专利名称：：桃果实病害生物防腐保鲜剂及用途和所用罗伦隐球酵母的制作方法技术领域：，更具体的是一种桃果实生物防腐保鲜技术。：由真菌引起的果实采后的腐烂变质是导致果实大量损失的主要原因之一。桃是国内外主要水果品种之一，目前世界总产量达1100万吨。中国是桃的原产国，也是目前世界桃产量最大的国家。桃果实富含维生素C、类胡罗卜素和酚类物质等抗氧化剂，深受人们的喜爱。桃树适应性极广，品种繁多，主要可分为水蜜桃类、黄肉桃类和油桃类等。水蜜桃和和油桃均属跃变型果实，且由于采收期正值高温季节，采后果实在常温下成熟衰老和软化进程很快。低温能延缓果实成熟衰老，但桃果实对低温敏感，在低温下长时间贮藏易发生冷害症状。中国发明专利(一种油桃果实的贮藏方法，专利号200610042849.0)公开了一种油桃果实的贮藏方法，该方法包括对油桃果实的选择、物理杀菌、预冷处理、装袋密封、入库冷藏五个步骤。解决了油桃果实冷藏时果实品质损伤率高、冷藏效果有限的技术问题。中国发明专利申请号200810162751.8(—种水蜜桃果实贮藏方法)公开了一种水蜜桃果实贮藏方法，该方法采用程序性降温，对果实进行低温锻炼，通过一定低温诱导果实组织忍耐低温冷害能力，低温冷藏；可以有效减缓果实呼吸速率，延长果实贮藏时间。桃果实采后易受多种真菌的侵染，特别是匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)引起的软腐病，链核盘菌(Moniliniafructicola)引起的褐腐病，以及由扩展青霉(Penicilliumexpansum)引起的青霉病，由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病等。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、皮孔等天然开口而侵染。传统上控制果实病害主要依靠化学杀菌剂，但由于化学杀菌剂存在着食品安全和环境保护的问题，因此迫切需要开发能替代化学杀菌剂的果实病害控制方法和技术。利用微生物，特别是酵母对病原真菌的拮抗活性的生物防腐保鲜技术，作为一种新型采后病害控制方法受到了国内外广泛的关注。但目前拮抗酵母对病原物的控制效力与杀菌剂相比还存在较大的差距。通过商业化试验表明，目前研究中的采后拮抗酵母，包括国外已商业化生产的拮抗酵母都只有在补充低剂量杀菌剂的条件下才能达到与杀菌剂(正常使用量)同等的效果(Droby等，2009；Sharma等，2009)。因此如何利用安全而且有效的方法提高拮抗酵母的效力是影响采后拮抗酵母大规模推广应用的关键性问题。罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治微生物菌株，其拮抗机理涉及营养和空间竞争、与病原菌粘合、分泌β_1，3-葡聚糖酶、抗氧化胁迫、诱导果实抗性或抗性相关反应、降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果实与激发病原菌孢子萌发相关的挥发物等。林丽等(2003)报道利用罗伦隐球酵母和低剂量杀菌剂(扑海因)能抑制桃果实青霉病和软腐病的发病率。Yao和Tian(2005)报道罗伦隐球酵母和茉莉酸能降低桃果实青霉病和褐腐病的发生。Zhang等(2007ab)的研究表明，罗伦隐球酵母与热处理结合能减少桃果实的青霉病和灰霉病的发病率。中国发明专利(专利3号ZL200310115337.9，用硅酸钠或硅酸钾防治果蔬采后病害的方法以及果蔬采后病害防治液)公开了一种利用硅酸盐及罗伦隐球酵母等控制甜樱桃、黄瓜、桃和冬枣等果实病害的方法。该发明专利显示，利用硅酸钠或硅酸钾能降低桃果实病害的发病率；但未显示利用罗伦隐球酵母对桃果实病害的控制效应。中国发明专利申请号200310115336.4(—种生物拮抗菌及其应用)公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明专利申请号200810128441.4(—种生物活性果蔬保鲜膜)公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请号200910078858.9(葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂)公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法。另外，中国发明专利(专利号ZL200510090063.1，一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方；中国发明专利(专利号ZL200510090065.0，酵母拮抗菌C.Iaurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法)公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利(申请号200910079774.7，一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法)公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。壳聚糖是几丁质脱乙酰产物。作为一种可生物降解的天然物质，壳聚糖不仅资源丰富、价格低廉、无毒安全，而且具有众多独特的功能，在食品和采后保鲜等领域都有着广泛的研究和应用。在采后领域，国内外的研究重点关注壳聚糖具有的3个显著的生物学功能，即延缓果实成熟、衰老、维持采后品质的功能；直接抑菌的功能和作为激发子诱导果实抗性的功能(Bautista-Bafios等，2006)。钙处理是采后保鲜的常用手段。据研究报道，钙处理不仅能延缓果实采后的成熟衰老，维持采后品质，而且还与果实对病害的抗性密切相关。例如，不仅采前钙处理能降低桃果实褐腐病的发病率；而且采后钙处理也能诱导梨果实对黑斑病的抗性(Tian等，2006；Elmer等，2007)。参考文献1.林丽，田世平，秦国政，徐勇.2003.两种拮抗酵母菌对桃果实贮藏期间主要病害的防治效果.中国农业科学36(12):15351539。2.Bautista-BanosS,Hernandez-LauzardoAN,Velazquez-delValIeMG,Hernandez-LopezΜ,AitBarkaΕ,Bosquez-MolinaΕ,WilsonCL.2006.Chitosanasapotentialnaturalcompoundtocontrolpreandpostharvestdiseasesofhorticulturalcommodities.CropProtection25:108-118.(鲍提斯塔-芭挪斯等，2006，壳聚糖作为一种天然物质对园艺作物采前和采后病害的控制，作物保护，25108-118)。3.DrobyS.，WisniewskiM.，MacarisinD.，WilsonC.2009.Twentyyearsofpostharvestbiocontrolresearch:1sittimeforanewparadigm？PostharvestBiologyandTechnology52:137-145.(爵劳比等，2009，20年釆后生物防治研究釆后生物学和技术，52137-145)。4.ElmerPAG,SpiersTM,WoodPN.2007.Effectsofpre-harvestfoliarcalciumspraysonfruitcalciumlevelsandbrownrotofpeaches.CropProtection26:11-18.(爱尔玛等，2007，采前钙处理对桃果实钙含量和褐腐病的影响，作物保护，26:11-18)。5.SharmaR.R.,SinghD.,SinghR.2009.Biologicalcontrolofpostharvestdiseasesoffruitsandvegetablesbymicrobialantagonists:Areview.BiologicalControl50=205-221.(夏玛等，2009,采后果蔬病害生物控制进展，生物控制，50205-221)。6.YaoHJ,TianSP.2005.Effectsofabiocontrolagentandmethyljasmonateonpostharvestdiseasesofpeachfruitandthepossiblemechanismsinvolved.JournalofAppliedMicrobiology98:941_950.(姚，田，2005，一种生防剂和茉莉酸甲酯对桃果实采后病害的影响及其机理，应用微生物，98941-950)。7.TianSP,WanYK,QinGZ,XuY.2006.InductionofdefenseresponsesagainstAlternariarotbydifferentelicitorsinharvestedpearfruit.AppliedMicrobiologyandBiotechnology70:729-734.(田、万、秦、许，2006，激发子对桃果实采后病害抗性的诱导左右，应用微生物和生物技术，70729-734)。8.ZhangH,ZhengX,YuT.2007a.BiologicalcontrolofpostharvestdiseasesofpeachwithCryptococcuslaurentii.FoodControl18:287-291.(张、郑、余，2007a,罗伦隐球酵母对桃果实采后病害的生物防治，食品控制，18287-291)。9.ZhangH，WangL，ZhengX，DongY.2007b.EffectofyeastantagonistincombinationwithheattreatmentonpostharvestbluemolddecayandRhizopusdecayofpeaches.InternationalJournalofFoodMicrobiology.11553-58.(张、王、郑、董，2007b，酵母拮抗菌和热处理对桃果实采后青霉病和软腐病的影响，国际食品微生物，115:53-5)。
本发明要解决的技术问题是提供一种基于拮抗酵母和病害控制增效剂活性的桃果实病害生物防腐保鲜方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种罗伦隐球酵母，保藏名称为罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏号=CGMCCN0.3590。本发明还同时提供了一种桃果实病害生物防腐保鲜剂，该保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙和水组成；每IL保鲜剂中含有IXIO9IXIO12个罗伦隐球酵母细胞、0.1IOg的壳聚糖和550g的氯化钙，其余为水。本发明还同时提供了利用上述桃果实病害生物防腐保鲜剂进行的桃果实保鲜法，包括以下步骤1)、预处理用保鲜剂对采前桃果实进行表面喷洒或将采后的桃果实在保鲜剂中浸泡15分钟；2)、将预处理后的桃果实进行常温或低温贮藏。作为本发明的桃果实保鲜法的改进常温是指1525°C，低温是指06°C。本发明提供的桃果实生物防腐保鲜方法，是将桃果实用罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号CGMCC3590〕悬浮液和病害控制增效剂(壳聚糖和氯化钙)复合进行处理，然后进行常温或低温贮藏。本发明的桃果实生物防腐保鲜方法只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，通过复合增效，能大幅度提高对果实病害的控制效果。上述罗伦隐球酵母和病害控制增效剂的复合处理是指将病害控制增效成分直接添加到酵母菌菌悬液中而制成的生物防腐保鲜剂。上述果实生物保鲜处理可采用采前果实表面喷洒(使果实表面湿润即可)或采后浸泡1-5分钟的方法。所述果实为水蜜桃和油桃；所述病害为软腐病和青霉病；所述生物防腐保鲜主要成分为罗伦隐球酵母悬浮液；所述病害控制增效剂为壳聚糖和氯化钙。上述罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化，并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液，其有效浓度为IXIO6细胞/毫升IXIO9细胞/毫升。上述罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化和制备而成。活化后的菌体在3000rpm条件下离心分离10分钟，用灭菌蒸馏水洗2次，去除培养介质；用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。上述病害控制增效剂壳聚糖和氯化钙，其有效浓度分别为，每IL保鲜剂中含有0.1IOg的壳聚糖和550g的氯化钙。上述病害控制增效剂的有效浓度是指其使用量确保不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，并能发挥壳聚糖和氯化钙特定生理功能的浓度。本发明提供的生物防腐保鲜剂有效整合了拮抗酵母、壳聚糖和氯化钙的抑菌和生理活性，从而显著抑制桃果实病害的发生和发展；并能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母、壳聚糖的使用量，从而显著降低成本。本发明具有安全高效、环境友好，病害防治效果突出等优点。该技术的使用有利于转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全，环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要眉、ο具体实施例方式下面详细说明本发明的具体实施例。选用“玉露”作为水蜜桃(PrimuspersicaL.)果实；选用“沪油2号”作为油桃(PrunuspersicaL.)果实。壳聚糖可购自浙江澳兴生物科技有限公司，氯化钙为分析纯无水氯化钙。实施例1、生物防腐保鲜剂对水蜜桃青霉病的控制1处理方法1.1生物保鲜剂配制以下所用的NYDA培养基为牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，高压(121，30分钟)灭菌。所用的NYDB种子培养基为牛肉浸膏Sg、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压(121°C，30分钟)灭菌。罗伦隐球酵母CGMCCNO.3590在低温(4°C)下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为①、活化罗伦隐球酵母CGMCCNO.3590先在NYDA培养基中28°C培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中28°C培养48小时)；将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中，于200rpm、28°C下培养24小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，200rpm、28°C下培养24小时)；②、液体培养用步骤①活化所得的酵母按照5%(重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpm、28°C条件下培养24小时；③、离心分离将步骤②液体培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；④、悬浮和确定浓度用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。在浓度为5XIO8个细胞/ml、体积为2升的罗伦隐球酵母悬浮液中缓慢加入浓度为(w/v)的壳聚糖溶液1升(即每L壳聚糖溶液中含有IOg壳聚糖)，壳聚糖溶液加入完毕后继续搅拌混勻5分钟；然后在保持搅拌的条件下，缓慢加入浓度为10%(w/v)的氯化钙溶液1升，氯化钙溶液加入完毕后继续搅拌混勻5分钟，加水稀释到10升备用。该最终所得的每L保鲜剂中含有IXIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙。1.2果实处理可任选以下任意一种处理方式处理一选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的桃果实，用自来水冲洗、并在室温(25°C左右)下放干。将桃果实在上述生物防腐保鲜剂溶液(每L保鲜剂中含有IXIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙)中浸泡3分钟后，取出放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温(25°C左右)下保持2024小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。处理二采前采用喷壶喷洒的处理方法，将上述生物防腐保鲜剂溶液(每L保鲜剂中含有IXIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙)喷在果实表面(湿润即可)，待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温(25°c左右)下保持2024小时，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。1.3生物防腐保鲜效果评价用消过毒的打孔器在水蜜桃每个果实表面形成统一大小和深度的伤口(3050μ1)，每个伤口处等量；分别设置如下处理处理1空白对照，每个果实伤口处加入同伤口体积的无菌水，2小时以后在每个伤口加入30μ1、浓度为IXIO4个孢子/毫升的P.expansum孢子悬浮液；处理2以浓度为IXlO11个细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水，其余同处理1；处理3:以浓度为(w/v)的壳聚糖溶液(即，每L溶液中含有IOg壳聚糖)替换无菌水，其余同处理1；处理4:以浓度为5%(w/v)的氯化钙溶液(即，每L溶液中含有50g氯化钙)替换无菌水，其余同处理1;处理5以保鲜剂I(每L保鲜剂I中含有1XIO11个罗伦隐球酵母细胞和Ilg壳聚糖)替换无菌水，其余同处理1；处理6以保鲜剂11(每L保鲜剂II中含有1XIO11个罗伦隐球酵母细胞和Ilg氯化钙)替换无菌水，其余同处理1；7处理7以浓度为IXlO12个细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水，其余同处理1；处理8以本发明的生物防腐保鲜剂(每L保鲜剂中含有IXIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙)替换无菌水，其余同处理1；处理9以本发明的生物防腐保鲜剂(每L保鲜剂中含有IXIO12个罗伦隐球酵母细胞、IOg壳聚糖和50g氯化钙)替换无菌水，其余同处理1；处理10以本发明的生物防腐保鲜剂(每L保鲜剂中含有IXlOici个罗伦隐球酵母细胞、0.Ig壳聚糖和5g氯化钙)替换无菌水，其余同处理1。处理完毕后放入贮藏于常温下(25°C)，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每天定时对果实病害进行观察和统计，结果以平均病害发生率(％)和平均病斑直径(mm)表示。每处理重复4次，每个重复24个果实。整个实验重复2次以上。以下结果为在处理后6天检测而得。2、生物防腐保鲜效果评价结果生物防腐保鲜剂对水蜜桃青霉病的控制效果如表1所示。表1、对水蜜桃青霉病的控制效果实施例2、生物防腐保鲜剂对水蜜桃软腐病的控制罗伦隐球酵母活化、培养和制备如实施例1所述。生物防腐保鲜剂的制备方式同实施例1，即最终所得的每L保鲜剂中含有1XIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙。实验一、水蜜桃果实经过挑选，清洗和表面消毒后，用消过毒的打孔器在水蜜桃每个果实表面形成统一大小和深度的伤口(3050μ1)，每个伤口处等量；该水蜜桃果实为高成熟度(硬度为5.3士0.4XIO5Pa)水蜜桃果实；分别设置如下处理处理1空白对照，每个果实伤口处加入同伤口体积的无菌水，2小时以后在每个伤口加入30μ1、浓度为IXIO4个孢子/毫升的R.Stolonifer孢子悬浮液；处理2以浓度为1000毫克/毫升的"丰收纯"杀菌剂溶液替换无菌水，其余同处理1；处理3以浓度为IXlO11个细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水，其余同处理1；处理4以保鲜剂I(每L保鲜剂I中含有1XIO11个罗伦隐球酵母细胞和Ilg壳聚糖)替换无菌水，其余同处理1；处理5以保鲜剂11(每L保鲜剂II中含有1XIO11个罗伦隐球酵母细胞和Ilg氯化钙)替换无菌水，其余同处理1；处理6以本发明的生物防腐保鲜剂(该保鲜剂中含有IXIO11个罗伦隐球酵母细胞、Ig壳聚糖和IOg氯化钙)替换无菌水，其余同处理1。分别在24小时、48小时、72小时、96小时和120小时进行检测，统计分析方式同实施例1，结果如表2-1所示表2-1、对高成熟度水蜜桃软腐病的控制效果处理发病率(％)24小时48小时72小吋96小时120小时处理1，对照54.181.3100100100处理2039.574.880.789.4处理3039.786.7100100处理4030.959.268.491.2处理5031.765.773.694.2处理6(本发明)024.748.056.374.7实验二、以低成熟度(硬度为11.1士0.5X10sPa)的水蜜桃果实替代实验一中的高成熟度(硬度为(5.3士0.4XIO5Pa)水蜜桃果实，其余同实验一，结果如表2_2所示表2-2、对低成熟度水蜜桃软腐病的控制效果9实施例3、生物防腐保鲜剂对油桃青霉病的控制效果以油桃替代实施例1中的水蜜桃，其余同实施例1；结果如表3所示。表3、对油桃青霉病的控制效果实施例4、生物防腐保鲜剂对油桃软腐病的控制效果以高成熟度的油桃果实替代实施例2的实验一中的高成熟度的水蜜桃果实，其余同实施例2的实验一，检测时间为72小时，结果如表4所示表4、对高成熟度油桃软腐病的控制效果处理发病率(％)24小时48小日寸72小时处理1(空白对照)100100100处理254.3100100处理321.755.983.6处理411.637.452.5处理514.340.562.4处理6(本发明)011.721.7最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。1权利要求一种罗伦隐球酵母，其特征是保藏名称为罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏号CGMCCNO.3590。2.一种桃果实病害生物防腐保鲜剂，其特征是所述保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙和水组成；每IL保鲜剂中含有IXlO9IXlO12个罗伦隐球酵母细胞、0.1IOg的壳聚糖和550g的氯化钙，其余为水。3.利用如权利要求2所述的桃果实病害生物防腐保鲜剂的桃果实保鲜法，其特征是包括以下步骤1)、预处理用所述保鲜剂对采前桃果实进行表面喷洒或将采后的桃果实在所述保鲜剂中浸泡15分钟；2)、将预处理后的桃果实进行常温或低温贮藏。4.根据权利要求3所述的桃果实保鲜法，其特征是所述常温为1525°C，所述低温为06°C。全文摘要本发明公开了一种罗伦隐球酵母，保藏名称为罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏号CGMCCNO.3590。本发明还同时公开了一种桃果实病害生物防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙和水组成。本发明还同时公开了利用上述防腐保鲜剂所进行的桃果实保鲜法。采用本发明能有效延长桃果实的保鲜时间。文档编号C12R1/645GK101914459SQ201010152108公开日2010年12月15日申请日期2010年4月20日优先权日2010年4月20日发明者余挺,卢黄娉,王一非,郑晓冬申请人:浙江大学