺乳动物细胞系，b)将细胞系生长至汇合，c)用Blu-MVA病毒感染所述细胞，d)用包含流感病毒、特别是Pll启动子控制之下的禽流感病毒的核酸转染所述细胞，e)对子代病毒进行传代以增加重组MVA的滴度，以及f)分离重组病毒。为了制备重组MVA病毒，优选可以使用已知技术将BHK21细胞用MVA病毒进行感染。在感染后，可以将被感染的细胞用包含来自于流感病毒的基因的转移载体转染。转染可以通过磷酸钙方法或脂质体或本技术领域已知的任何其他方法来进行。在实验期间可以使用适合的对照。在观察到致细胞病 变效应后，可以将被转染的细胞刮下、形成沉淀并冻融三次以释放出病毒，然后可以使用所述病毒感染新批次BHK21细胞。在制成储用物之前，可以将重组MVA传代9次。这样做可以增加重组MVA的滴度。该储用病毒可用于通过PCR证实外来基因在混合后代中的整合，通过Western印迹证实异源基因的表达，以及根据EGFP突光通过FACS分离重组MVA。然后可以对重组MVA进行纯化。本发明还涉及为需要预防有效量的重组MVA的人类/动物/鸟类进行免疫的方法。本发明的所述方法可以包含组合物，所述组合物也可以任选包含载体、添加剂、抗生素、防腐剤、稀释剂、盐类、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本技术领域公知的其他物质。这些物质必需是“可药用的”，这意味着它们是不干扰本发明的MVA的生物活性的有效性的无毒物质。载体的特性将取决于给药途径。药物组合物还可以包含增强活性或用于治疗的其他药剂。这样的其他因子和/或药剂可以包含在准备用于本发明的免疫接种方法的药物组合物中，以产生协同效应或使副作用降到最低。用于本发明的MVA的配制和给药的技术可见于〈〈Remington 药物字〉〉(Remington, s Pharmaceutical Sciencesノ(Muck PublishingCompany, Easton, PA,最新版)。本发明的另ー个实施方案涉及通过向对象给药包含含有来自于流感病毒、特别是禽流感病毒的基因的重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒的免疫原性组合物或疫苗，来治疗由流感病毒弓丨起的感染的方法。本发明的用于免疫接种的方法将利用预防有效量的重组MVA。本发明的疫苗可用于治疗儿童和成年人两者。预防有效剂量还指化合物/成分的量足以导致抑制感染发生或
改善症状。本发明的疫苗可以提供成试剂盒形式。试剂盒或组合物可以与包含疫苗详细情况例如给药指导、疫苗内抗原的详细情况等的说明书一起包装(例如在同一盒子中)。说明书还可以包含警示，例如保持肾上腺素溶液随时可用，以防免疫接种后的过敏反应等。根据本发明的实施方案，本发明的疫苗可以被配制成将包含流感病毒基因的修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒与其他抗原相组合，所述其他抗原例如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肝炎、脑膜炎、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、腮腺炎、风疹、BCG、日本脑炎、轮状病毒、天花、黄热病、伤寒、Singles、水痘等。在本发明提供的另ー个实施方案中，本发明的疫苗可以与包含上述其他抗原的疫苗的基本上同时、在相同或不同位点处给药。给药方式、给药剂量和次数可以由本技术领域的专业人员通过已知的方式来优化。免疫接种将是预防性的。本发明的疫苗可以适合于通过肠胃外以及非肠胃外途径给药。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的给药可以通过黏膜途径。在优选实施方案中，基于MVA的疫苗的递送可以通过鼻内和肌肉内途径两者来进行，通过鼻内途径引发并通过肌肉内途径加强或反之。在最优选实施方案中，疫苗可以通过鼻内途径给药以免疫患者对抗流感。所述疫苗组合物的鼻内给药可以配制成例如作为滴鼻液或喷鼻剂的液体形式、作为适合于吸入的粉末或作为霜剂或乳液。组合物可以包含各种添加剤，例如稳定剂、缓冲剂或防腐剤。为了施用简单，疫苗组合物优选供应在适合于以滴鼻液或气溶胶形式分配抗原的容器中。本发明的疫苗可以使用的其他给药途径是ロ、颊、肺、表面、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、透皮、眼、经黏膜、植入或直肠给药。下面的详细实施例打算帮助更好地理解本发明。然而，不打算给出本发明受限于实施例的主题内容的印象。
实施例I.使用具有商业合成的流感病毒基因(HA、NA、M2e、PB2和EGFP)的质粒进行转化在从商业来源合成后，获得了 H5N1的A/Vietnam/1203/04毒株的红细胞凝集 素(HA，登记号AY818135)、神经氨酸酶(NA，登记号AY818141)、基质蛋白2胞外结构域(M2e，登记号AY651388)、碱性聚合酶亚单位2(PB2，登记号AY651719)基因以及增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP，登记号U57609)。每个基因都在该基因前方具有启动子pll和核糖体结合位点kozak序列。将所述人工合成的基因克隆在pGAl/pUC-Kana/pPCR-Script/pGA4中，分别产生了质粒p8、p4、p5、p7和p6。使用这些质粒的姆ー个转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞(Maniatis, Sambrook等,2001)。将含有姆种质粒的两个转化菌落接种在适合的营养培养基中，并使用Qiagen试剂盒按照制造商提供的标准方案分离质粒。将分离到的质粒用适合的限制性酶消化以验证所需基因的存在(图I和图2)，然后储存在-20°C。质粒的甘油储用物以用每种质粒转化的大肠杆菌DH5 a培养物的形式储存在-80°C。2.幼仓鼠肾(BHK21)细胞系的培养BHK21 (C13)细胞系从ATCC获得。BHK21细胞通过定期分割并接种在增补有10%NBCS的DMEM培养基(Dulbeco修改的Eagle培养基)中来维持。BHK21细胞的储用物也一起制备。 3.生长MVA病韋3. IMVA的复苏和MVA储用制备物MVA病毒在DMEM培养基中通过感染BHK21细胞来复苏。然而，可以使用任何适合的培养基。将它在BHK21细胞中重复传代，直到它达到非常高的滴度。使用标准方法收获MVA感染的BHK21细胞，并将其储存在_80°C。3. 2MVA 的滴定因为MVA在BHK21细胞中不形成噬斑，因此其浓度通过Karber方法测定TCID5Q/ml来计算(《痘苗病毒和痘病毒学方法和方案》(Vaccinia Virus and Poxvirology Methodsand Protocols), Stuart N. Isaacs,2004)。4. MVA基因组DNA的分离用MVA储用物感染BHK21 (C13)细胞。在CPE发生后，收获感染的BHK21细胞并将其用于MVA基因组DNA提取(按照《痘苗病毒和痘病毒学方法和方案》(Vaccinia Virusand Poxvirology Methods and Protocols), Stuart N. Isaacs 中引述的方案)。将获得的沉淀物用70%こ醇清洗、空气干燥并溶解在无菌去离子水中。将提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶上运行(图3)。5.转移质粒p2. BRC/V/A9的构建转移质粒通过大量克隆步骤来构建(图4)。最終的转移质粒具有HA、NA、M2e和PB2流感病毒基因以及EGFP标志基因，每个都在各自的Pl I启动子控制之下。转移质粒中的基因段的两侧带有MVA的Del III位点的“左側”和“右側”序列(图5)，其帮助转移质粒在MVA病毒基因组的Del III位点中的同源重组。6.重组MVA的产生6. I.转移盒的切除将转移质粒p2. BRC/V/A9用限制性酶SnaBI (其在左侧和右侧序列中都有位点)消化以切除含有基因HA、NA、M2e、PB2、标志基因EGFP以及MVA两侧序列的整个盒(图5)。 将消化并凝胶纯化后的盒洗脱到无菌水中。6. 2用转移盒和全长转移质粒进行转染将BHK21细胞培养在60mm组织培养皿中。在80-90 %汇合时，移除培养基，将细胞用IX PBS++(含有I % CaCl2和I % MgCl2的PBS)清洗，并对每个60mm培养皿使用Blu-MVA(在Del III位点中插入有P-gal基因的重组MVA)病毒储用物的10_5稀释液Iml进行感染。在I小时的感染期中，使用基因盒(含有H5N1基因HA、NA、M2e、PB2、标志基因EGFP和MVA两侧序列)或使用全长转移质粒制备转染混合物。使用的转染试剂是Iipofectamine或氯化钙。在I小时温育后，移除病毒并通过本技术领域已知的方法进行转染。在37°C温育3-4天后，将转染的细胞刮下、沉淀、进行3轮冻融以释放出重组和野生型病毒。将病毒的该混合群体用于感染新鮮BHK21细胞。在制成储用物之前，将子代病毒在BHK-21细胞中传代几次。这样做是为了增加重组MVA的滴度。该储用病毒可用于通过PCR证实外来基因在混合后代中的整合(图6)，以及通过产色检测分离重组MVA。7.重组MVA的分离从11日龄的含胚SPF卵制备鸡胚成纤维细胞(CEF)。将细胞用混合的重组和野生型子代病毒储用物感染。通过覆盖X-gal来检测病毒噬斑。挑取指示重组病毒的白色噬斑。8.重组MVA的扩增、纯化和滴定8. I重组MVA的扩增在分离重组病毒后，使用BHK21细胞对其进行扩增。通过相继感染BHK21细胞的T25培养瓶、T75和T175培养瓶对重组MVA进行扩增。将在T175中生长的重组MVA感染的细胞沉淀下来，溶解在PH8的IOmM Tris中，并储存在_80°C。8. 2重组MVA的纯化将r-MVA感染的细胞通过超声进行破碎并离心以除去细胞碎片。对上清液施加分级蔗糖梯度(浓度级20^,25%,30^,35%和40% )。将纯化病毒的条带收集、沉淀并储存在_80°C。8. 3重组MVA的滴定因为MVA在BHK21细胞中不形成噬斑，因此其浓度通过TCID5(l/ml来计算。将BHK21细胞接种在96孔板中，并用重组MVA的两倍连续稀释液进行感染。将板在CO2培养箱中在37°C下温育5天。按照Karber的方法计算每ml的TCID5tl值。(《痘苗病毒和痘病毒学 .方法和万案〉〉(Vaccinia Virus and Poxvirology Methods and Protocols), Stuart N. Isaacs,2004)。9.重组MVA-Flu病毒在BALB/c小鼠中的免疫原性研究使用纯化的重组MVA-Flu病毒，以I. OxlO8PFU/小鼠的剂量率，通过肌肉内途径对ー组6-8周龄BALB/c小鼠(n = 6)进行免疫接种。使用纯化的重组MVA-Flu病毒，以
I.OxlO8PFU/小鼠的剂量率，通过鼻内途径对第二组6-8周龄BALB/c小鼠(n = 6)进行免疫接种。适当采用安慰剂组。在免疫接种前从每只小鼠收集血样。在第7、28和50天，通过相应的途径向两个组中的所有动物给药纯化的重组MVA-Flu病毒加强剂量(I. OxlO8PFU/小鼠)。
对每只小鼠在开始免疫后第0、28、43、71和85日(在鼻内免疫接种组的情况下是在开始免疫后第86日)取血。在安乐死当日从每只小鼠收集BAL样品和脾脏。为了评估流感病毒特异性全身体液免疫应答，通过ELISA测定每只小鼠的血清样品中针对流感病毒的抗体(图7和8)。为了评估流感病毒特异性黏膜体液免疫应答，通过ELISA测定每只小鼠的BAL样品中针对流感病毒的抗体(图9)。使用从脾脏分离的淋巴细胞进行了淋巴组织增生測定(《免疫学现代方法》(Current Protocols In Immunology, Vol I))，以评估针对流感病毒的细胞免疫应答。


本发明涉及新的流感疫苗、用于制备它的新质粒以及包含它的新剂型。具体来说，本发明涉及重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含并能够同时表达来自流感病毒、特别是禽流感病毒的至少4个外来基因的盒，其中所述基因被插入到MVA基因组内的非必需位点处。本发明还涉及重组修饰型安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含并能够同时表达来自流感病毒的不少于两个外来基因的盒，其中所述基因被插入到MVA基因组内的非必需位点处，前提是至少一个外来基因是PB2或M2e。本发明还提供了组合物和制造通用流感疫苗的方法。