专利名称：用于牙科修复的骨移植物以及复合生物材料的制作方法骨植入物的稳定性很大程度取决于其内生性能。为了使人工植牙起作用，颂骨内应当有足够的骨，且该骨应当坚固至足以固定和支撑植牙。当上颂骨或下颂骨不具备足够或合适的深度或厚度时，牙科修复中采用移植以实现与人工植牙的安全整合。常规的移植物包括患者自身的骨(自体移植)、来自尸体的处理过的骨(同种异体移植)、牛骨或珊瑚 (异种移植)、以及合成的类骨或仿骨材料。在典型的程序中，牙医或口腔外科医生创建一个大的龈瓣，以暴露出移植部位的颂骨，在现有的骨内和骨上安装一些嵌段移植物和高嵌体移植物，并最终采取措施以排除不需要的感染。然后将牙龈在该部位上缝合，该移植部位需要数周或数月才能痊愈。痊愈涉及一连串复杂的自适应细胞反应，例如分化、迁移、吸附、增殖、细胞外基质合成以及最终的矿化作用。然而，移植物或植入物整合入周围骨的骨整合过程极少为人所知。骨诱导性和骨生成涉及众多的生长因子，并且据称有许多其他的分子参与这些过程。骨形态发生蛋白(BMP)是唯一已知的能够异位诱导骨形成的生长因子。补充剂量的BMP通过诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞，促进骨痊愈。然而，骨移植物和植入物会产生非常类似自然的有生命力的带血管骨。US-A 547 8237 (Ishikawa)公开了一种涂覆有羟磷灰石层的植入物，WO 02/078759 (Stratec医学公司)公开了一种具有多孔金属氧化物层的植入物，该多孔金属氧化物含有非晶形的和纳米晶体磷酸钙和羟磷灰石， WO 02/085250 (KERAMED公司)公开了一种植入物，其中，一可吸收的磷酸钙相的涂覆层含有粘着蛋白和信号蛋白，例如骨涎蛋白(BSP)、骨形态发生蛋白(BMP)、纤连蛋白、骨桥蛋白(OPN)、ICAM-I、VCAM及其衍生物。其他这一类型的移植物和植入物均在EP 1 166 804 A2 (Merck,Darmstadt)和WO 99/08730 (儿童医学中心有限公司)中得以描述。DE 100 37 850 AlQenissen H)和WO 03/059407 Al (Straumann控股公司)描述了用泛素或转化生长因子(TGF)或全身激素例如骨抑制、骨生成和骨生长蛋白(OGP)处理过的移植物或植入物。US 7，229，545B2 (Biomet德国公司)公开了由经磷酸钙矿化的胶原基质制成的类骨涂层，EP 1 442 755 A1(D印uy用品)公开了一种含有骨生成蛋白0P_1、BMP_7和非胶原性骨基质蛋白的生物活性陶瓷涂层。此外，骨生成活性已被报道为纤维母细胞生长因子(FGF)、 转化生长因子-β (TGF-β)，血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子(IGF)以及前述物质的家族成员。WO 2005/104988 (Armbruster等)要求保护采用低糖基化人rBSP处理过的植入物和骨修复基质。该植入物由钛、锌、陶瓷、金属合金或不锈钢制成，并可用非晶形的或晶体羟磷灰石和/或磷酸钙涂覆。然而，这些仿骨涂层具有随时间推移容易从基体松开、影响植入物长期稳定性的缺点。WO 03/047646 (芬兰坦佩雷Inion公司)公开了能够塑造为医疗植入物的骨移植物。该移植物或植入物由一基础材料制成，该基础材料包括可吸收聚合物或共聚物基质，以及 N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。Reichhardt 等在《European Cells and Materials (2006， 11(2) :27f)》中描述了一种生物复合材料，该生物复合材料含有β-磷酸三钙(β-TCP)颗粒，该颗粒涂覆有聚羟基乙酸和聚乳酸的共聚物。该生物复合材料可通过与N-甲基-吡咯烷酮混合制成可模塑的，以便于放置。Nair等在《J. Biomater. Appl. (2006,20 :307_24)》中公开了牙科移植物和植入物，其中，通过聚羟基乙酸-聚乳酸共聚物的热融合，使β-TCP颗粒聚合在一起。该β-TCP颗粒描述为，抑制间充质干细胞分化和增殖为成骨细胞，并抑制骨的愈合。Wang等在《J. Orth. Res. (2002，20 :1175ff)》中也描述了这样一种对金属磨损颗粒的抑制，以及对处理过的和大的表面区域的抑制。US 6，458，763 (Peterson等)要求保护一种用于修复受损或患病的骨和软骨的生物活性组合物。该生物活性组合物通过一载体施用，该载体包括一药学上可接受的基体和生理矿物填料，例如磷酸三钙、羟磷灰石、石膏等。当在大鼠颅骨的顶骨隆凸或邻近顶骨隆凸处钻孔，并在14天内使用渗透泵将该生物活性组合物泵至该颅骨缺陷位置时，随后在体内观察到钻孔四周的骨组织生长减缓。显然，该施药的方法以及组合物并不适于牙科修复。WO 94/13310(Η δ δ k等)要求保护一种含有竞争肽作为活性组分的组合物，该竞争肽看起来似乎能够阻止金黄色葡萄球菌粘附到骨组织上，并阻止骨髓炎的发生(Ryden 等，1989，Eur. J. Biochem. 184 :331f)。尽管现有技术提出这样一个问题，即牙科植入物往往导致称为种植体周围炎的牙周问题，该种植体周围炎由在外科手术中或患者未能遵守正确的口腔保健程序所诱导的感染所引起。尽管种植体周围炎可通过在外科手术之前或之后的数天内使用一系列抗生素或特殊的口腔漱液来进行治疗，但令人期望的是，可促进伤口及软组织愈合的以及种植体周围炎的预先治疗。无菌性松动、炎症反应和骨内植入物的长期稳定性仍是一个问题。除了生物活性涂层之外，在外科手术和骨整合之间仍然存在一段相当长的时间，直到骨移植物和骨内的牙齿植入物可耐受典型的压力、剪切力和张力。本发明的一个具体目的是提供一种允许简易放置的移植材料，以及用于在牙科修复过程中促进骨头和软组织痊愈的方法和组合物。
以上目的已经由权利要求1所要求保护的生物复合材料达到。从属权利要求中公开了本发明的其他实施方式。本发明用于处理骨缺陷和骨新生的骨移植物是一种含有可降解聚合物和β-磷酸三钙颗粒的组合物，并经由以下步骤获得提供一种骨诱导性混合物，所述骨诱导性混合物为一种分散剂或溶液，其基于具有至少一个含氮碱基的有机化合物，以及生理有效量的低糖基化重组人BSP，该重组人BSP 在非变性条件下获得，其中所述低糖基化重组人BSP在所述骨诱导性混合物中作为盐或复合物存在，这与存在于人血清，以及，任选地，药学上可接受赋形剂或载体中的常规人BSP 相比，可降低对钙、羟磷灰石和补体因子H的亲和力；基于β -晶形的二磷酸三钙(Ca3(PO4)2)颗粒，提供一种骨传导性混合物，所述颗粒涂覆有生物可降解聚合物或共聚物以及，任选地，药学上可接受的赋形剂或载体，所述骨传导性混合物为可模塑的和可成形的，并且当通过手术或牙科修复放置时，迅速在原位硬化；以及在放置不久之前或放置期间，将所述骨诱导性混合物和所述骨传导性混合物结合，以获得骨移植材料，所述骨移植材料促进骨修复以及受损或患病组织和病变的痊愈。在本发明的第二个方面，所述骨诱导性人BSP为在无血清条件下生长的真核细胞中表达并获得的低糖基化人BSP。在本发明的第三个方面，所述低糖基化人BSP从初乳或母乳中获得。本发明所使用的有机化合物优选为具有至少一个环状含氮碱基。所述有机化合物可优选为分散剂和所述生物可降解聚合物或共聚物的塑化剂，并可选自N-异丙基吡咯烷酮、N-甲基嘧啶、N-乙基嘧啶、N-甲基吡咯烷酮(1-甲基-2-吡咯烷酮)、Ν-乙基吡咯烷酮、 N-丙基吡咯烷酮、队^二乙基-1，4-丁二胺、1-(2-氨乙基)-哌嗪、2-(1-吡咯烷基)乙胺、 4-氨基-2-甲氧基-嘧啶、2- 二甲氨基-乙醇、1-(2-羟乙基)-哌嗪、4-(2-羟乙基)-吗啉、2-巯基嘧啶、2-巯基苯并咪唑、N，N- 二甲基-1，3-丙二胺、4-(2-氨乙基)-嘧啶，2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑、4-(氨乙基)吡啶、N，N- 二烯丙基-三聚氰胺、3-氨基-1，2，4_三唑、1 _ (3-氨丙基)-咪唑、4- (2-羟乙基)-吡啶、1 - (2-羟乙基)-咪唑、3-巯基-1,2,4-H 唑。在本发明的另一方面，所述生物可降解聚合物或共聚物选自聚乙交酯、聚(L-丙交酯-co-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-co-乙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、 聚(L-丙交酯-co-D，L-丙交酯)、聚己内酯、聚(L-丙交酯-co-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-co-己内酯)、聚三亚甲基碳酸酯、聚(L-丙交酯-co-三亚甲基碳酸酯)、聚(D，L-丙交酯-co-三亚甲基碳酸酯)、聚对二氧环己酮、聚乳酸聚合物、聚羟基乙酸聚合物、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物、聚羟基丁酸、聚羟基戊酸聚对二氧环己酮、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚原碳酸酯聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、聚(羟基丁二酸)、聚(顺丁烯二酸酐)、多肽、聚缩酚酸肽、聚乙烯醇、聚酰胺酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨酯、聚磷腈、聚氰基丙烯酸酯、聚富马酸酯、聚(氨基酸)、改性多糖、改性蛋白以及它们的共聚物、三元共聚物或以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。本发明的另一方面涉及在牙科修复中使用的所述骨传导性组分，其可优选含有经涂覆的磷酸三钙(Ca3(PO4)2)颗粒，该颗粒直径为300至800微米，优选为400至700微米。 本发明的生物复合材料可优选含有体积百分比大于50 %的β -磷酸三钙颗粒、体积百分比为10%至40%的聚合物基体、体积百分比为0. 5%至10%的第一骨诱导性混合物，所述聚合物基体含有一种或多种生物可降解聚合物和共聚物，所述第一骨诱导性混合物增加生物复合材料的可塑性和工作性能，并作为BSP的溶剂或分散剂。每毫升所述复合材料中含有 1至200微克的人rBSP。优选地，所述骨诱导性混合物在硬化之前每毫升含有1至200微克的人rBSP。根据本发明，所述生物可降解聚合物可为聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物，其组成为含有50 % 80 %的乳酸和20 % 50 %的羟基乙酸。所述聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物可具有介于约25，000至约1，000, 000之间的平均分子重量。所述骨移植材料应优选在硬化6CN 102470193 A说明书4/12 页后具有介于IGPa至约IOOGpa之间的杨氏模量。本发明的另一个方面是制备一种具有骨诱导和骨传导性能的骨移植物的方法，包括以下步骤提供一种骨诱导性混合物，其为一种分散剂或溶液，该分散剂或溶液基于具有至少一个含氮碱基的有机化合物和生理有效量的低糖基化重组人BSP ；提供一种骨传导性混合物，其基于β晶形的磷酸三钙(Ca3(PO4)2)颗粒，该颗粒涂覆有可生物降解的聚合物或共聚物；并且将所述骨诱导性混合物和所述骨传导性混合物结合，以获得一复合材料，该复合材料最初为可模塑和可成形的，并且当通过手术或牙科修复放置时，在原位硬化。一种提供具有促进伤口或软组织损伤愈合性能的骨移植材料的方法，包括以下步骤将所述骨移植材料和分散剂或溶液混合，所述分散剂或溶液基于具有至少一个含氮碱基的有机化合物和生理有效量的低糖基化重组人BSP。本发明进一步包括一种促进伤口和软组织损伤痊愈的方法，该方法包括以上所定义的生物复合材料的施用和使用。该施用和使用可包括将所述生物复合材料成型至一植入装置内，该植入装置选自组织支架、颗粒骨移植替代材料、双相骨软骨植入物、承重骨植入物、非承重以及低承重植入物或固定装置、钉、螺钉、以及薄层。本发明进一步延伸至具有使伤口愈合特性的可吸收的聚合物组合物，包括可吸收聚合物或共聚物的聚合物基质、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)以及药学上有效剂量的人 rBSP，优选地设计为缝合材料。本发明还延伸至治疗的方法，其中，在手术前或手术后将NMP 和人rBSP的溶液添加或施加至所述植入物或伤口。本发明的原理对植入物尤其有用，该植入物包括基体、由间隔套管底部或基座元件以及间隔套管顶部或环元件组成的间隔组件。所述基体具有一内部钻孔，该内部钻孔具有内螺纹。所述基体在邻近较高的边缘或末端具有一凹处，该凹处直径大于所述钻孔的直径，以提供一止动肩部。为提供可阻止轴扭的装置，所述止动肩部设有均勻地、环绕地间隔排列的下凹联锁口袋，以便可在其上用螺钉固定陶瓷牙。现在通过参考附图和实施例对本发明的技术特征和优势进行描述，其中图1是用于制备本发明所述生物复合材料的步骤的示意图。图2A-C是显示制备生物复合材料的照片，该生物复合材料含有人rBSP/NMP和涂覆有生物可吸收聚合物的β-TCP颗粒；图3A-B是手术位置以及本发明的生物复合材料在原位硬化的照片。图4A-D是放置部位的照片(患者，女，73岁)，以及术后1天、3周的照片；图4E-G是术后2. 5个月的X光照以及CT图，显示在植入和修复之前的状态。图4H-N是随伤口愈合以及骨再生之后的示例性的修复的照片。图5/01-13是术后12周，从根据本发明所放置的rhBSP/TCP-生物复合材料上取得的骨头样本(64天——长1. 2厘米)的显微镜图像——使用Masson-Goldner’ s三色染色法或甲苯胺蓝或苏木精配曙红，将厚度为2至3微米的组织切片进行染色。图6/01-13是来自另一 rhBSP/TCP-生物复合材料植入物的骨头样本(78天——长0.5厘米)的显微镜图像，该样本同样取自放置后12周——使用Masson-Goldner’ s三色染色法或甲苯胺蓝或苏木精配曙红进行制备、固定和染色。图7/01-09是第三个组织样本(59天——长0. 6厘米)的显微镜图像，取自术后 3个月的rhBSP/TCP生物复合材料——使用Masson-Goldner，s三色染色法或甲苯胺蓝或苏木精配曙红进行制备、固定和染色。本发明具体内容及优选实施方式参见图1，本发明的所述骨移植物或生物复合材料通过以下步骤获得a)将基于 β-磷酸三钙颗粒以及生物可降解聚合物或共聚物的基础材料(Α)，和b)第一组合物(B) 组合，该第一组合物(B)为含有以下组分的分散剂或溶液(i) 一种或多种具有至少一个含氮基团的有机化合物，该有机化合物首先是所述生物可降解聚合物或共聚物的塑化剂，并且其次能够和酸性蛋白质形成PKl为4. 0的盐，以及(ii)大体纯的活性人rBSP ；并与(c) 任选地，药学上可接受的赋形剂或载体混合；获得生物复合材料(C)，该生物复合材料(C) 含有由活性人rBSP、具有至少一个含氮碱基的塑化剂、生物可降解聚合物或共聚物、以及 β -TCP颗粒组成的盐，该生物复合材料为可模塑的，并且在放置之后迅速在原位硬化。正如所提到的，该可模塑的生物复合材料(C)可通过手术或牙科修复放置，并由于血液和水的作用，在放置后迅速原位硬化(D)。硬化之后，该硬化的生物复合材料(D)含有β-磷酸三钙颗粒支架，以及包埋于生物可降解聚合物或共聚物之内的活性人rBSP的盐。植入成功的关键仍在于最初的愈合过程。本发明的骨移植材料是骨诱导性的和骨传导性的，此外，还促进软组织的愈合，特别是未能被快速重新吸收的受损、患病连接组织的愈合。换言之，该骨移植材料是血管新生的，但由于已硬化的磷酸三钙支架的生物重吸收也可经调整以便与骨生成同步进行，也产生阻碍该结缔组织的纤维原细胞和细胞进入的物理屏障。因此，本发明的生物复合材料为牙科植入提供早期的物理支撑，并在为骨矿化提供内核的同时，为骨系统的细胞提供支架。此外，由于其抑制纤维单元，还促进血管生成和伤口痊愈。本发明的可模塑的生物复合材料在放置之后立即具有物理和机械性能，这是由于处于β _晶形下的磷酸三钙颗粒涂覆有可生物重吸收聚合物或共聚物，当可生物重吸收的聚合物内含有的塑化剂溶释出并进入周围体液(血液、血清、水、)中时，其迅速硬化。正如以上所提及的，根据本发明，组分(A)首先和塑化剂结合，该塑化剂用于可生物重吸收的聚合物或共聚物，以使基础材料可在放置或放置期间模塑。所述塑化剂或分散剂(B)选自具有含氮碱基的一组化合物，以使其具备类似的功能，作为酸性糖蛋白的载体和生理上的共生离子，该酸性糖蛋白例如人rBSP，其pKl为4. 0。塑化剂通过将其自身包埋于聚合物或共聚物的链之间，将这些链分隔开，以及通过“自由体积”的增长而起作用，并通过降低聚合物或共聚物的玻璃化转化点而起作用。本发明适合的塑化剂和生理共生离子为N，N- 二乙基-1，4- 丁二胺、1- (2-氨乙基)-哌嗪、2- (1-吡咯烷基)乙基-胺、4-氨基-2-甲氧基-嘧啶、2- 二甲基氨基乙醇、1 - (2-羟乙基)-哌嗪、4- (2-羟乙基)-吗啉、 2-巯基嘧啶、2-巯基苯并咪唑、特别优选为N，N- 二甲基-1，3-丙二胺、4-(2_氨乙基)-吡啶、2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑、4-(氨乙基)吡啶、N，N-二烯丙基三聚氰胺、3-氨基-1， 2，4-三唑、1- (3-氨丙基)-咪唑、4- (2-羟乙基)-吡啶、1- (2-羟乙基)-咪唑、3-巯基-1， 2,4-三唑。适合的化合物特性为具有2至14的pKa值，优选为5至14的pKa值，最优选为5至12的pKa值的非反应性基团。所述pKa值可从表格中获得。以上所给出的极限值指的是在25°C测得的pKa值。最优选使用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP = CAS号872-50_4 ； N-甲基吡咯烷酮、1-甲基吡咯烷酮、N-甲基_ α -吡咯烷酮、1-甲基氮杂环戊烷-2-酮、N-甲基-Y - 丁内酯)，其已知为可促进体外的成骨细胞成熟，也可促进体内的骨再生(Miguel 等，2006，Europ. Cells & Materials，11，Suppl. 2 :5)。然而该活动的潜在生物机制仍未可知。本发明的生物可吸收的及生物相容的聚合物优选为聚(丙交酯-co-乙交酯)PLGA 或聚(乳酸-co-羟基乙酸)的酸性共聚物。通过将羟基乙酸和乳酸的环状二聚物(1，4_ 二氧六环-2，5-二酮)开环共聚化的方式，合成PLGA。在聚合反应期间，连续的羟基乙酸或乳酸单体通过酯键连接，产生一直链、脂肪族聚酯的产物。所获得的PLGA的不同类型，取决于用于聚合反应的丙交酯和乙交酯的比例。最优选为PLGA 75 25，其定义是由75%乳酸和 25 %羟基乙酸组成的共聚物。PLGA玻璃化转化点在40°C至60°C的范围内，其同样取决于所用塑化剂或NMP的量。与乳酸(聚丙交酯)以及羟基乙酸(聚乙交酯)的均聚物不同， PLGA通过例如四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯的溶液溶解，并因此可轻易涂覆于特定的材料，例如β-磷酸三钙颗粒之上。在有水存在时，PLGA通过其酯键水解而降解，以产生乳酸单体和羟基乙酸单体，这些单体可进入体内的各个代谢途径，以使PLGA在生物材料应用中不具有系统毒性。PLGA降解所需的时间部分取决于单体的比例。PLGA 50 50可于约两个月内在体内迅速降解，而端基带有酯基的聚合物具有较长的降解半衰期。已经使用由碳-14和氚标记的聚合物制成的植入物，频繁地在大鼠和其他哺乳动物中，对乳酸(PLA)、羟基乙酸(PGA)的纯聚合物之间的降解速率的差异，以及这两种物质的共聚物的各种比例进行研究。从植入的区域、来自肝、脾、肾、肺的组织以及当然从实验中每隔一段时间就收集的尿液和排泄物中所存在的放射性，来计算不同聚合物和共聚物的半衰期。聚合物和共聚物的半衰期在100% PGA时为5 个月，在50 50PGA PLA时，减少为一周，并在100% PLA时迅速增加至6. 1个月。在软组织或骨中未观察到降解的速率有任何差异。尿、排泄物、或其他组织样品中未检测出任何强放射性。从这些研究可见，可得出这样的结论通过将PLA和PGA的组成在75%至100% 的PLA，伴随相应的25%至0%的PGA之间改变，可最佳地控制植入物的降解速率。这将为植入物提供2周至6个月的半衰期。因此，最优选为这些生物可降解聚合物。另一种生物吸收性聚酯为聚己内酯，其由于降解速度比PLGA的降解速度更慢，可用于长期可植入装置。聚己内酯(商品名ReSil0nTM)已被研究作为用于组织修复的支架， 以及用于根管填充的牙科修复中。通常，所述生物可降解聚合物可选自聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚羟基丁酯、聚羟基戊酯、聚二氧环己酮、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚原酸碳酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、聚(羟基丁二酸)、聚(顺丁烯二酸酐)、多肽、聚缩酚酸肽、聚乙烯醇、聚酰胺酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨酯、 聚磷腈、聚氰基丙烯酸酯、聚富马酸酯、聚(氨基酸)、改性多糖、改性蛋白以及它们的共聚物、三元共聚物或以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。所述聚合物基质优选地选自聚乙交酯、聚(L-丙交酯-co-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-co-乙交酯)、聚(L-丙交酯)、 聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯-co-D，L-丙交酯)、聚己内酯、聚(L-丙交酯-co-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-co-己内酯)、聚三亚甲基碳酸酯、聚(L-丙交酯-co-三亚甲基碳酸酯)、聚(D，L-丙交酯-co-三亚甲基碳酸酯)、聚对二氧环己酮及其共聚物、三元共聚物或以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。本发明的骨传导性结构组分优选为磷酸三钙(TCP)。如果TCP支架降解得太快， 纤维单元会在未完成骨修复的情况下穿过开口。如果支架内的孔或路径太少，骨再生会非常缓慢。TCP的纯度对骨形成和生物相容性都会造成影响，β晶形的TCP (β-TCP)最优选作为支架。鉴于所述支架可允许主成骨细胞和间充质细胞的进入，优选平均孔径为约200 至400微米，并且这些孔通过100至200微米的路径相互连接。然而，多孔β "TCP具有较弱的机械特性，并在体内迅速降解。这在一定程度上意味着弱的机械特性。因此，本发明的 β-TCP优选为在可获得纯相晶形的温度烧结，以避免太快降解。因此，根据本发明，所述支架优选为细小的纯相β-TCP颗粒，其涂覆有生物可降解聚合物，并形成为可与约100 至5000微米的涂覆有聚合物的TCP颗粒更好地连接，优选为200至700微米，以便填充较小的骨头空腔，并优选为500至1500微米，以便填充较大的骨头空腔，例如切除后的空腔。 非常大的涂覆有聚合物的β-TCP颗粒可用作骨传导性支架，该骨传导性支架用于在整形外科和改良手术中较大的骨置换。通过将活性人rBSP和包埋于所述生物可吸收聚合物内的塑化剂混合，该生物可吸收聚合物上涂覆在β -TCP支架颗粒上，所述活性人rBSP被整合入仿骨材料，其中，即使在硬化之后，活性人rBSP仍可在骨传导性环境中表现出其骨诱导活性。由于所用活性人 rBSP优选为低糖基化的，并包埋于聚合物或共聚物中，其可通过补体因子H进一步避免失活，并形成骨矿化内核。所述人rBSP通过塑化剂进一步包埋于生物可吸收性聚合物和/ 或共聚物中，并因此随着生物可吸收性聚合物或共聚物的生物再吸收而释放。总而言之， 人rBSP的长期活性可通过以下方式获得(i)具有含氮碱基的生理笼形包合物或复合盐的形成；(ii)通过其物理掺入在所述生物可吸收性聚合物或共聚物中，使其远离成熟前的矿化，并结合至补体因子H;和(iii)通过低糖基化作用成为低糖基化人rBSP，与完全糖基化的来自常规骨细胞的人BSP相比，被补体因子H导致失活的效率更低。因此，所述重组人 rBSP应当从在无血清培养基中培养的细胞中获得。尽管如此，所述人rBSP仍然是骨矿化和磷酸钙沉淀的体内的核。因此，本发明包括一种移植组合物，其含有用于修复受损骨以及结缔组织的人rBSP。如导言中所提到的，与骨钙蛋白和骨粘连蛋白相比，人骨涎蛋白是骨细胞外基质中主要的非胶原蛋白。进一步设想，通过连接蛋白和连接蛋白标记，将所述骨活性rBSP连接至所述支架或聚合物-支柱。然而，人BSP不含有半胱氨酸残基。人BSP具有高的负电荷度(Pi = 4. 0)，以便最初使强离子交换HPLC应用至分离出的BSP复合物。塑化剂的碱基可从而产生类似的结合效应。然而发明人不希望受任何理论之限制，注意到，本发明组合物中的酸性人rBSP具有骨诱导性和生物矿化效应，并提高成骨细胞向骨移植材料的粘附和趋化性迁移。我们的研究发现支持，人rBSP和碱性塑化剂的笼形包合物或复合盐在包含于生物可降解聚合物或共聚物中，并任选地具有支撑体或赋形剂时，具有协同活性，尤其是在软组织和伤口愈合方面。每种组分都具有生物活性，而结合则产生协同有效的血管再生和骨诱导效应。所提供的格林形式是基于生物可降解聚合物和矿物支撑颗粒的混合物，其能够很容易就在手术部位施用，其中，血管生成和骨生成活性在一限定的共同顺序中都是必需的。有充足的证据表明，人rBSP不仅仅有助于伤口愈合和骨生成。它也在牙科手术过程中抑制炎症和种植体周围炎。本发明的生物复合材料中的手术TCP支架最终提供了与纤维连接及内皮植入相对的临时机械屏障，以便手术生物复合材料和人rBSP能完全产生其骨诱导效应并促进骨再生。 在该连接中，需要所述生物可降解聚合物，以便包埋人rBSP，并以活性形式缓慢释放。在体内，BSP的表达与初始骨骼矿化相一致，且当BSP涂覆于股骨植入物时，显示 BSP为骨诱导性的(OToole GC等，2004，J Orth Res 22:641-646.)。同样的效应也已报道发生在骨生成蛋白0P-1、BMP-7、各种其他非胶原骨基质蛋白、纤维原细胞生长因子(FGF)、 转化生长因子-β (TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子(IGF)及以上所述的家族成员。然而，由于这些生物活性分子的骨整合活性既不能在体外测量，也不能在体内测量，所以它们的骨活性仅仅是一种推测。然而，本发明的生物复合材料能够被直接放置，并在提取部位，或者在需要骨再生和软组织痊愈的位置硬化。在提取量较小的情况下，半硬化的生物复合材料可在周围齿龈的水平进行切割，以便获得光滑的表面，其在软组织和骨移植材料之间仅具有一最小间隙； 参见图4A-C。当所述软组织连接至所述骨移植材料时，所述骨移植材料随后在一天或两天之内痊愈(见图4D)。最终，齿龈内的龈瓣可更小，并且整个手术对患者的负担更轻。如果有更小的牙科植入物，甚至不需要植入位点上缝合齿龈；见图4C。随着破骨细胞和成骨细胞对骨基质的吸附，在内皮细胞的粘附、传播和定位中，以及血管形成中进一步涉及BSP (Bellahcene等，2000, Circ. Res. 86 (8)，885-91)。然而，在植入位点的纤维连接或内皮植入都不是想要得到的，其中，需要附加的骨以便对骨内植入物的物理支撑。根据本发明，这通过在生物复合材料内的β-TCP颗粒来实现。然而，所述人 rBSP抑制炎症反应并调节所涉及的蛋白质的释放，例如白介素IL-6、IL_8、RANKL、骨保护素等等。本发明提供了一种新颖的骨移植物和复合材料，其促进间充质干细胞分化为成骨细胞、诱导成骨细胞迁移至所需骨再生的部位和成骨细胞增殖、并最终为骨矿化提供内核。 许多蛋白质都已经因其骨生成特性而得到研究，尤其是胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和天然胞外基质蛋白的混合物(Sodek 等，J，2000，Peridontol. ,24 :99_126 ；Meyer U 等，1998，J Mater Sci-Mater Med 9 301-307 ；Lacouture M^, 2002, J Bone Miner. Res 17 481-492 ； SalihE等，2002，Biochem J. 364 :465_474)。通过对I型胶原蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白在支撑机械应变的成骨细胞的粘附方面的比较，显示当可获得的用于连接的分子数目有限时，调节抗变阻力的主要因素是胞外整合蛋白基质连接的数目(Lacouture ME等，2002 J Bone Miner Res 17:481-49220)。因此，可预计本发明的生物复合材料中也加入有这些蛋白。现有技术中，在初步愈合过程中没有任何方式可获得生理上的改进(Lekic P等， 1996, Anat Rec 244:50-58)。这是因为仿生移植材料的大表面积会导致延迟的细胞增殖。另外也没有任何可用于BSP施用的方法或组合物，以便其能在体内发挥其生物功能， 并且不会由于补体因子H或矿化作用而失活，而BSP在体内沉积代表了骨形成的第一步 (Riminucci M 等，2003，Braz J Med Biol Res 36:1027-1036)。此外，发现 BSP 在骨修复中是骨诱导性的，并可完成严重缺陷的愈合(Wang ML等，2002，J Orth Res 20:1175-1184; Wang J等，2004 J Bone Miner. Res. 19 :221摘要)。因此，已经通过诱导剂进行努力以诱导BSP的表达(Chou等，2005，Biomaterials 26 =285-29529)。然而，结果表明这些努力并不太成功。可以推断，BSP进行着某种细胞外熟化，这会减少其在间充质干细胞和成骨细胞上可能的分化和增殖。一些研究组织甚至已经设想BSP保护滋养层和BSP产生的肿瘤细胞不受免疫系统的攻击，由于BSP与高吸附性的补体系统的因子H结合，该因子H已知可限制补体溶解的替代路径(Fedarko et al.，J. Biol. Chem. , 200, 275,16666-16672 ；WO 00/062065)。然而，已证实BSP在体内通过其识别序列精氨酸-甘氨酸_天门冬氨酸，特定结合至整合蛋白受体。RGD识别序列结合至α (ν) β (3)整合蛋白受体，并且由于观察到内皮细胞的粘着、传播和定向都由BSP介导，BSP在骨基质形成以及伤口愈合过程中处于核心的位置。此外，肿瘤周围的血管形成与肿瘤细胞中的BSP表达同时进行(Bellahcene等， 2000，Circ. Res. 86(8) :885ff)。然而，“自由的” BSP被高亲和力的补体因子H所束缚，令现有技术组合物的任何施用的BSP不能发挥其生理功能。150kDa的大因子H分子使较小的BSP(ca.65kDa)束缚至抗体或受体不能够结合的程度。此外，因子H在血清中过量(每毫升0. 5毫克因子H，相比之下，健康人血清每毫升中含少于20纳克的BSP)。然而，我们的数据表明，低浓度的低糖基化人rBSP足以诱导间充质干细胞的分化和成骨细胞的初步连接。这通过将低糖基化人rBSP整合进生物可降解聚合物中来达到目的，这使骨细胞的分化和沉降不再受大表面或外来材料的阻碍。然而，本发明的低糖基化人 rBSP仍是强酸性的，并与羟基以及磷酸钙反应并使反应加快。通过将低糖基化人rBSP涂层溶解在一碱性溶液和用于生物可吸收聚合物的塑化剂中，BSP蛋白似乎保持在一个能够发挥较长的生物学功能的状态。最优选地，低糖基化人rBSP被掺入由β-TCP颗粒制成的支架，其孔优选为直径10至1000微米，更优选为20至500微米，最优选为50至200微米。 换言之，当成骨细胞连接至该移植材料的孔内并实际上在孔内生长时，可达到骨移植物矿化的或似骨的骨整合。因此，孔的直径应当优选为10至1000微米，更优选为20至500微米，最优选为50至200微米。本发明的组合物中优选含有所述低糖基化人rBSP的浓度为 1至100微克/毫升，更优选为10至50微克/毫升。以下所描述的本发明的例子和实施方式不应被视为对本发明的限制或其他约束， 而只是本质上的示例性的。本发明的保护范围已在所附权利要求中所确定。
具体实施例本实验所使用的所有程序均由道德委员会同意，并遵守赫尔辛基1964声明(NIH